一种嗜水气单胞菌四环素类药物耐药基因检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌四环素类药物耐药 基因检测方法。
【背景技术】
[0002] 四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土霉素及半合 成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等。本品为广谱抑菌剂，高浓度时具杀菌 作用。除了常见的革兰阳性菌、革兰阴性菌以及厌氧菌外，多数立克次体属、支原体属、衣原 体属、非典型分枝杆菌属、螺旋体也对本品敏感。多年来由于四环素类的广泛应用，临床 常见病原菌包括葡萄球菌等革兰阳性菌及肠杆菌属等革兰阴性杆菌对四环素多数耐药，并 且，同类品种之间存在交叉耐药。
[0003] 国内外的大量研宄表明，由于四环素药物长期和大量使用，嗜水气单胞 菌对四环素类药物的耐药性十分严重。常见的四环素耐药基因已经发现的有： TetA，TetB，TetC，TetD，TetE，TetG等。四环素耐药性菌株通过水产产品以及食物链等途径 引起的交叉传播，直接对人体健康构成威胁。
[0004] 目前我国水产产品致病菌耐药性检测控制中，在四环素药耐药性检测研宄方面， 对病原菌耐药性基因的研宄开展得少。传统方法是通过测定嗜水气单胞菌的最低抑菌浓度 或抑菌圈大小测定嗜水气单胞菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的嗜水气单胞菌 分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于及时的选药治疗。同 时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验嗜水气单胞菌的表型耐药特性，不能检测嗜水 气单胞菌的隐型耐药性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种嗜水气单胞菌四环素类药物耐药 基因检测方法。
[0006] 本发明的具体技术方案如下：
[0007] 一种嗜水气单胞菌四环素类药物耐药基因检测方法，包括如下步骤：
[0008] (1)收集嗜水气单胞菌活菌体0. 5~0. 7g，用5~7mL去离子水重悬，反复冻融破 碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；
[0009] (2)将该模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetC-F、 TetC-R、TetG-F和TetG-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯 水、PCR 缓冲液、终浓度均为 0. 25 ~0. 35mmol/L 的 dNTPs (dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP)、终浓 度为0· 5~0· 6mmol/L的TetA-F、终浓度为0· 5~0· 6mmol/L的TetA-R、终浓度为0· 3~ 0· 4mmol/L 的 TetC-F、终浓度为 0· 3 ~0· 4mmol/L 的 TetC-R、终浓度为 0· 4 ~0· 5mmol/L 的 TetG-F、终浓度为(λ 4 ~(λ 5mmol/L 的 TetG-R 和终浓度为(λ 01 ~(λ 02U/uL 的 TaqDNA 聚合酶，其中 TetA-F、TetA-R、TetC-F、TetC-R、TetG-F 和 TetG-R 分别如 SEQ ID 1、SEQ ID 2、SEQ ID 3、SEQ ID 4、SEQ ID 5和SEQ ID 6,上述PCR缓冲液的10倍母液中包括50~ 55mM 氯化钠、ρΗ8· 3 的 10mMTris-HCl、0. 01 ~0· 02%甘油和 0· 01 ~0· 02%硫酸铵，25 ~ 30mM MgCl2;
[0010] (3)步骤（2)的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。
[0011] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1)为：收集嗜水气单胞菌活菌体 0. 5~0. 6g，用5~6mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~ 15min后收集上清液，得到模板。
[0012] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓 冲液、终浓度均为0. 3mmol/L的dNTPs、终浓度为0. 5mmol/L的TetA-F、终浓度为0. 5mmol/ L的TetA-R、终浓度为(λ 3mmol/L的TetC-F、终浓度为(λ 3mmol/L的TetC-R、终浓度为 0. 4mmol/L 的 TetG-F、终浓度为 0. 4mmol/L 的 TetG-R 和终浓度为 0.0 lU/uL 的 TaqDNA 聚合 酶。
[0013] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR缓冲液的10倍母液中包括50mM氯化 钠邛!18.3的1011111'1^8-!1(：1、0.01%甘油和0.01%硫酸铵，2511111%(：1 2。
[0014] 在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应条件如下：94~95°C预变 性10~12min，然后进入如下循环：94~95°C变性45~50s、54~55°C退火1~I. 5min、 72~74°C延伸45~50s，共30~35个循环，循环结束后于72°C延伸7~8min，2~4°C保 存。
[0015] 进一步优选的，所述PCR扩增的反应条件如下：94°C预变性lOmin，然后进入如下 循环：94°C变性45s、54°C退火lmin、72°C延伸45s，共30个循环，循环结束后于72°C延伸 7min，4°C 保存。
[0016] 在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（3)的电泳条件为：2%琼脂糖凝胶， 80V电压，时间40min。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 1、本发明的检测方法敏感、特异、快速，可以检测极微量的目的基因进行检测，而 不需要经过费时的嗜水气单胞菌培养阶段；
[0019] 2、本发明的检测方法在同一反应体系中加入多对引物对多个四环素耐药基因同 时进行扩增，在检测基因过程中可设立内部对照；可指示出模板的数量；可同时扩增几个 目的基因：消耗的时间和试剂少，减少准备时间提高效率；可大量地进行样品和目的基因 的检测；
[0020] 3本发明的检测方法可指示许多耐药菌中的某一个，或区分同意属中的种或株。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1的电泳检测结果图。
【具体实施方式】
[0022] 以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0023] 实施例1
[0024] (I) LB培养基摇瓶培养增殖嗜水气单胞菌，摇瓶培养条件为30°C，18h，120rpm，摇 瓶培养结束后离心收集嗜水气单胞菌活菌体0. 5g，用5mL去离子水重悬，反复冻融5次破碎 细胞，10000pm离心10min后收集上清液，得到模板；
[0025] (2)将该5uL模板与四环素类药物耐药基因检测引物TetA-F、TetA-R、TetC-F、 TetC-R、TetG-F 和 TetG-R(引物浓度分别为 25mmol/L，用 ImM Tris-HCl-0.1