专利名称：致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒，属于病原微生物检测领域，涉 及用于人和易感动物的致病性嗜水气单胞菌的检测。
背景技术：
气单胞菌有广泛的致病性，感染包括冷血动物在内的多种动物如鱼类、禽类及哺 乳类，引致败血症或皮肤溃疡等局部感染，是水生动物尤其是鱼类最常见的致病菌，运动性 气单胞菌在水温高的夏季可造成鱼类细菌性败血症暴发流行。人类感染运动性气单胞菌引 致急性胃肠炎等，目前在国外已将本菌纳入腹泻病原菌的常规检测范围，是食品卫生检验 的对象。嗜水气单胞菌还见于人类败血症、腹膜炎、出血性尿综合征的病例。本实验室陆 承平，陈怀青等于2002年起草制订了《致病性嗜水气单胞菌检验方法》的国家标准(GB/T 18652-2002)。该国标中所涉及到该致病菌的常规生化鉴定方法以及D0T-ELISA检测方法。 本发明致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒采用聚合酶链反应，能够更加快速、准确、 有效的鉴定出该致病菌，为该病菌引起的水产动物细菌性败血症暴发流行的防控工作奠定 ■石出。如何实现致病菌的快速有效检测，是长期困扰临床的问题，有的细菌极难培养，如 嗜肺军团菌，有的细菌生长缓慢，如结核分枝杆菌，还有麻风杆菌、炭疽杆菌等少数无法培 养或者致病力很强的菌种。常见细菌用传统培养方法的检测时间大约为3-5天，临床亟待 更加快速准确的检测方法。基于聚合酶链反应(PCR)扩增的基因诊断技术备受青睐，聚合 酶链反应对象是针对特定模板DNA基因片段设计的一小段互补寡核苷酸，PCR技术模拟DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，该原理主要包括3 个基本反应过程变性_退火-延伸。变性主要是指双链DNA的变性，即双链DNA经加热 后，其热稳定性降低，配对碱基之间的氢键断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物结合。退 火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性(称为退火)。在此过程中，引物与单链DNA模 板仍然按照碱基互补的方式配对。延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合成一条新的与模 板DNA链互补的新链。经重复循环变性_退火-延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复 制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。通过倍数级的扩增后，该反应体系中表达 出大量的规定长度目的基因片段。PCR产物通过凝胶电泳试验来验证是否含有要求长度的 基因组。通过PCR反应，能够在短时间内确定待检模板是否为目的产物，这是本发明的创新
；ο细菌核糖体的DNA含有3种类型，即23S rRNA、16S rRNA和5S rRNA,它们含有的 核苷酸分别约为2900个，1540个和120个。20世纪中期，Woese开始采用寡核苷酸编目法 对生物进行分类，他通过比较各类生物细胞的rRNA特征序列，认为16S rRNA及其类似的 rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为它们为细胞所共有，其功 能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。5S rRNA虽易分析，但由于核苷酸少，没有足够的遗传信息用于分类研究。 而23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的2倍，分析较困难。与此相比，16S rRNA 的相对分子质量适中，作为研究对象较理想。16S rRNA基因是编码原核生物核糖体小亚 基rRNA(16SrRNA)的基因。长度约为1500pb，是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分 子钟”，其序列包含10个可变区(variable region)和与之相同的11个恒定区(constant region)，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关，Woese等与Olsen 等基于对16SrRNA的分析构建了现已被公认的全生命系统进化树，越来越多的细菌依据 16SrRNA被正确分类或重分类，本发明依据已公布的嗜水气单胞菌已有基因组序列，设计合 成了 16SrDNA引物，16S rDNA基因是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因，用 于鉴别判定待检菌株的种属特性，能够准确的判定待检菌株是否为嗜水气单胞菌，此为本 发明的创新点之二。(16S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用，刘文强等，动物医学进展， 2006,27(11) 15218)嗜水气单胞菌的毒力因子有三类，一是胞外产物如毒素、蛋白酶；二是粘附素，如 S蛋白、4型菌毛、外膜蛋白等；三是铁载体。气溶素(aerolysin)或称HEC毒素，具有溶血 性、细胞毒性及肠致病性，属于穿孔毒素。该毒素是由气单胞菌属菌株分泌的一类可溶性蛋 白，是气单胞菌主要的毒力因子之一。气溶素在嗜水气单胞菌中以无活性的可溶性二聚体 前体形式分泌。该前体与特异性的GPI-锚定蛋白相互作用，使得毒素的局部浓度增加，前 毒素通过蛋白酶水解C-末端肽激活转变成气溶素。气溶素中的APT结构域(Aerolysin/ pertussis toxin domain)与靶细胞表面的特异性受体结合，促进聚合，聚合之后气溶素转 化成为插入的状态。插入的结果导致分散的细胞膜通道的产生，使得红细胞的渗透压升高 并最终裂解。最近的研究表明气溶素形成通道之后，激活G蛋白，从而导致内部存储Ca2+的 释放。Charkraborty等(1986)对其基因进行了克隆，从基因水平证明aerA结构基因存在 于整个气单胞菌中，而在其它菌中并未发现，是气单胞菌特有的结构基因。气溶素缺失株比 原毒株毒性大大减弱，为气溶素的致病性提供了有力的证据。气溶素具有强毒性，低浓度就 可裂解敏感细胞。研究发现该毒素具有溶血性、细胞毒性和肠毒性；在高50mg/mL浓度下， 该毒素也可以溶液的形式存在。气溶素在嗜水气单胞菌的毒力因子中起重要作用，是研究 最深入的通道形成毒素之一。本发明根据已有的嗜水气单胞菌的气溶素基因序列，设计合 成一对引物，用于判定该菌是否具有致病性，此为本发明的创新点之三。(陆承平主编，兽医 微生物学，第四版，中国农业出版社，2007，127-131 ；)
发明内容
技术问题本发明旨在针对现有致病性嗜水气单胞菌诊断检测技术某些方面的不足，寻找一 种能够准确、快速、稳定、高效的检测致病菌的诊断方法。该试剂盒采用聚合酶链反应体系， 以现今公认的细菌全生命系统进化树16S rDNA设计合成一对引物作为判定该致病菌的种 属特性；以现今研究最为广泛和深入的该致病菌所分泌的气溶素设计另外一对引物作为判 定该菌致病性另一标准。技术方案用于检测人和易感动物的致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒，其特征在于其特征在于该检测试剂盒使用的引物为基于致病性嗜水气单胞菌标准株J-I株16S rDNA基因组的高度保守区间所设计的引物以及该菌所分泌的特异性蛋白酶气溶素所设计 的第二对引物，16S rDNA引物用于致病性嗜水气单胞菌种属特性的区别鉴定，特异性扩增 的目的片段大小分别为685bp，其引物序列为Pl :5’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’P2 5 ’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3’气溶素Aer引物用于气单胞菌的致病性的判定，特异性扩增的目的片段大小分别 为301bp，其引物序列为Pl :5，-AACCGAACTCTCCAT-3，P2 :5’ -P2 :CGCCTTGTCCTTGTA-3，。双重PCR检测试剂盒的用法，包括1)标准株的选择本发明中所使用的标准株为嗜水气单胞菌J-I株，分类命名嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)。该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia 北京朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保 藏号为 CGMCC NO. 3220。2)特异性引物的制备本试剂盒检测的16S rDNA和气溶素Aer特异性引物的上游引物和下游引物的使 用浓度为25 μ mol/μ L ；引物稀释液置于-20°C保存备用，避免反复冻融；3)增菌将经感染鲫鱼复壮的J-I株接种于装有250mL LB肉汤的500mL的烧瓶中，于 28°C，150rpm，摇振培养24h，染色镜检为革兰氏阳性菌；4)菌液的处理和PCR模板的制备(1) J-I菌体收集，吸取1. 5 μ L菌液入EP管10000r/min离心min,弃上清；(2)向每管加入200 μ L细菌DNA粗提试剂用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细 菌细胞；(3)加入66yL 5mol/L NaCl，充分混勻后，12000r/min离心lOmin，除去蛋白质复 合物及细胞壁等残渣；将上清转移到新离心管中，加入等体积Tris饱和的苯酚用，充分混 勻后，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质；其中细菌DNA 粗提试剂为 Tris 4. 8456g,乙酸钠 1. 6406g，EDTA 0. 2923g, SDS 10. 0g,灭菌双蒸水调配，加浓盐酸至pH8. 0 ；(4)取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混勻后，12000r/min离心3min，去除 苯酚；小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，15000r/min高速离心15min，离心弃
上清液；(5)用400 μ L 70%的乙醇洗涤两次；(6)真空干燥后，用50 μ 1超纯水溶解DNA，-20°C冰箱放置备用；5) PCR扩增试剂的组装采用双层纸板简易包装，其大小大约为长15cm，宽5cm，盒内组成①细菌DNA粗提 试剂12mL ；②PCR扩增试剂0. 8mL ；③超纯水ImL ；④阳性对照DNA0. ImL ；⑤操作说明书一
6份；其中 PCR 扩增试剂为 2 X Taq plus PCR Master Mix 625(12. 5X50) μ l，16srDNA 上下 游各50 μ 1，Aer上下游引物各50 μ 1 ；6)双重PCR反应体系的建立和扩增取PCR扩增试剂16. 5μ 1于PCR薄壁管，然后加入制备好的PCR模板2. 0μ 1，最后 加入超纯水补足至25 μ 1即可将完成的PCR管放入PCR反应仪，；反应参数94°C预变性5min后，进入循环94°C变性30S、50°C退火30S、72°C延伸 lmin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin，取出于4°C保存；7)16S rDNA，气溶素基因检测结果判定与表述取10 μ 1产物，点样于1. 0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝 胶成相系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照(以超纯水替代检样模板)无任何条带 出现，而阳性对照(标准株J-I株基因组模板)应该出现以下两条特异性条带，具体判定方 法阴性对照组无任何条带出现。电泳结果出现685bp处出现明显条带，表现为 16srDNA基因组，判定为嗜水气单胞菌；电泳结果如果出现301bp和685bp处均出现明显条 带，301bp表现为气溶素Aer基因组，判定为致病性嗜水气单胞菌。有益效果本发明通过比对已发表的嗜水气单胞菌16S rDNA和气溶素序列，设计并合成了针 对以上基因组的两组序列，建立了多重PCR反应体系。通过对PCR反应体系中变性温度和时 间，退火温度和时间，延伸温度和时间，循环次数等反应参数的预实验反应；通过敏感性试 验，特异性试验，保存期实验以及同一批次、不同批次间内、外试验，最后将PCR反应产物送 至上海英俊生物技术有限公司测定产物序列，从不同角度验证该检测试剂盒的准确、快速、 稳定的特点。在已有基础上，应用该试剂盒对实验室保存的嗜水气单胞菌进行了检测验证，结 果与预期结果一致。在已建立的双重PCR检测体系的前提下，本实验室通过比对该致病菌的胞外蛋白 酶丝氨酸胞外酶和弹性蛋白酶的核苷酸序列，设计合成了以上两种胞外蛋白酶的引物，分 别建立了三重PCR反应体系和四重PCR反应体系，选取实验室的23株嗜水气单胞菌作为测 试对象，与已建立的双重PCR检测体系相比较发现，双重PCR反应体系的检测结果能够覆盖 多重PCR反应体系的检测结果，较之多重PCR检测体系，双重PCR检测体系能够更加稳定的 鉴别致病性嗜水气单胞菌。
图为16S rDNA，气溶素(Aer)基因检测结果判定。1阴性对照 2MARK 3阳性对照注判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，而阳性对照的应该出现如上图所 示的两条特异性条带。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例
7仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有 科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本申请中引用的 任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常采用常规条件，例如，《分子克隆实验室手册》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) (Sambrook等人)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的方法。(一 )致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的制备1. 1疫苗株的选择本发明中所使用的疫苗株为嗜水气单胞菌J-1株。1.2特异性引物的制备本试剂盒检测的16srDNA和气溶素特异性引物扩增的目的片段人小分别为 685bp (16srDNA)、301bp (Aer)。上游引物和下游引物的使用浓度为25 u mol/u L。可根据附 录A. 1给出的引物寡核昔酸序列人工合成。使用前按本标准要求进行稀释。引物稀释液置 于-20°C保存备用。避免反复冻融。引物寡核普酸序列见附录A。1.3 增菌将经感染鲫鱼复壮的Ah J-1接种于装有250mL LB肉汤的500mL的烧瓶中，于 28°C，150rpm，摇振培养24h。染色镜检为革兰氏阴性菌。1. 4菌液的处理和PCR模板的制备(1)菌体收集，吸取1.5UL菌液入EP管10000r/min离心min,弃上清；(2)向每管加入200 u L细菌DNA粗提试剂用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细 菌细胞；(3)加入66iiL 5mol/L NaCl，充分混勻后，12000r/min离心lOmin，除去蛋白质复 合物及细胞壁等残渣；将上清转移到新离心管中，加入等体积Tris饱和的苯酚用，充分混 勻后，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质；(4)取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混勻后，12000r/min离心3min，去除 苯酚。小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，15000r/min高速离心15min，离心弃
上清液。(5)用400 ii L 70%的乙醇洗涤两次。(6)(真空)干燥后，用50 u 1超纯水溶解DNA，_20°C冰箱放置备用。1.5PCR扩增试剂的组装采用双层纸板简易包装，其大小大约为长15cm，宽5cm，盒内组成①细菌DNA粗提 试剂12mL ；②PCR扩增试剂0. 8mL ；③超纯水lmL ；④阳性对照DNA0. lmL ；⑤操作说明书一 份。1.6双重PGR反应体系的建立和扩增取PCR扩增试剂16. 5iU于PCR薄壁管，然后加入制备好的PCR模板2. OiU，最后 加入超纯水补足至25 ill即可。将完成的PCR管放入PCR反应仪。反应参数94°C预变性5min后，进入循环94°C变性30S、50°C退火30S、72°C延伸 lmin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin，取出于4°C保存。1. 716srDNA，气溶素基因检测结果判定与表述取10 ill产物，点样于1. 0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝
8胶成相系统下拍照判定，具体判定方法见下表具体判定方法阴性对照组无任何条带出现。电泳结果出现685bp处出现明显条带，表现为 16srDNA基因组，判定为嗜水气单胞菌；电泳结果如果出现301bp和685bp处均出现明显条 带，301bp表现为气溶素Aer基因组，判定为致病性嗜水气单胞菌。附录 1目的基因
权利要求
用于检测人和易感动物的致病性嗜水气单胞菌双重PCR检测试剂盒，其特征在于该检测试剂盒使用的引物为基于致病性嗜水气单胞菌标准株J 1株和16S rDNA基因组的高度保守区间所设计的引物以及该菌所分泌的特异性蛋白酶气溶素所设计的第二对引物。
2.根据权利要求1所述的双重PCR检测试剂盒，其特征在于16S rDNA引物用于致病性嗜水气单胞菌种属特性的区别鉴定，特异性扩增的目的片段 大小分别为685bp，其引物序列为Pl :5’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3’P2 :5’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3，气溶素Aer引物用于气单胞菌的致病性的判定，特异性扩增的目的片段大小分别为 301bp，其引物序列为Pl :5’ -AACCGAACTCTCCAT-3，P2 :5， -P2 :CGCCTTGTCCTTGTA-3，
3.权利要求1或2所述的双重PCR检测试剂盒的用法，包括1)标准株的选择本发明中所使用的标准株为嗜水气单胞菌J-I株，分类命名嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)，该菌株已于2009年8月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏号为CGMCC NO. 3220 ；2)特异性引物的制备权利要求1所述的16S rDNA和气溶素Aer特异性引物的上游引物和下游引物的使用 浓度为25 4!1101/^1^引物稀释液置于-201保存备用，避免反复冻融；3)增菌将经感染鲫鱼复壮的Ah J-I接种于装有250mL LB肉汤的500mL的烧瓶中，于28°C， 150rpm，摇振培养24h，染色镜检为革兰氏阴性菌；4)菌液的处理和PCR模板的制备(1)J-I菌体收集，吸取1. 5 μ L菌液入EP管10000r/min离心min,弃上清；(2)向每管加入200μL细菌DNA粗提试剂用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞；(3)加入66yL5mol/L NaCl，充分混勻后，12000r/min离心lOmin，除去蛋白质复合物 及细胞壁等残渣；将上清转移到新离心管中，加入等体积Tris饱和的苯酚用，充分混勻后， 12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质；其中细菌 DNA 粗提试剂为 Tris 4. 8456g,乙酸钠 1. 6406g, EDTA 0. 2923g, SDS 10. 0g, 灭菌双蒸水调配，加浓盐酸至PH8. 0 ；(4)取离心后的水层，加等体积的氯仿，充分混勻后，12000r/min离心3min，去除苯酚； 小心取出上清用预冷两倍体积的无水乙醇沉淀，15000r/min高速离心15min，离心弃上清 液；(5)用400μ L 70%的乙醇洗涤两次；(6)真空干燥后，用50μ 1超纯水溶解DNA，-20°C冰箱放置备用；5)PCR扩增试剂的组装采用双层纸板简易包装，其大小大约为长15cm，宽5cm，盒内组成①细菌DNA粗提试剂12mL ；②PCR扩增试剂0. 8mL ；③超纯水ImL ；④阳性对照DNAO. ImL ；⑤操作说明书一份； 其中 PCR扩增试剂为 2XTaq plus PCR Master Mix 625(12. 5X50) μ 1，16srDNA上下游各 50 μ 1，Aer上下游引物各50 μ 1 ；6)双重PCR反应体系的建立和扩增取PCR扩增试剂16. 5 μ 1于PCR薄壁管，然后加入制备好的PCR模板2. 0 μ 1，最后加入 超纯水补足至25 μ 1即可将完成的PCR管放入PCR反应仪；反应参数94°C预变性5min后，进入循环94°C变性30S、50°C退火30S、72°C延伸 lmin，共30个循环，最后72°C延伸lOmin，取出于4°C保存；7)16srDNA，气溶素基因检测结果判定与表述取10 μ 1产物，点样于1. 0%琼脂糖凝胶电泳板孔中，140V电压，电泳30min，于凝胶成 相系统下拍照判定，判定前提条件为阴性对照无任何条带出现，而阳性对照的应该出现以 下两条特异性条带，具体判定方法电泳结果出现685bp则为16srDNA基因组判定为嗜水气单胞菌，电泳结果出现301bp 和685bp双泳带判定为致病性嗜水气单胞菌。
全文摘要
本发明涉及一种致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒，属于病原微生物检测领域。基于致病性嗜水气单胞菌标准株J-1株16S rDNA基因组的高度保守区间所设计的引物用于致病性嗜水气单胞菌种属特性的区别鉴定，扩增片段685bp；以该菌所分泌的特异性蛋白酶气溶素所设计的第二对引物用于气单胞菌的致病性的判定，片段大小为301bp。本发明能够快速、准确的判定待检菌株的种属特性和致病性，通过对实验菌株和临床分离株的常规生化鉴定方法和致病性鉴定方法的比较试验得知，该试剂盒的符合率为100％。在对本试剂盒的特异性、重复性、敏感性和保存期的评价试验中，均得到了理想的结果。
文档编号C12Q1/04GK101942505SQ20101015811
公开日2011年1月12日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者姚火春, 潘子豪, 陆承平 申请人:南京农业大学