一种抗嗜水气单胞菌相关的中华鳖微卫星序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体设及一种中华整抗嗜水气单胞菌 微卫星位点及其应用。
【背景技术】 W02] 中华整，又称甲鱼、王八、水鱼、元鱼、团鱼、脚鱼和老整，英文名化inese Soft-shelledTurtle,拉下文名（Pelodiscussinensis),中国除宁夏、新疆、青海及西藏 未见报道外，其余各省、市、自治区均有分布，W长江流域和华南地区为多见；国外分布于日 本、朝鲜和越南。中华整由于其药用价值和营养价值，长期被大量消耗，而品种是中华整养 殖的物质基础之一（品种、饲料、水质），良种的选择和育种是增产的有效途径，同时也可 W间接起到节能减排的作用。一般认为，在其它条件相同的情况下，使用优良品种可增产 20~30%，因此要发展"高产、优质、高效"的中华整养殖业，对良种的选育应该引起足够的 重视。遗传改良或品种培育是中华整养殖发展的动力，研究表明，遗传变异水平与生物的生 长速度、抗嗜水气单胞菌能力与生产性状密切相关，因此，本发明欲建立一种筛选方式，将 中华整抗嗜水气单胞菌基因内部的微卫星标记用于快速检测多个样本，微卫星标记的基本 原理是根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产 物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率，再通过关联分析 判断其抗嗜水气单胞菌能力，应用与抗嗜水气单胞菌关联分析，进一步应用于分子辅助育 种。
[0003] 分子标记辅助选育（MA巧是遗传育种中的重要环要节之一，它的原理是根据与某 一性状紧密相连的分子标记的出现来对目标性状的基因型进行选择，MS在鉴定优良亲本， 筛选早期优良性个体，加快育种进程中发挥了重要作用。微卫星标记由于具有多态性丰富、 遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增、条带易于识别等多种优点成为开发的首 选。微卫星（Microsatellites)又称简单序列重复序列（Simplesequencerepeats,SSR)， 是真核生物基因组中广泛分布的简单重复DNA片段，一般由2~6个核巧酸为基本单位组 成，其中，最常见的是双核巧酸重复，如（(AC/TG)n及（AG/TC)n。不同的生物个体由于基 本单位重复次数的不同W及重复程度的不完全形成了微卫星位点的长度多态性而显示出 多态性。研究表明，可能是DNA复制过程中的"链滑（strandslippage)现象造成微卫星 DNA多态性信息容量（polymo;rphicinformationcontent，PIC)较高。微卫星DNA的高突 变性、共显性表达及其在真核生物基因组中的普遍性，目前己被广泛用于遗传多样性分析， 亲缘关系鉴定，连锁图谱构建，功能基因定位，分子标记选育等研究领域，由于每个微卫星 两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计特异性引物，通过PCR技术来 扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同个体基因型微卫星的多态性，而 且，微卫星在基因组中分布密度很大，表现出高度的多态性和共显性遗传，能为种质资源的 保护、合理的人工增养殖、人工放流方案的制定提供评价依据。因此，从中华整中分离多态 性微卫星抗嗜水气单胞菌位点就成为上述工作的基础。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种中华整抗 嗜水气单胞菌相关微卫星位点及引物，即提供1对与抗嗜水气单胞菌相关的微卫星位点，W及相应的多态性微卫星引物，从而为中华整筛选抗嗜水气单胞菌的相关个体选育提供分 子标记。 阳〇化]本发明所要解决的另一个技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种微卫星 位点为分子标记在中华整抗嗜水气单胞菌筛选中的应用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗嗜水气单胞菌相关的中华 整微卫星序列，核巧酸的序列为SEQIDNO:1。
[0007] 本发明还提供了上述抗嗜水气单胞菌相关的中华整微卫星序列设计的微卫星引 物对，其序列分别为SEQIDNO. 2和SEQIDNO. 3,其中
[0008] 上游引物的核巧酸序列沈9 10側.2为：尸:46〔46〔〇：44〔〇：了4176八(：；
[0009]下游引物的核巧酸序列沈Q ID NO. 3为：R:TGCCTGGGTGCAACTTGTAA。
[0010] 本发明还提供了一种应用，该应用不用于疾病的诊断和治疗，其应用步骤为：
[0011] 1)基因组DNA的提取：使用基因组DNA提取试剂盒从中华整群体中分别提取基因 组DNA作为扩增的模板；
[0012] 2)微卫星PCR扩增：利用该微卫星引物对对基因组DNA进行PCR扩增；
[0013] 3)扩增产物电泳：采用变性聚丙締酷胺凝胶电泳法及银染法检测微卫星扩增产 物；
[0014] 4)检测：通过检测不同个体中微卫星位点的电泳结果进行多态性分析，中华整群 体中至少存在五个等位基因，分别是153bp、16化p、17化p、18化p、2(Ubp，其中153bp处等位 基因在中华整抗嗜水气单胞菌群体中表达具有特异性，该微卫星位点可作为筛选抗嗜水气 单胞菌中华整个体的分子标记。
[0015] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明开发出了一类适用于中华整抗嗜水 气单胞菌的微卫星序列，本发明人还基于微卫星的简单重复序列设计了特异性的引物，且 本发明发现该微卫星位点分子标记与中华整抗嗜水气单胞菌的性状相关，通过基因型分 析的方式可筛选出中华整抗嗜水气单胞菌个体，本发明个微卫星位点具有高度多态性和稳 定性，可进一步应用于中华整分子辅助育种
【具体实施方式】
[0016] W下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[0017] 实施例1嗜水气单胞菌攻毒的方法的建立 阳〇1引 1、实验样品义集
[0019] 选取200g/只的中华整黄河群体，用嗜水气单胞菌T4菌株做攻毒处理，最先死亡 的50只为易感群体，最后死亡的50只为抗嗜水气单胞菌群体（其中抗嗜水气单胞菌的整 用细菌注射了 5-6次依然很活跃）。屠宰后取其肌肉组织-80°C保存。
[0020] 2、试验方法
[0021] 嗜水气单胞菌（Aeromonashy化ophila)T4菌株由南京农业大学陆承平教授惠赠。 Τ4菌株复壮后接种于普通营养琼脂培养基，28°C恒溫培养12h(0D600<1. 0)，用灭菌生理盐 水洗下菌体，平板计数并稀释到4 X 108c化/mU用1. 0 X 108c化/50g体重浓度对中华整进行 攻毒。 W22] 中华整经20天预饲养后，进行T4菌半致死量确定，所用菌液浓度为： 1.OXIO^C即/mL、5.OXIO^C即/mL、l. 0X10化即/mL、5. 0X10化即/mL、l.OXl〇9c即/mL和 5. 0X109CFU/mU对照组注射等量的生理盐水。注射剂量为1血，每个浓度梯度10只中华整， 共70只，统计攻毒10天后各组的死亡数。用半致死量浓度对养殖于30个水族箱的600只 健康中华整注射。实验间隔时间lOd，对照组注射等体积无菌生理盐水（0.9%化C1)。日 换水率20 %，连续观察实验整的活动情况，W身体僵直、碰触无反应为死亡评判标准；W趴 在料台上不动，反应迟缓作为嗜水气单胞菌整的判断标准。每日观察两次，及时取出死亡个 体，W分成易感组和抗嗜水气单胞菌组。每只中华整单独进行采样，取肌肉组织冷冻保存， W备后续的DNA提取。经过攻毒后，按照中华整死亡的顺序进行排号，易感的个体发生了严 重的炎症反应，肠道大量充血，背甲和腹甲发生穿孔，鼻腔内流血，运些是嗜水气单胞菌感 染的典型症状。经过连续4次攻毒后还剩下51只完好的中华整，运些中华整体表光滑无 伤，行动活泼，解剖后肠道没有发生明显的充血，肠道中可见有食物，作为抗嗜水气单胞菌 组。同时根据抗嗜水气单胞菌中华整的数量，选择最早感染嗜水气单胞菌发病的51只中华 整为易感组。
[0023] 实施例2微卫星位点的获得W及引物设计
[0024] 1、易感组和抗嗜水气单胞菌组中DNA的抽提 [00对采用DNA的酪抽提和乙醇沉淀法：
[0026] (1)取0.〇25g中华整肌肉样品，放入1. 5血离屯、管中。加入100血STE裂解缓冲 液，在冰上用眼科小剪刀剪碎，再补加400血STE裂解缓冲液，50 μ L SDS (10%)，5 μ L蛋白 酶K(20mg/mL)，充分混匀后放入56°C消化地，期间比混匀一次。直至裂解液澄清。
[0027] 似加入酪/氯仿/异戊醇（25 :24 :1)500血，抽提lOmin，在12000巧m条件下离 屯、lOmin。
[0028] (3)取离屯、后的上清液，重复上述步骤一次，直至水相与有机相间无蛋白质层。
[0029] (4)取离屯、后的上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24 :1)500μL抽提lOmin， 12000巧m离屯、lOmin。
[0030] (5)取上清液加入50μL NaAc(3M)，1000μL冷无水乙醇缓慢摇匀，可见丝状DM 析出。放入-20°C冰箱lOmin，使DM充分析出。13000巧m离屯、lOmin。 阳03U (6)小屯、的弃去上清液，用100070%乙醇洗涂沉淀，10000巧m下离屯、5min，重复一 遍。
[0032] (7)吸出乙醇，通风干燥3-5min。
[0033] (8)加入50 μ L灭菌双蒸水，轻弹至DM全部溶解，放在-20°C冰箱中保存备用。
[0034] (9)提取好的DNA需要用1%琼脂糖电泳检测其纯度。
[00对（10)采用微量核酸测定仪检测样本DNA的浓度和纯度，并稀释到10化g/ -20°C保存。
[0036]2、微卫星位点的筛选及引物的获得
[0037] 对于采用微卫星位点为遗传标记的种群遗传学研究，选择出