一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物疫苗制备技术，具体涉及一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联 口服缓释微球疫苗及制备方法。本发明的疫苗主要适用于鱼类。
【背景技术】
[0002] 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophil，Ah)和维氏气单胞菌（Aeromonas veronii， Αν)可引起鱼类、两栖类和爬行类动物爆发出血性败血症，导致淡水鱼皮肤出血（出血性败 血症）和大量死亡，给规模化淡水鱼养殖业带来了巨大经济损失。应用抗生素等传统疗法 易诱发细菌耐药，药物残留及环境生态破坏等一系列问题。
[0003] 目前所开发的嗜水气单胞菌疫苗（全菌疫苗、基因工程疫苗）均为注射免疫或浸 泡免疫。虽然与注射免疫、浸泡免疫相比，口服免疫效果较差，但鱼口服免疫具有使用方便、 安全好、鱼群应激小、适于规模化及重复免疫等特点，有望成为最有前景的鱼类免疫途径。
[0004] 由于鱼类胃酸性环境及肠内消化酶的破坏，传统疫苗到达肠粘膜之前被大量降 解，即使有少量的抗原到达肠粘膜也无法形成持续性的免疫刺激，很难诱发高效的免疫应 答，而通过增加免疫剂量或免疫次数来提高免疫效果又大大提高了免疫成本，免疫效果较 差。近年来，国内外许多学者先后利用各种聚合物微囊传递系统开展口服疫苗研宄。
[0005] 2006年A. Ρ. ROdrigueS等人利用植物油乳化法研制嗜水气单胞菌海藻酸钠口服 疫苗，但所制备微球的粒径较大，平均粒径约为50 μ m，不符合理想微球的粒径要求（10 μ m 左右），可能会影响抗原提呈细胞对微球的摄取，动物免疫试验效果未见报道。
[0006] 海藻酸钠（C6H7O8Na) n是由α - L 一甘露糖醛酸（M单元）与β - D -古罗糖醛 酸（G单元）依靠1，4 一糖昔键连接而组成的线性共聚物。海藻酸钠粉末遇水变湿，可缓慢 的完全水化并溶解。海藻酸盐可通过其古罗糖酸的钠离子与二联阳离子（Ca 2+)交换而瞬时 凝胶化成球。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于开发一种在鱼类消化系统中相对稳定，粒径适中，易被巨噬细 胞捕获，具有缓释性和抗原保护性，且生物相容性好的微囊抗原传递系统。并将该微囊抗原 传递系统应用于嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌，开发出嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联 微囊口服疫苗，以克服灭活疫苗直接口服免疫效果差的缺陷。
[0008] 本发明的技术方案是：申请人制备了一种嗜水气和维氏气单胞菌二联口服缓释微 球疫苗，包括海藻酸钙控释微囊以及包封于所述微囊中的灭活嗜水气和维氏气单胞菌，该 灭活疫苗含有的嗜水气和维氏气单胞菌的保藏号分别为CCTCC Ν0:Μ 2013566和CCTCC Ν0:Μ 2013565;所述抗原已灭活，其保藏地址为中国武汉市武汉大学内的中国典型培养 物保藏中心（CCTCC)，其分类命名分别为"嗜水气单胞菌XDMG(I)Aeromonas hydrophil XDMG(I) "和"维氏气单胞菌 XDLG(I)Aeromonas veronii XDLG(I) "。
[0009] 本发明的进一步改进包括：
[0010] 所述嗜水气单胞菌的抗原和维氏气单胞菌的抗原体积含量一致。
[0011] 所述的海藻酸钙控释微囊包裹嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的包封率 (96. 31±0. 20)%，载菌量（2. 37±0. 36)X 108cfu/mg。该括号内内容为本领域技术人员常 用表示方法，本领域技术人员可以准确无误的理解该描述所表达的意思。
[0012] 海藻酸钙控释微囊粒径为10. 35 μ m。
[0013] 本发明的另一目的在于，提供一种用于生产权利要求1所述的嗜水气单胞菌及维 氏气单胞菌二联灭活疫苗的菌株，该菌株分别是嗜水气单胞菌，保藏在中国典型培养物保 藏中心（CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2013566;和维氏气单胞菌，保藏在中国典型培养 物保藏中心（CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO:M 2013565。
[0014] 本发明进一步提供一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫 苗的制备方法，将嗜水气单胞菌株及维氏气单胞菌株复壮后于28 °C下扩大培养，经 0. 2%的福尔马林灭活后，12000rpm离心，用无菌生理盐水洗涤细菌，将细菌浓度调整为 1.0乂101°(^11/ 1^;在均质匀浆机的搅动下，将海藻酸钠和上述灭活菌液以体积比1:1的 比例配成海藻酸钠一抗原乳浊液，其中海藻酸钠浓度为2. 0% W/V，搅拌温度为45°C，菌 胶比为1 :6,搅拌速度为600r/m/min，乳化时间为15min ;该乳池液经喷雾干燥机雾化后 直接喷入经磁力搅拌机搅动的含有2% CaClJ^ pH = 3的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 中，形成海藻酸钙微囊，经离心，收集海藻酸钙微囊；再将收集的微囊冷冻干燥后，封盖包 装；其中所述的海藻酸钙控释微囊包裹灭活嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的包封率为 (96. 31±0· 20) %，载菌量（2. 37±0· 36) X 108cfu/mg。
[0015] 优选的，上述的海藻酸钙控释微囊粒径为10. 35 μ m。
[0016] 上述抗原菌株的分离鉴定方法如下所述：
[0017] 嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌菌株，申请人自新乡市患细菌性败血病的病鱼体内 分离，其中嗜水气单胞菌32株，维氏气单胞力20株，冷冻干燥保存。根据攻毒试验中，每 组鲫鱼的死亡情况，并结合个菌株毒力因子的特点，筛选出了毒力因子多，毒性强的菌株作 为疫苗制备备用菌株：嗜水气单胞菌XDMG(l)，其LD 5tl为1.5X105cfu/mL。维氏气单胞菌 XDLG(I),其LD5tl为4. 5X 10 5cfu/mL。以上菌株均于2013年11月11日保藏于中国典型培 养物保藏中心（CCTCC)，其保藏号分别为CCTCC NO:M 2013566和CCTCC NO:M 2013565。取 样时间为2010年7月，地点：新乡，卫辉东湖，分别取自于麦穗鱼和鲢鱼的肝部。
[0018] 本发明选取豫北地区毒力因子多、免疫源性高、毒性强的嗜水气单胞菌及维氏气 单胞菌制成二联灭活口服缓释微球疫苗。采用甲醛灭活制备疫苗，对鲫鱼（30~35g)进行 口服免疫，进行血清抗体效价检测，病理切片分析和攻毒保护试验。结果表明，鲫鱼在经 口服免疫后，第3周即检测到凝集抗体，于第6周凝集效价达到高峰，而对照组在整个实验 过程均没有检测到抗体；病理切片也表明，该疫苗能够对鲫鱼靶器官产生很好的保护作用； 攻毒保护试验中，免疫组的免疫保护率达46. 7%。嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌灭活疫苗 对鲫鱼有显著的免疫保护效应，可作为预防细菌性败血症感染的疫苗。
[0019] 将所制备的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗与一定量的经 去水浸泡软化过的商品化鱼用饲料粉末混合后，压制成条，晾干，制成颗粒。
[0020] 免疫途径：口服免疫。对鱼群禁食24h后，将一定量的含有嗜水气单胞菌和维氏气 单胞菌二联口服缓释微球疫苗的鱼饲料颗粒投入水中，供鱼群自由采食。免疫剂量为：每 克体重的鱼投放微囊口服疫苗〇.2mg(即：每克体重的鱼免疫细菌5. OX IO7Cfu)。首免10 天后，进行二免，用法及剂量同前。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1.壁材来源广泛本研宄所使用的壁材为天然高分子材料，其来源广泛，价格低廉 且具有免疫增强