一种维氏气单胞菌渔用注射疫苗的制备及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明属于防治水产动物疾病研宄技术领域，涉及一种维氏气单胞菌渔用注射疫苗的制备及使用方法。
【背景技术】
[0002]维氏气单胞菌1983年在美国疾控预防中心被首次鉴定，它具有气单胞菌属典型的毒力因子，如气溶素、肠毒素、一系列粘附因子、磷脂酶、丝氨酸蛋白酶等。维氏气单胞菌是一种人和鱼共患致病菌，在影响水产品质量的同时，也对人类健康和安全造成了威胁。进入21世纪以来，由维氏气单胞菌引发的水产养殖动物致病情况呈现上升趋势，引起鱼类感染和大量水产动物死亡的报道也逐渐增多。利用疫苗预防疾病是近年来水产业的发展趋势，我国的渔用疫苗研宄十分薄弱，批准使用的商用水产动物疫苗屈指可数，有关维氏气单胞菌灭活疫苗的研宄在国内尚未见报道。目前，鱼类易感染维氏气单胞菌，但却没有成本低、制备容易、预防效果好的疫苗进行鱼类及水产动物免疫，以至于造成他们的大量死亡。本发明通过分离鉴定得到维氏气单胞菌并制备出灭活疫苗，用于鱼类免疫后具有很好的免疫保护效应，能够有效地防控维氏气单胞菌引起的鱼类等疾病。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种维氏气单胞菌渔用注射疫苗的制备方法，解决了鱼类感染维氏气单胞菌引起疾病的问题。
[0004]本发明的另一个目的在于提供一种维氏气单胞菌渔用注射疫苗的使用方法。
[0005]本发明所采用的技术方案是按照以下三个步骤进行:
[0006]①维氏气单胞菌的来源及分离鉴定:发明人从发病的乌鳢体内分离到一株优势菌，经人工感染后证实其对鲫鱼等有相同的病兆现象，具有较强的致病性。以分子鉴定16SrRNA序列为主，结合分离菌株的生理生化鉴定结果，确定病原菌为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)。构建系统发育树，表明该菌16SrRNA序列与同源性较高的前40位的菌株均为维氏气单胞菌(A.veronii)，同源性在99%以上，由此选用此菌株制备维氏气单胞菌灭活疫苗。
[0007]②维氏气单胞菌渔用注射疫苗制备方法是按照以下步骤进行:
[0008]步骤1:挑取维氏气单胞菌形成的单个菌落，接种培养于普通肉汤培养基中，28°C培养12h，扩大培养维氏气单胞菌到最高峰值；
[0009]步骤2:之后用无菌枪头吸取0.2mL菌液涂布于普通平板上培养，4h后用无菌生理盐水洗下维氏气单胞菌；
[0010]步骤3:用麦氏比浊法测定细菌浓度，直至用无菌生理盐水稀释维氏气单胞菌浓度至 2.5X109CFU/mL ；
[0011]步骤4:加入0.2 %的甲醛溶液，在28 °C条件下恒温灭活24h，8000r/min离心洗涤3次，每次5min，去掉其他成分后，再用无菌生理盐水将维氏气单胞菌浓度稀释至I X 108CFU/mL,即为维氏气单胞菌灭活全菌苗；置于4°C的冰箱中保存备用。
[0012]③维氏气单胞菌渔用注射疫苗的使用方法:将制得的维氏气单胞菌灭活疫苗采用腹腔注射的方法对健康鱼类进行免疫注射，大小规格为40-60g的鱼，接种量为每尾注射
0.2mL疫苗。
[0013]进一步，所述注射是I次免疫注射；或者在I次免疫注射后第14?28d进行第2次免疫注射。
[0014]本发明的有益效果是该疫苗能有效预防维氏气单胞菌感染鱼类，免疫效果好。
[0015]本发明的优点是:
[0016]①制备的维氏气单胞菌渔用注射疫苗对鱼类具有很好的免疫保护作用，能有效地预防维氏气单胞菌对鱼类的感染。维氏气单胞菌疫苗免疫试验表明对鱼类的免疫保护力在70%?90%之间，总体免疫保护力可达到85%以上。
[0017]②从鱼类人工感染和回归感染试验可见，制作渔用注射疫苗选用的维氏气单胞菌株具有较强的毒力；在对鲫鱼的急性毒性试验中，测得该菌株半致死量为
1.6X 17(Cells);用4X 108cfu/mL维氏气单胞菌浓度进行回归感染试验，乌鳢的死亡率为100%。维氏气单胞菌灭活疫苗具有安全性好、制备容易等特点，在保证其安全性的前提下，采取温和的灭活条件保证了疫苗的抗原性和有效性；疫苗使用0.2%的甲醛在28°C条件下灭活24h，不但可以达到完全灭活的要求，还能最大程度的保护好其免疫原性。
【具体实施方式】
[0018]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0019]本发明的维氏气单胞菌渔用注射疫苗的制备和使用方法如下:
[0020]维氏气单胞菌灭活疫苗的制备:
[0021]步骤1:挑取维氏气单胞菌形成的单个菌落，接种培养于普通肉汤培养基中，28°C培养12h，扩大培养维氏气单胞菌到最高峰值；
[0022]步骤2:之后用无菌枪头吸取0.2mL菌液涂布于普通平板上培养，4h后用无菌生理盐水洗下维氏气单胞菌；
[0023]步骤3:用麦氏比浊法测定细菌浓度，直至用无菌生理盐水稀释维氏气单胞菌浓度至 2.5X109CFU/mL ；
[0024]步骤4:加入0.2 %的甲醛溶液，在28 °C条件下恒温灭活24h，8000r/min离心洗涤3次，每次5min，去掉其他成分后，再用无菌生理盐水将维氏气单胞菌浓度稀释至I X 108CFU/mL,即为维氏气单胞菌灭活全菌苗；置于4°C的冰箱中保存备用。
[0025]使用方法:
[0026]将制得的维氏气单胞菌灭活疫苗采用腹腔注射的方法对健康鱼类进行免疫注射，大小规格为40-60g的鱼，接种量为每尾注射0.2mL疫苗；免疫可以是I次免疫注射，也可以在I次免疫后第14?28d进行第2次免疫注射。
[0027]实施例1:
[0028]将制备的维氏气单胞菌渔用注射疫苗对鲫鱼进行二次免疫并攻毒，结果显示鲫鱼注射疫苗后血清抗体效价在14d达第一个峰值1:320，经过二次免疫后抗体效价增加至1:640 ;攻毒后，维氏气单胞菌疫苗对鲫鱼的免疫保护力达到87.5%。鲫鱼注射疫苗后外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞的分类百分比、吞噬细胞的吞噬百分比和吞噬指数均显著高于对照组(p〈0.05)，由此表明维氏气单胞菌灭活疫苗对鲫鱼免疫保护的效果好。
[0029]实施例2:
[0030]将制备的维氏气单胞菌渔用注射疫苗对草鱼进行免疫并攻毒，分为一次免疫组和进行二次免疫组，结果显示草鱼注射疫苗后血清抗体效价一次免疫组在免疫后14d达到最大值1:320，二次免疫组在第2Id达到最大值1:640 ;攻毒后，维氏气单胞菌疫苗对草鱼的免疫保护力一次免疫组为70.59%，二次免疫组为88.24%，免疫组与对照组相比均差异显著(P〈0.05)。草鱼注射疫苗后2个免疫组外周血淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞的分类百分比，以及草鱼免疫器官的肝指数、脾指数、肾指数均显著高于对照组(P〈0.05)，由此表明维氏气单胞菌灭活疫苗对草鱼免疫保护的效果好。
[0031]以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1.一种维氏气单胞菌渔用注射疫苗的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行: 步骤1:挑取维氏气单胞菌形成的单个菌落，接种培养于普通肉汤培养基中，形成菌液，28°C培养12h，扩大培养维氏气单胞菌到最高峰值； 步骤2:之后用无菌枪头吸取0.2mL菌液涂布于普通平板上培养，4h后用无菌生理盐水洗下维氏气单胞菌； 步骤3:用麦氏比浊法测定维氏气单胞菌浓度，用无菌生理盐水稀释维氏气单胞菌浓度至 2.5X109CFU/mL ； 步骤4:加入0.2 %的甲醛溶液，在28°C条件下恒温灭活24h，8000r/min离心洗涤3次，每次5min，再用无菌生理盐水将维氏气单胞菌浓度稀释至IX 108CFU/mL，即为维氏气单胞菌灭活全菌苗；置于4°C的冰箱中保存备用。
2.按照权利要求1所述维氏气单胞菌渔用注射疫苗的使用方法，其特征在于:将制得的维氏气单胞菌灭活疫苗采用腹腔注射的方法对健康鱼类进行免疫注射，大小规格为40-60g的鱼，接种量为每尾注射0.2mL疫苗。
3.按照权利要求2所述维氏气单胞菌渔用注射疫苗的使用方法，其特征在于:所述注射是I次免疫注射；或者在I次免疫注射后第14?28d进行第2次免疫注射。
【专利摘要】本发明公开了一种维氏气单胞菌渔用注射疫苗的制备及使用方法，维氏气单胞菌单个菌落普通肉汤中28℃培养12h；用无菌枪头吸取涂布于普通平板，4h后用无菌生理盐水洗下维氏气单胞菌；用无菌生理盐水稀释维氏气单胞菌至2.5×109CFU/mL；加入0.2％的甲醛溶液，在28℃条件下恒温灭活24h，8000r/min离心洗涤3次，每次5min，再用无菌生理盐水稀释维氏气单胞菌至1×108CFU/mL；将制得的维氏气单胞菌灭活疫苗采用腹腔注射的方法对健康鱼类进行免疫注射，大小规格为40-60g的鱼，接种量为每尾注射0.2mL疫苗。本发明的有益效果是该疫苗能有效预防维氏气单胞菌感染鱼类，免疫效果好。
【IPC分类】A61K39-02, A61P31-04
【公开号】CN104784683
【申请号】CN201510114225
【发明人】郑曙明, 吴青, 李正伟
【申请人】西南大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月16日