通过重组多型汉逊酵母以组成型方式高效表达和生产t4溶菌酶的方法

专利名称：：通过重组多型汉逊酵母以组成型方式高效表达和生产t4溶菌酶的方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种通过重组多型汉逊酵母以组成型方式高效表达和生产T4溶菌酶的方法。
背景技术：
：溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.17)是指一类广泛存在于自然界中且对多种革兰氏阳性和阴性病原细菌、真菌以及某些病毒具有杀灭或抑制作用的蛋白水解酶，1922年由英国细菌学家Fleming首次发现。溶菌酶的主要杀菌方式是破坏细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β_1，4糖苷键，造成细胞壁破裂和内溶物渗出从而导致细菌崩溃和死亡，因此，溶菌酶又被称N-乙酰胞壁酸酶。在自然界中，溶菌酶的来源十分广泛，可分为动物、植物和微生物来源的溶菌酶。动物来源的溶菌酶一般存在于人或哺乳动物的多种组织和分泌物中，如存在于眼泪、唾液、肝、肾、淋巴组织以及蛋清等。木瓜、芜菁和萝卜等植物中也能分离到溶菌酶，它们被认为在生物肌体的第一道防御屏障中起重要作用。目前已在多种微生物的体内都发现有溶菌酶的存在，如在球孢链霉菌、丙酮丁酸梭菌以及多种侵染细菌的噬菌体等体内。Τ4溶菌酶来源于侵染大肠杆菌的Τ4噬菌体，它是由Τ4噬菌体gpe基因所编码(ArisakaF，etal.，2003)，基因全长为495个碱基，可编码164个氨基酸，分子量18700Da。当噬菌体颗粒在宿主细胞内包装完成后，在T4溶菌酶的作用下导致宿主_大肠杆菌细胞裂解并释放出完整的噬菌体颗粒。迄今为止，T4溶菌酶已经有30多年的研究历史，该酶及其多种突变体的晶体结构已经得到解析。一般认为，T4溶菌酶由两个结构域所组成位于蛋白N端的α/β结构域和位于C端的α螺旋结构域。研究发现，Τ4溶菌酶的杀菌作用主要表现在两个方面一是该酶具有N-乙酰胞壁酸酶活性；二是位于该酶C端带正电荷的α螺旋域能够与某些细菌或真菌带负电荷的细胞膜结合并干扰宿主细胞的正常生理代谢，从而起到杀菌作用。位于Τ4溶菌酶蛋白C端的α螺旋结构域主要有4个，分别是α1(115-122)、α2(126-134)、α3(137-141)和α4(143-155)。人工合成的α2、α3或α4短肽虽然没有N-乙酰胞壁酸酶活性，但仍表现出抗细菌或真菌的生物活性。同样，将Τ4溶菌酶加热变性后，发现虽然其N-乙酰胞壁酸酶生物活性完全丧失，但它仍保留着较强的杀菌能力。研究显示，对Τ4溶菌酶蛋白结构进行改造和修饰能够提高其杀菌活性或热稳定性，例如，蛋白N端带有6组氨酸标签结构(6xHiS-Tag)的T4溶菌酶的杀菌活性为天然T4溶菌酶的2倍；而将N端第6位氨基酸残基由疏水的甲硫氨酸(M)变成带正电的赖氨酸(K)后，抗菌活性可提高4倍，但蛋白分子的稳定性下降，推测其杀菌活性的提高可能是由于蛋白C端的自由度增强，从而使α螺旋结构域能暴露在外以致于能更有效地与细胞膜靶标结合。Τ4溶菌酶除了能够杀灭细菌外，对某些病原真菌也同样具有抑制作用。虽然它不能穿过真菌分生孢子的细胞膜，但经该酶处理后的分生孢子不再膨大和发芽。Τ4溶菌酶对土豆原生质体膜也具有一定的破坏作用，但它对人和哺乳动物的细胞无毒害作用，因此，Τ4溶菌酶在医药、食品和饲料等领域都具有极大的应用潜力。从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中提取T4溶菌酶，不仅生产工艺繁琐，产量低，而且难以工业化。近几年来，随着人们对汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)生物学特性研究的逐渐深入，其作为外源基因表达系统的优势也逐渐显现。汉逊酵母属于真菌门-子囊菌亚门_半子囊菌纲-内孢霉目-酵母科_酵母菌亚科，也是一种甲醇营养型酵母。目前已知的甲醇营养型酵母共有15个种，分属于假丝酵母、汉逊酵母、毕赤酵母和球拟酵母等，它们都能够在以甲醇为唯一碳源的培养基上生长。汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种(LodeboerA.M.，etal.,1985)一种是在过氧化物酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanoloxidase，Μ0Χ)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再经甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase，FMD)作用下生成CO2,H2O2在过氧化氢酶(catalase，CAT)的作用下生成H2O和O2；甲醇的另一个代谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖类，其中二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetonesynthase,DHAS)是这一过程的关键酶。甲醇代谢过程中的各种关键酶，包括M0X、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0.时，阻遏作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80%，MOX和DHAS可占细胞总蛋白的15%，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表达的常用启动子。诱导型启动子以其强启动功能和严紧的调控机制被广泛的应用于外源基因的表达，已有很多外源蛋白在这些启动子的调控下在汉逊酵母细胞中得到高效的表达。目前用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的诱导型启动子都需要在一定剂量甲醇存在的条件下才能发挥作用，但由于甲醇是有毒物质，且易燃易爆，这样就限制了该系统在医药或食品等领域的应用。因此，各种组成型启动子就应运而生，已经成功应用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的组成型启动子有质膜ATPase启动子(pPMAl)和翻译延伸因子Ia启动子(TEFl)等，这些组成型启动子的应用不仅无需在发酵培养基中加入甲醇，而且也简化了发酵工艺和降低了成本等。汉逊酵母作为外源蛋白表达宿主多采用营养缺陷型菌株来进行重组子的初步筛选，目前已得到多种营养缺陷型菌株，如亮氨酸缺陷型、甲硫氨酸缺陷型和酪氨酸缺陷型等(SeonAhCheon,etal.，2009)。同时，由于汉逊酵母对氨基糖苷类抗生素敏感，G418、Zeocin和潮霉素B等抗生素抗性基因也被广泛地用作筛选标记。以汉逊酵母作为外源基因的表达宿主时，外源DNA整合到酵母基因组中主要可分为随机整合和同源重组，其中同源重组需要导入的DNA中必须含有汉逊酵母的同源序列。同源序列与酵母基因组中某段DNA序列完全或部分一致，从而导致外源DNA在此位置可通过同源交换整合到酵母基因组中。汉逊酵母转化常用的同源序列包括各种强启动子和rDNA(KlabundeJ.,etal.,2003)序列，而本发明首次采用了汉逊酵母质膜ATPase基因作为同源整合序列。真菌质膜ATPase是上世纪70年代末首次在粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)中被发现的，随后分别从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)中得到提纯。质膜ATPase是酵母质膜中含量最多的蛋白，占总质膜蛋白的15%，占总细胞蛋白的0.3%，它的主要作用是作为一个跨膜的质子泵，维持细胞内的PH值和电化学梯度，从而使多种营养物质得以运输。汉逊酵母质膜ATPase(HelenCox,2000)基因全长2697bp，编码898个氨基酸。本发明中首次将其插入到汉逊酵母表达载体中作为外源基因整合的同源序列。作为外源基因的表达宿主，汉逊酵母具有其它表达系统难以比拟的优点1)汉逊酵母属于真核微生物，能够对外源的重组蛋白进行翻译后加工和修饰，包括二硫键的生成和糖基化等；2)对于细胞内表达的重组外源蛋白，可以将其定位到过氧化物酶体中，防止胞内蛋白酶的降解以及某些重组蛋白对宿主细胞的伤害；3)对于细胞外表达的重组蛋白，宿主自身分泌蛋白少，易于重组蛋白的分离纯化；4)汉逊酵母培养成本低，可在无机盐中进行高密度发酵；5)菌体和代谢产物对人体或哺乳动物无毒害作用等。除了上述优点外，汉逊酵母还具备另外一些独特的优势，如1)汉逊酵母的最适生长温度在3743°C，菌体生长速度快，发酵时间短；2)以rDNA作为整合的同源序列，可以获得高拷贝的转化子，有可能极大地提高外源重组蛋白的表达量；3)多个外源基因能够通过一步法同时被整合到酵母基因组中，并按照一定剂量关系同时或分别表达。上述优点使汉逊酵母表达系统迅速发展成为最具魅力的真核表达系统之一，目前，已经有多种外源蛋白基因在汉逊酵母中获得了表达，见表1表1在汉逊酵母中表达的部分外源蛋白<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*BFSHα为Bovinefollicle-stimulationhomoneα亚基ScCnel为Sacchromycescerevisiaecalnexin在本发明之前，还没有采用密码子优化后的T4溶菌酶基因在汉逊酵母中以组成型方式表达该蛋白的的报道，没有人使用汉逊酵母质膜ATPase基因作为同源序列将Τ4溶菌酶基因整合到汉逊酵母基因组内的报道，也没有人在汉逊酵母中进行Τ4溶菌酶重组蛋白的高密度发酵生产。本发明首次按照酵母所偏爱的密码子，人工合成了一个完整的Τ4溶菌酶基因，克隆了毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子以及汉逊酵母菌株A16的质膜ATPase基因，并利用上述元件，构建了一个全新的、组成型的和分泌型的汉逊酵母高效表达载体，在将该外源基因导入汉逊酵母细胞后，通过抗性筛选、活性检测等方法，获得了能够高效表达T4溶菌酶的重组酵母工程菌株，再经高密度发酵、重组蛋白纯化等一系列操作，最终制备的重组T4溶菌酶蛋白纯品具生物活性，可广泛应用于医疗、食品、饲料以及科研等领域。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种密码子得到优化的T4溶菌酶基因，其能够在汉逊酵母细胞中得到稳定地高效表达。本发明的第二个目的是提供一种通过毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控使T4溶菌酶基因以组成型的方式在汉逊酵母中得到高效表达的方法。本发明的第三个目的是通过使用一个同源序列，使携带有T4溶菌酶外源基因、启动子序列以及筛选标记等重要表达元件的质粒载体能够被整合到汉逊酵母基因组中。本发明的第四个目的是提供最适的重组汉逊酵母生长和表达条件以及目标蛋白快速的纯化方法。为达到上述目的，本发明的技术方案首先提供一种编码T4溶菌酶蛋白的基因，其是按照酵母偏爱的密码子优化过的、编码或至少部分编码T4溶菌酶蛋白的基因。所述的T4溶菌酶蛋白一级结构为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。在本发明的一个优选实施方式中，所述T4溶菌酶蛋白基因具有或至少部分具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。然后所述T4溶菌酶蛋白基因被置于一个毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子操纵之下，在整合到汉逊酵母基因组中后，随着重组酵母菌体的生长，T4溶菌酶外源基因能够以组成型方式得到高效表达。进一步地，汉逊酵母菌株的质膜ATPase基因PMAl被克隆出来并被插入到一个上述的酵母表达质粒载体中，借助PMAl基因发生的同源重组，可将受毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控的T4溶菌酶基因及其它重要的表达元件同时整合到汉逊酵母基因组中，而得到的重组汉逊酵母菌株能够稳定地高效表达T4溶菌酶重组蛋白并将其分泌到胞外。更进一步地，在构建高效表达载体时，采用的起始载体为PPIC9K，其多克隆位点前含有α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列，在与外源基因融合表达后，可引导外源重组蛋白向酵母细胞外分泌。这时，可在Τ4溶菌酶外源基因的5’端前添加酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA，使外源重组蛋白在分泌到胞外时，α-因子分泌信号肽可以被酵母Kex2基因表达产物切割下来，从而不改变重组蛋白的N端序列。这样，本发明一个优选的实施方式就是首先是编码T4溶菌酶的基因被按照酵母所偏爱的密码子进行优化并人工合成出来，然后，该基因被插入到一个带有α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列的酵母表达载体上以便再形成一个新的融合蛋白基因。α-因子分泌信号肽的作用是操纵外源的重组Τ4溶菌酶向汉逊酵母胞外的分泌。在该质粒载体上，还含有一个组成型启动子，该启动子位于α-因子分泌信号肽与Τ4溶菌酶所形成的融合基因的上游，它操纵融合基因在汉逊酵母细胞中的高效表达。同时，该质粒载体中还含有汉逊酵母质膜ATPase基因，它在质粒载体整合到酵母基因组内的过程中上起到了同源序列的作用。该载体经线性化处理后，可通过电融合或氯化锂等方法被导入到汉逊酵母细胞中，进而通过同源重组稳定整合到酵母染色体基因组内，此重组酵母在发酵培养过程中表达的T4溶菌酶重组蛋白在α-因子分泌信号肽的引导下得以分泌到胞外的培养基中。利用发酵液上清进行抑菌实验，证明该重组蛋白具有与天然多肽相类似的抑菌活性。本发明还提供了上述重组汉逊酵母的最适的生长培养条件和外源蛋白表达条件，如培养基的成分、接种量、PH值、溶氧量和培养时间等，由此使该重组酵母工程菌的生长量和重组蛋白的分泌量都尽可能地达到最大化。通过离心除菌、纳滤、离子交换层析等操作从发酵液中得到高纯度的外源重组蛋白，以便为这种重组酵母的工业化生产、低成本发酵和纯化奠定基础。本发明利用汉逊酵母表达系统表达和生产Τ4溶菌酶重组蛋白，如果将其经过部分或完全纯化，因其具有较强的抗菌活性和广泛的抗菌谱故其有可能被应用于医疗、食品、饲料和科研等领域。例如，在动物饲料领域，本发明的Τ4溶菌酶重组蛋白作为饲料添加剂可以延长饲料的保质期，或预防和治疗某些家畜的消化道细菌传染性疾病等。本发明所指的重组蛋白可以是Τ4溶菌酶蛋白的全部，然而，在某些具体实施方案中，所表达的外源基因也可能只是该天然蛋白的一部分。有时，Τ4溶菌酶重组蛋白可与另外一个具有不同生物学功能的蛋白基因以独立或融合方式同时在一个酵母细胞内表达，目的是为了方便提纯或提高其生物活性。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译表达前就相互拼接在一起，而这两种技术是本领域技术人员早已熟知的技术。发酵产品中Τ4溶菌酶重组蛋白的纯度直接关系到该重组蛋白的应用范围及所生产相关产品成本的高低，按照一个优选的实施方案，为了快速纯化大量的Τ4溶菌酶重组蛋白，可以首先将酵母发酵液上清液使用不同截流分子量的过滤装置进行预处理，然后再通过离子交换层析，在纯化过程中的每一个环节，都可使用SDS-PAGE电泳进行检测，通过上述方法可获得纯度达到99%的Τ4溶菌酶重组蛋白。本发明还提供了经过优化的重组汉逊酵母培养生长条件以及Τ4溶菌酶重组蛋白的快速纯化方法，它包括以下三个阶段1)菌体培养阶段，以10%的接种量接种酵母工程菌，经过2430小时的培养，酵母菌体湿重将达到95100g/L左右；2)碳源饲喂和蛋白表达阶段，在培养2496小时后，酵母菌体的湿重将达到180190g/L左右，在此培养过程中不断补加碳源，并维持一定的PH值和溶氧量，使菌体高密度发酵，在酵母菌体生长的同时，重组T4溶菌酶蛋白得到高效表达；3)蛋白纯化，发酵液经过离心和三次不同规格的滤膜过滤处理，最后再经过一次阳离子交换层析处理，T4溶菌酶重组蛋白的纯度可达99%以上。按照一个具体的实施方案，优化的重组汉逊酵母工程菌株发酵生产重组蛋白的方法，包括(1)菌体培养在基础发酵培养基中发酵，接种前先加入适量氨水，使该培养基的PH值维持在5.56.0左右，然后在每升基础发酵培养基中加入4.37mL微量盐溶液PTMl；按体积比910%的比例接种种子液，3637°C、375380转/分通气搅拌培养2430小时左右；(2)饲喂碳源和蛋白表达流加补料液，补料液为含有12mLPTMl/L的50%甘油，流加量为1718mL/L/天，3637°C、375380转/分通气搅拌培养7296个小时，过程中使溶氧量始终大于20%，温度维持在3637°C，pH维持在5.56.0左右；在上述过程中用到的培养基及试剂配方为基础发酵培养基=IOXBasalSalts+4%甘油；PTMl0.6wt%硫酸铜，0.008wt%碘化钠，0.3wt%硫酸锰，0.02wt%钼酸钠，0.002wt%硼酸，0.05丨％氯化钴，2丨％氯化锌，6.5wt%硫酸亚铁，0.025丨％生物素，0.5wt%硫酸。本发明在详细介绍酵母表达系统时仅提到了汉逊酵母A16菌株，然而，正如本领域专家所早已熟知的酵母表达系统那样，许多种汉逊酵母表达系统都可以利用本发明所提供的方法进行遗传转化、表达和生产。因此，所有这些汉逊酵母表达系统都应包括在本发明的权利要求范围之内。就像下面实例中所要详细描述的那样，本发明描述的酵母转化方法中所用的质粒载体是一个整合型的质粒表达系统，按照一个优先的实施方案，本发明所使用的质粒表达载体是一个得到改造后的PPIC9K，其原先的AOXl诱导型启动子被毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成型启动子所取代，同时质粒表达载体中还包含有用于外源基因整合到酵母基因组内的同源序列，该序列可以是PMAl或其他同源序列。采用本发明所述方法，可有效地将密码子优化后的T4溶菌酶外源基因通过PMAl基因序列以同源重组的方式整合到汉逊酵母基因组中，获得的酵母工程菌株能够以组成型方式稳定和高效地表达T4溶菌酶重组蛋白，同时提供了该重组蛋白的发酵和纯化工艺，适用于规模化生产T4溶菌酶蛋白。图1为T4溶菌酶基因密码子优化和改造前后对比，N代表密码子优化和改造前的基因序列；M代表密码子优化和改造后的基因序列；图2为组成型酵母高效表达载体mT4-ATP-GPIC9K的构建过程；图3为光吸收法测定重组T4溶菌酶的溶菌活性纵坐标为OD35tlIim光吸收值，横坐标为发酵工程菌上清液浓缩倍数，18为浓缩18倍；ATP-GPIC9K为阴性对照，T4为工程菌发酵上清液；图4为SDS-PAGE电泳检测T4溶菌酶重组蛋白表达情况M为标准分子量蛋白(BluePlusProteinmarker1294KDa，北京TransGenBiotech公司产品)；CK-为阴性对照，GPIC9K转化的重组酵母菌株培养72小时发酵液上清；16分别为HP-T4培养24、48、72、96、120和144小时发酵上清液;图5为SDS-PAGE电泳检测纯化后的T4溶菌酶重组蛋白多肽1为经过脱盐-分子筛_离子交换层析_冻干等操作所获得的重组蛋白纯品；2为蛋白标准分子量(北京TransGenBiotech公司产品)。具体实施例方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1密码子优化后的T4溶菌酶基因的人工合成T4溶菌酶基因来源于T4噬菌体，其密码子与原核生物较接近，而汉逊酵母属于真核生物，故它们在基因密码子偏好方面存在着一定的差异，而这种差异很可能会影响到T4溶菌酶基因及其转录产物在汉逊酵母细胞中的稳定性和表达效率。为提高T4溶菌酶的生物产量，根据业已公布的T4溶菌酶基因的DNA序列和氨基酸序列(GenBank，登录号NY000866)，在不改变其氨基酸序列的前提下(见SEQIDN0.1)，按照酵母所偏爱的密码子(SharpPM,etal.，1986)，人工设计和合成了新的T4溶菌酶成熟蛋白的DNA编码序列，密码子优化和改造后的Τ4溶菌酶基因与改造前相比，改变了其中的138个核苷酸碱基，总共涉及到116个密码子，而G+C含量由原来的36.6%变为现在的49.5%，基因改造前后对比见附图1。与此同时，为了便于此后酵母表达载体的构建，在人工合成该Τ4溶菌酶核苷酸编码序列的过程中，在该基因的5’端第一个翻译起始密码子ATG前合成和添加了限制性酶切位点XhoI以及酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA；在该基因的3’端终止密码子TAA后增加了限制性酶切位点NotI(上述基因拼接和合成工作由上海博亚生物技术公司代为完成)。实施例2T4溶菌酶基因的克隆将上述人工合成的T4溶菌酶基因DNA片段直接插入到pEASY_T1(购自北京TransGenic公司)质粒中的T位点内，按照该公司所提供的方法，得到含有中间质粒载体mT4-T的细菌克隆，然后，通过DNA测序，确定其所含的T4溶菌酶基因是正确和完整的(DNA测序由北京标凯科技有限公司完成)。实施例3毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的克隆根据已知的毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列(GenBank:U62648.1)，分别合成位于启动子两端的引物F和R，其中F为5‘-ATGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC-C-3‘(划线部分为BamHI切点)(见SEQIDNO.5)，R为5‘-ATGAGCTCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGATTG-3'(划线部分为SacI切点)(见SEQIDNO.6)，以毕赤酵母基因组DNA为模板(基因组提取方法参见《分子克隆实验指南第三版》485页)，以F和R为引物，通过PCR，扩增获得甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列(GAPDH)，将扩增片段直接插入到pEASY-Tl质粒中的T位点内，按照该公司所提供的方法，得到含有中间质粒载体GAPDH-T的细菌克隆，然后，通过核苷酸测序分析，确定GAPDH是正确和完整的，见SEQIDNO.3。实施例4汉逊酵母质膜ATP酶基因的克隆根据已知的汉逊酵母质膜ATP酶基因核苷酸序列(见GeneBank:AF109913)，分别设计和合成引物primer1和primer2，其中Primerl序列为5-ATCATATGATGCTGCAACTGAACCAACCAAGGAG-3，，(见SEQIDNO.7);Primer2序列为5，-ATGCATGCTCAGTTGGACTTCTCGTGCTGAGTAGAG-3，(见SEQIDN0.8)。Primerl和primer2分别添加有NdeI(CATATG)和SphI(GCATGC)限制性内切酶切位点，用于后续的酵母表达载体的构建。以汉逊酵母基因组DNA为模板，PCR扩增汉逊酵母质膜ATP酶基因，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切割目的条带并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段，然后直接连接到pEASY-Tl质粒中的T位点内(购自TransGenic公司)，按照该公司所提供的方法，得到含有质膜ATP酶基因的细菌克隆ATP-T，然后，通过核苷酸测序分析，确定质膜ATP酶基因是正确的，见SEQIDN0.4。实施例5表达载体mT4-ATP-GPIC9K的构建用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，将连接在中间质粒载体GAPDH-T中的GAPDHDNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒PPIC9K(美国Invitrogen公司产品)，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的PPIC9K质粒DNA，然后将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到中间质粒载体GPIC9K(见附图2)，然后用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5α(购自美国GIBCO公司)以方便进行该质粒的复制和保存。用限制性内切酶NdeI和SphI进行双酶切，将连接在中间质粒载体ATP-T中的汉逊酵母质膜ATP酶基因DNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒GPIC9K，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的GPIC9K质粒DNA，然后将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到中间质粒载体ATP-GPIC9K(见附图2)，然后用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5α以方便进行该质粒的复制和保存。用限制性内切酶XhoI和NotI进行双酶切，将插入在中间质粒载体mT4-T中的T4溶菌酶基因DNA片段切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收该DNA片段。用同样的限制性内切酶处理质粒ATP-GPIC9K，通过琼脂糖凝胶电泳分离和回收线性化后的ATP-GPIC9K质粒DNA，将上述两个DNA片段混合后并用连接酶连接在一起便得到汉逊酵母表达载体mT4-ATP-GPIC9K(见附图2)，然后用上述质粒载体转化大肠杆菌细胞DH5α(购自美国GIBCO公司)以方便进行该质粒的复制和保存。质粒载体pPIC9K购自美国Invitrogen公司，它是一个酵母诱导型表达质粒载体，它含有一个高效的诱导型启动子-醇氧化酶启动子(AOXl)，在甲醇的诱导下，可调控下游插入外源基因的高效表达。在该表达载体多克隆位点前含有α-因子分泌信号肽核苷酸编码序列，在与外源基因融合表达后，可引导外源重组蛋白向酵母细胞外分泌。在分泌到胞外的过程中，该信号肽可以被酵母Kex2基因表达产物切割下来，从而不改变重组蛋白的N端序列。实施例6:mpGPIC9K质粒DNA的制备首先用碱裂解法(参见《分子克隆试验指南》)，从上述的大肠杆菌DH5α细胞中小制备提取mT4-ATP-GPIC9K质粒DNA，然后用12倍过量的限制性内切酶XbaI进行酶切，使之完全线性化，可利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。然后用酚和氯仿分别抽提上述酶切产物，乙醇沉淀，弃上清，收集沉淀，经冷冻干燥后，将沉淀重新溶解在无菌的去离子水中，-20°C保存备用。实施例7酵母细胞的遗传转化将_72°C保存的汉逊酵母菌液(菌株A16来自中国农业大学)接种到5mLYPD中(1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)，37°C震荡培养1天左右，将培养好的菌液以接种量重新接种于IOOmLYPD中，37°C震荡过夜培养(8h)至OD600=1.3-1.5，4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在40mL溶液a(50mM磷酸钾缓冲液，pH7.5,25mMDTT)中，37°C温浴15min，4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在200mL冰预冷的溶液b(270mM蔗糖，IOmMTris-HCl,pH7.5，ImMMgCl2)中，4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在IOOmL预冷的溶液b中，4000转/分离心5分钟，倒掉上清，将沉淀的酵母细胞重悬在ImL预冷的溶液b中，吸取SOuL于1.5mL离心管中，与上述线性化表达载体mT4-ATP-GPIC9K质粒DNA(45ug)充分混勻，然后转移到冰浴后的0.2cm无菌电击杯中，利用电击仪Precisi0nPUlseTM(BTX公司产品)将线性化的表达载体mT4-ATP-GPIC9K质粒DNA导入酵母感受态细胞中，使用的电击参数为电压1.5kV,电容50uF，电阻125Ω。电击完成后，立即向电击杯中加入ImL室温的YPD培养基(1%酵母提取物，2%酪蛋白胨，2%葡萄糖)，充分混勻后，37°C静置1小时，然后涂布于固体YPD培养基(液体培养基中加入了2%琼脂粉，0.2mg/mLG418)上，平板倒置于37°C恒温培养箱中23天，至转化重组子出现。实施例8高表达酵母菌株的筛选将在YPD培养基(0.2mg/mLG418)上生长的酵母单菌落(转化子)用无菌牙签逐一挑取到含有梯度G418的YPD培养基(分别含有0.5mg/mL、lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mLG418)上，平板倒置于37°C恒温培养箱中12天。随着携带有G418抗性基因的外源质粒整合到酵母基因组中的拷贝数的增加，转化子对G418的抗性增强。挑取能够在含有2mg/mLG418的YPD平板上生长的转化子，接种于IOOmLBMGY培养基[1%酵母提取物，2%酪蛋白胨，IOOmM磷酸钾缓冲液(ρΗ7·0)，1.34%ΥΝΒ，0·00004%Biotin，甘油(ν/ν)]中，37°C震荡培养4天，发酵液10000转/分离心5分钟，收集含有重组T4溶菌酶的上清液，该上清液可直接用于杀菌活性的测定。重组T4溶菌酶的溶菌活性采用紫外/可见光分光光度法。所用的溶壁微球菌(MicrococcusLysodeikticus)购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，菌种编号1.0634。将微球菌接种于500mLLB培养基中，28°C培养过夜，用0.05MTris-HCl(ρΗ7·2)洗菌体两次，重悬于IOmL相同缓冲液中，冷冻干燥。冻干菌用相同缓冲液配制成0.5g/L的悬浮液作为底物。将0.ImL待测酶液加入0.9mL底物溶液中，37°C静置1小时，测定OD35tl光吸收值，检测结果见附图3。从附图3可知，经表达载体mT4-ATP_GPIC9K转化所获得的重组酵母菌株培养上清液能够使溶壁微球菌冻干菌悬液变澄清，随着发酵上清液浓缩倍数的增加，其吸光度逐渐降低，这表明重组T4溶菌酶是具有溶菌活性的。而阴性对照(转ATP-GPIC9K空质粒表达载体的汉逊酵母培养上清液)随着浓缩倍数的提高其光吸收值没有产生任何显著的变化。随机挑取10株能够在2mg/mLG418的YPD平板上生长的转化子，发酵培养，取发酵液上清进行抑菌活性测定。测定结果发现所有能够在2mg/mLG418的YPD平板上生长的转化子都具有抑菌活性，并且抑菌活性强弱差别不明显。从中随机挑选出一株作为工程菌加以保存，并将其命名为HP-T4。实施例9重组酵母菌的高密度发酵1、种子液的制备挑取单菌落，将重组酵母菌株HP-T4接种于IOmLBMGY培养基中，37°C震荡培养过夜，以10%的接种量转接于IOOmLBMGY培养基，37°C震荡培养过夜，再以10%的接种量转接于ILBMGY培养基，28°C震荡培养过夜，将其转接到4LBMGY培养基中，37°C震荡培养2天，作为高密度发酵的种子液。2、重组酵母在50L发酵罐中的高密度发酵本发酵过程可以分为以下两个阶段1)菌体培养阶段在50L发酵罐(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司)中盛放了30L基础发酵培养基(IOXBasalSalts2.67%磷酸、0.093%硫酸钙、1.82%硫酸钾、1.49%硫酸镁、0.413%氢氧化钾+4%甘油)，在接种前先加入氨水使该培养基的PH值维持在5.56.0左右(氨水同时也可作为酵母菌体生长的氮源)，再按照下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4.37mL微量盐溶液PTMl(0.6%硫酸铜，0.008%碘化钠,0.3%硫酸锰，0.02%钼酸钠，0.002%硼酸，0.05%氯化钴，2%氯化锌，6.5%硫酸亚铁，0.025%生物素，0.5%硫酸)。按910%的比例接种此前制备好的种子液，3637°C通气搅拌(转速自始至终维持在375380转/分)培养2430小时左右。在该阶段的进行过程中，随着酵母菌体的生长，培养基中的溶氧量将由100%逐渐降低，当培养基中的碳源消耗完后，溶氧量将再度升高至80%以上，此时菌体的湿重将达9095g/L。2)饲喂碳源和蛋白表达阶段(2496h)在接种后的第二天，通过蠕动泵流加补料液，补料液为50%甘油(其中含有12mLPTMl/L)，流加量为1718mL/L/天。3637°C通气搅拌(转速自始至终维持在375380转/分)培养，4850h后菌体的湿重将达170180g/L。随着菌体的生长，pH值逐渐降低，用氨水维持pH值在5.56.0左右，同时调整通气量使此阶段的溶氧量始终维持在20%以上。在培养的第34天，继续流加50%的甘油(其中含有12mLPTM1/L)，每天大概加入700720mL，溶氧量始终大于20%，温度维持在3637°C，pH维持在5.56.0左右。每隔24小时取数毫升发酵液经5000rpm4°C下离心10分钟，取30uL发酵液上清液进行SDS-PAGE检测，发现有肉眼可观察到的一条蛋白带，分子量约为19KDa，与推测中的T4溶菌酶重组蛋白分子量基本吻合。此夕卜，从电泳图中发现，在培养120小时后，重组T4溶菌酶的表达量达到最高峰(见附图4)。实施例10重组蛋白的纯化待一个发酵周期全部结束之后，留取500mL发酵液作为种子液(接种量为5%)直接进行下一轮的发酵过程。类似的操作累计进行3轮，在每轮发酵过程中，均对菌体的生长量和T4溶菌酶重组蛋白的表达量进行了测定。另外，在每轮发酵过程完全结束后，还取少许菌液涂布于YPD固体平板上，并从中任意挑取10个酵母单菌落，快速提取其基因组(蔡传奇等，2001)DNA，进行PCR检测，结果发现，菌体的生物量、生长速度以及重组蛋白的表达量在各轮发酵过程中基本保持稳定，另外，PCR的检测结果也证实重组汉逊酵母菌株具有很好的遗传稳定性(见表2)。表2HP-T4菌株的遗传稳定性和外源蛋白表达稳定性的测定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在一个发酵周期结束之后，除留下500mL发酵液作为种子液外，其余的发酵液用于T4溶菌酶重组蛋白的纯化。发酵液经5000rpm4°C离心10分钟，留取上清。发酵液上清首先用截流分子量为50KDa的中空纤维滤柱(天津膜天膜工程技术有限公司，产品型号M0F-503，使用方法见该公司说明)过滤，收集透过液，澄清的透过液再用截流分子量为IOKDa的纳滤膜(上海朗极化工科技有限公司，产品编号2426538，使用方法见该公司说明)处理，保留回流液，终体积约为700mL。将此回流液进行脱盐处理，向700mL回流液中加入6.3L蒸馏水，即将回流液稀释10倍，然后将稀释液再次通过上述IOKDa的纳滤膜处理，此时得到的回流液中盐离子浓度也相应稀释10倍，如此重复操作5次，即回流液中盐离子浓度稀释IO5倍，最终得到700mL回流液，将此回流液冷冻干燥后，可得到初步提纯的重组蛋白冻干粉(纯度大于60%左右)。该蛋白冻干粉样品可通过离子交换层析得到进一步的纯化，以满足不同的生产需求。所使用的阳离子离子交换树脂为CM-Sephadex-C25(美国GE公司产品)。按照该公司产品说明，对树脂进行预处理，然后进行装柱(装柱方法见产品说明，层析仪为上海沪西分析仪器厂有限公司产品_型号MA99-3)，具体操作方法如下1)蛋白冻干粉加入5倍体积的蒸馏水进行稀释，然后用丙醋酸将该稀释液pH值调至5.55.8。2)样品上柱(注若冻干粉样品为2g+500mL蒸馏水时，使用1.5x50cm的层析柱，树脂床体积高度为40cm)，流速3mL/分钟。用紫外蛋白检测仪及记录仪记录洗脱液流出过程。3)洗柱，待样品快全部进入树脂后，用0.IM磷酸盐缓冲液含ICT3MMgSO4(pH6.5)进行洗柱，流速3mL/分钟，至0D280nm吸光值为零，约需缓冲液为56倍柱体积。4)洗脱，用0.IM磷酸盐缓冲液含KT3MMgSO4和0.5MNaCl(pH6.5)进行目标蛋白洗脱，流速3mL/分钟，用紫外蛋白检测仪监视蛋白流出情况并收集最大蛋白洗脱部分(目的蛋白峰一般出现在加入洗脱液后不久)，收集含目的蛋白的洗脱液。5)将洗脱液移置透析袋中，对蒸馏水进行透析过夜，期间更换蒸馏水数次，目的是为了去除其中所含的NaCl。6)透析液通过冷冻干燥，可得到目标蛋白干粉，室温下可长期保存。视使用目的不同，可加工成各种剂型，如食品添加剂，针剂等。在上述纯化流程中，每个操作步骤之后都留取少量样品以便进行总蛋白量、纯度和回收率的测定(见表3)。最终制得的重组蛋白纯品进行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色和脱色后，电泳图经LabWork软件(美国UVP公司产品)分析，结果显示重组蛋白浓度达到99%以上(见附图5)，重组蛋白的表达量约为0.89g/L。表3T4溶菌酶重组蛋白的纯化<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>参考文献l、SeonAhCheon，eta1．，Yeast，2009，26507—5122、ArisakaF,etal.,TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology,2003,35(1):16_213、LodeboerAM，etal.，Nucleicacidsresearch,1985,13(9):3063_30824、KlabundeJ,etal.,FEMSYeastResearch,2003,(4):185_1935、CoxH,etal.，Yeast，2000(16):1191_12036、ChenZY,etal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008(79):545_5547、QianWD,etal.，Prot.Expr.Puri.2009(68)183—1898、张冬冬等，微生物学通报，2009，36(6)=0794-07989、GellissenG,etal.，DrugRes.，1996,46:943_94810、孟凡红等，中国生物工程杂志，2006，12:11_1711、蔡传奇等，生物工程学报，2001，17(2)155-16012、SharpPΜ,etal.，NeucleicAcidsRes.，1986，14:5125_514权利要求一种编码T4溶菌酶蛋白的基因，其特征在于，其是按照酵母偏爱的密码子优化过的、编码或至少部分编码T4溶菌酶蛋白的基因。2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的T4溶菌酶蛋白一级结构为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的基因，其特征在于，其具有或至少部分具有SEQIDN0.2所示的核苷酸序列。4.权利要求1-3任一项所述的基因用于构建高效表达和生产T4溶菌酶的重组多型汉逊酵母。5.一种通过重组多型汉逊酵母以组成型方式高效表达和生产T4溶菌酶的方法，包括T4溶菌酶外源基因的人工合成、高效表达载体的构建、高表达酵母重组子的筛选、重组酵母的发酵以及外源重组蛋白的表达和纯化，其特征在于所述T4溶菌酶外源基因为权利要求1-3任一项所述的基因；构建高效表达载体时采用了毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在构建高效表达载体时，用汉逊酵母质膜ATPase基因作为同源序列将T4溶菌酶基因整合到汉逊酵母基因组内。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在构建高效表达载体时，采用的起始载体为PPIC9K。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述T4溶菌酶外源基因的5’端前添加了酵母Kex2基因表达产物切割识别序列GAGAAAAGA。9.一种重组T4溶菌酶蛋白的表达质粒载体，其特征在于其为质粒图谱如附图2所示的载体mT4-ATP-GPIC9K。10.一种表达重组T4溶菌酶蛋白的工程菌株，其特征在于，包含权利要求9所述的表达质粒载体。11.根据权利要求10所述的工程菌株，其特征在于，宿主细胞是多型汉逊酵母A16菌株或其它能够表达外源蛋白的汉逊酵母菌株。12.采用权利要求10或11所述的工程菌株发酵生产重组蛋白的方法，包括(1)菌体培养在基础发酵培养基中发酵，接种前先加入适量氨水，使该培养基的PH值维持在5.56.0左右，然后在每升基础发酵培养基中加入4.37mL微量盐溶液PTM1；按体积比910%的比例接种种子液，3637°C、375380转/分通气搅拌培养2430小时左右；(2)饲喂碳源和蛋白表达流加补料液，补料液为含有12mLPTMl/L的50%甘油，流加量为1718mL/L/天，3637°C、375380转/分通气搅拌培养7296个小时，过程中使溶氧量始终大于20%，温度维持在3637°C，pH维持在5.56.0左右；在上述过程中用到的培养基及试剂配方为基础发酵培养基10XBasalSalts+4%甘油；PTM10.6wt%硫酸铜，0.008wt%碘化钠，0.3wt%硫酸锰，0.02wt%_酸钠，0.002wt%硼酸，0.05衬％氯化钴，2衬％氯化锌，6.5wt%硫酸亚铁，0.025衬％生物素，0.5wt%硫酸。全文摘要本发明公开了一种在多型汉逊酵母细胞中以组成型方式表达和生产T4溶菌酶重组蛋白的方法，其中包括1)使用密码子得到优化后的T4溶菌酶基因以提高其在真核表达系统-汉逊酵母细胞中的生物产量；2)采用汉逊酵母来源的质膜ATP酶核苷酸编码序列作为外源质粒载体整合到汉逊酵母基因组中的同源序列；3)采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控T4溶菌酶基因在汉逊酵母中以组成型的方式高效表达；4)特定的汉逊酵母工程菌发酵培养生长条件以提高T4溶菌酶重组蛋白的生物产量以及快速提纯该重组外源蛋白的方法。而由此方法最终制备的T4溶菌酶重组蛋白纯品具生物活性，可广泛应用于医疗、食品、饲料以及科研等领域。文档编号C12N9/36GK101831451SQ201010158438公开日2010年9月15日申请日期2010年4月22日优先权日2010年4月22日发明者刘德虎,李刚强,王楠申请人:中国农业科学院生物技术研究所