专利名称：家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术、蛋白质的纯化与活性分析，尤其涉及一种家蚕培养细 胞表达重组天蚕抗菌肽Cecropin B的方法。
背景技术：
天蚕抗菌肽Cecropin B是由天蚕细胞产生的一类具有广谱和较强抗菌活性的蛋 白质，该抗菌肽编码基因为105个核苷酸，编码35个氨基酸，蛋白分子量约为4kDa。Boman, H.G.和Faye，I等于1985年首先开始了天蚕抗菌肽Cecropin B基因的研究，而国内这方 面研究较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法，利用基 因工程表达技术，构建含有抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒，并利用家蚕培养细胞作为 宿主，表达生产具有生物活性的重组抗菌肽Cecropin B。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下该家蚕培养细胞表达抗 菌肽Cecropin B的方法主要包括(1)天蚕Cecropin B基因的克隆以天蚕蛹脂肪体细胞抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到天蚕抗菌 肽Cecropin B基因；所述PCR扩增所用的引物设计如下正向引物为含有BamHI酶切 位点的5’ atcggatcc aaatggaaagtcttcaag 3’ ；反向引物为含有Hindlll酶切位点的 5'aagcttttatagcgct ttggcttcgcc 3’ ；所述PCR扩增反应为一个循环，94°C模板变性3分 钟；接着30个循环，94°C变性50秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分钟；最后1个循环，72°C 延伸10分钟；利用琼脂糖凝胶电泳对所述抗菌肽Cecropin B基因进行PCR产物分析，并 用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将纯化后的PCR产物克隆进TA载体pCR2. 1，得到 PCR2. 1-Cecropin B，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆基因顺序正确 性；(2)含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI 和 Hindlll 消化 pCR2. 1-Cecropin B 得到 Cecropin B 基 因片段，然后将Cecropin B基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的 转移载体；将该重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培 养细胞，按以下方式通过同源重组产生重组病毒在聚苯乙烯锥形管中加入li! g转移载体DNA和15i! g家蚕BmNPV DNA，并加入 14ul脂质体lipofectin后混勻，最后加入灭菌蒸馏水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总 体积达到40 yl ；将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然 后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再用含有10%胎牛血清的新鲜培养基在27°C条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液以用来 筛选重组病毒；重组病毒通过三轮空斑筛选，获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液，该病毒溶 液命名为含有抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒；(3)家蚕培养细胞表达使用家蚕培养细胞，接种所述含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒在 27°C下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。本发明与现有技术相比，具有的有益效果是本发明从天蚕中克隆了抗菌肽Cecropin B基因，并进行了测序，建立了利用我国 的特色资源家蚕培养细胞表达重组抗菌肽Cecropin B的技术，为重组抗菌肽Cecropin B 的应用奠定基础。本发明解决了抗菌肽Cecropin B在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操 作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，获得的 家蚕培养细胞表达重组天蚕抗菌肽CecropinB具有较高的生物活性，且大部分被分泌进培 养基中，非常有利于蛋白质的快速提取。本发明重组Cecropin B可以大量生产，为抗菌肽 Cecropin B在医学和食品上的应用开辟了广阔的前景。
图1是杆状病毒转移载体pBlueBacHisa的图谱；图2是本发明Cecropin B在家蚕培养细胞中表达SDS-PAGE的图谱。
具体实施例方式1.材料DNA抽提试剂盒购于Qiagene。DNA处理和PCR扩增试剂盒购于 Takara Biomedicals (Kyoto, Japan)。TA 克隆试剂盒、杆状病毒转移载体 pBlueBacHisa、 lipofectin和Ni-NTA树脂均为美国Invitrogen公司产品。DNA测序试剂盒购于PE Applied Biosystems。胎牛血清FCS、家蚕培养细胞培养基TC-100均为GibcoBRL的产品。2 工作流程2. 1本发明家蚕培养细胞表达重组抗菌肽Cecropin B包括如下部分(1)天蚕Cecropin B基因的克隆以天蚕蛹脂肪体细胞抽提的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到抗菌肽 Cecropin B基因。该PCR扩增的具体方法如下其中，PCR扩增所用的弓丨物设计为正向弓丨物5’ atcggatcc aaatggaaagtcttcaag3', # W BamHI _ 贞 H ; J^ (^l 弓I 5' aagcttttatagcgct ttggcttcgcc 3，，含有 Hindlll 酶切位点。PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94°C模板变性3分钟；接着 30个循环，94°C变性50秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分钟；最后1个循环，72°C延伸10分钟。然后，利用1 %琼脂糖凝胶电泳对得到的抗菌肽Cecropin B基因进行PCR产物分 析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将纯化后的PCR产物克隆进Invitrogen公 司的TA克隆3. 9kb的载体pCR2. 1，得到pCR2. 1-Cecropin B,利用双脱氧链终止法在核苷 酸测序仪上测序确认克隆基因顺序正确性。Cecropin B基因具有如SEQ No. 1所示的序列，该Cecropin B基因编码35个氨基酸。(2)含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI 和 Hindlll 消化 pCR2. 1-Cecropin B 得到 Cecropin B 基 因片段，然后将Cecropin B基因片段克隆入美国Irwitrogene公司的杆状病毒转移载体 pBlueBacHisa得到如图1所示的重组的杆状病毒转移载体pBlueBacHisa。将此重组的转 移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，通过同源重组产 生重组病毒，具体方法为在聚苯乙烯锥形管中加入lii g转移载体DNA和15ii g家蚕BmNPV DNA，并加入 14ul脂质体lipofectin后混勻，最后加入灭菌蒸馏水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总 体积达到40 yl ；将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然 后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再用含有10% 胎牛血清的新鲜培养基在27°C条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液以用来 筛选重组病毒；重组病毒通过三轮空斑筛选，获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液。本发明将 该病毒溶液命名为含有抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒。(3)家蚕培养细胞表达使用家蚕培养细胞，接种上述含有抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒进行感染表 达在27°C下感染三天，通过离心收集家蚕培养细胞。该含有抗菌肽Cecropin B基因在家 蚕培养细胞中表达SDS-PAGE的图谱参见图2。图2中标记为1的是蛋白质标准分子量，2 为对照培养细胞，3为表达重组Cecropin B的样品，箭头所示的条带即为Cecropin B，其分 子量大小为4. 0，与预测的大小一致。2. 2含有抗菌肽Cecropin B的纯化将收集的细胞作为重组抗菌肽Cecropin B纯化的起始材料。由于重组蛋白N-末端带有6 XHis尾巴，因此利用Ni_NTA亲和柱在非变性条件下 进行蛋白纯化；用非变性结合缓冲液，Na3P04 50mmol/L, NaCl 0. 5mol/L, pH 8. 0，加入细胞 中并勻浆，离心后取上清液；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后重组蛋白用含有250mmol/L咪 唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白。2. 3含有抗菌肽Cecropin B的活性分析鉴定取对数生长期的大肠杆菌2 y L，加入到含有2mL LB液体培养基的试管中，再加入 上述纯化的重组Cecropin B蛋白溶液200 uL(0. 5ug/uL)，并以加入PBS为对照。37°C振 荡培养4h测定菌液的0D,值，观察其抗菌活性。抗菌活性检测表明，添加了重组Cecropin B蛋白的大杆菌菌液的0D_分别为0. 194，而对照为0. 456，比对照大大下降。由此说明重 组Cecropin B蛋白在体外具有明显的抑菌活性。
权利要求
一种家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法，其特征在于包括(1)天蚕Cecropin B基因的克隆以天蚕蛹脂肪体细胞抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到天蚕抗菌肽Cecropin B基因；所述PCR扩增所用的引物设计如下正向引物为含有BamHI酶切位点的5’atcggatcc aaatggaaagtcttcaag 3’；反向引物为含有HindIII酶切位点的5’aagcttttatagcgct ttggcttcgcc 3’；所述PCR扩增反应为一个循环，94℃模板变性3分钟；接着30个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后1个循环，72℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳对所述抗菌肽Cecropin B基因进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将纯化后的PCR产物克隆进TA载体pCR2.1，得到pCR2.1-Cecropin B，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆基因顺序正确性；(2)含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-Cecropin B得到Cecropin B基因片段，然后将Cecropin B基因片段克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；将该重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，按以下方式通过同源重组产生重组病毒在聚苯乙烯锥形管中加入1μg转移载体DNA和15μg家蚕BmNPV DNA，并加入14μl脂质体lipofectin后混匀，最后加入灭菌蒸馏水直至聚苯乙烯锥形管内混合物的总体积达到40μl；将该混合物在室温培育15分钟后共转染对数生长期的家蚕培养细胞；然后将该共转染后的家蚕培养细胞先用无血清的TC-100培养基培养24小时，再用含有10％胎牛血清的新鲜培养基在27℃条件下培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液以用来筛选重组病毒；重组病毒通过三轮空斑筛选，获得浓度为108pfu/ml的病毒溶液，该病毒溶液命名为含有抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒；(3)家蚕培养细胞表达使用家蚕培养细胞，接种所述含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒在27℃下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。
全文摘要
本发明公开一种家蚕培养细胞表达抗菌肽Cecropin B的方法，包括(1)以天蚕蛹脂肪体细胞抽提的总RNA为模板，利用RT-PCR扩增得到天蚕抗菌肽Cecropin B基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳对抗菌肽Cecropin B基因进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将纯化后的PCR产物克隆进TA载体pCR2.1，得到pCR2.1-Cecropin B，利用双脱氧链终止法确认克隆基因顺序正确性；(2)用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-Cecropin B得到Cecropin B基因片段后再克隆入杆状病毒转移载体pBlueBacHisa得到重组的转移载体；将该重组的转移载体与家蚕野生型核型多角体病毒BmNPV DNA共转染入家蚕培养细胞，通过同源重组产生重组病毒(3)使用家蚕培养细胞，接种含有天蚕抗菌肽Cecropin B基因的重组病毒在27℃下感染三天以进行感染表达，后通过离心收集家蚕培养细胞。
文档编号C12N15/12GK101845439SQ20101015822
公开日2010年9月29日 申请日期2010年4月27日 优先权日2010年4月27日
发明者吴小锋, 胡小龙, 郭爱芹, 陈琳 申请人:浙江大学