一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物疫苗制备技术，具体涉及一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联 灭活疫苗及制备方法。本发明的疫苗主要适用于淡水鱼类。
【背景技术】
[0002] 嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌（Aeromonas hydrophil)属于弧菌科、气单胞菌属， 广泛存在于淡水、土壤、污水、淤泥和粪便中，有致病性菌株和非致病性菌株之分。致病性菌 株感染谱十分广泛，可引起鳖、虾、蟹、蛙、鸭等的爆发感染，人类感染此菌可引起食物中毒 和软组织损伤感染，是淡水鱼类的主要病原菌。由该菌引起的细菌性败血症是我国养鱼史 上危害鱼种类最多、危害鱼年龄范围最大、流行地区最广、危害养鱼水域类别最多、造成损 失最严重的一种急性传染病之一。
[0003]目前对本病的治疗药物，主要为抗生素和化学药物，大量长期使用易产生耐药株， 而且化学药物会造成残留，污染水质，破坏生态平衡。所以，生产有效的疫苗是预防和控制 本病的关键。嗜水气单胞菌疫苗及其相关技术在近几十年的研究与推广应用中，取得了一 系列可喜的成绩。疫苗的种类也趋向于多样化，伴随着分子生物学和基因工程的出现和发 展，出现了诸如核酸疫苗，基因工程疫苗，合成肽疫苗等新型鱼用疫苗。但这些疫苗也存在 一些问题，如免疫效果不稳定、安全性较差、制备技术较困难、成本较高、缺乏合理有效方便 的给予方法等，因此，这些疫苗在实际生产中的广泛应用还存在一定的困难。
[0004] 嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌是异源的，由于不同菌株间生理生化性状、血清型、 基因型是有差异的，其致病性也由于它在表达毒力因子上的差异而不同，因而，在疫苗的普 及上受到局限。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭 活疫苗及制备方法。
[0006] 本发明的技术方案是：申请人制备了一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活 疫苗，该灭活疫苗含有保藏号为CCTCC N0:M 2013566的嗜水气单胞菌的抗原和保藏号为 CCTCC N0:M 2013565的维氏气单胞菌的抗原；所述抗原已灭活。所述嗜水气单胞菌的抗原 和维氏气单胞菌的抗原体积比是1: 1。
[0007] 申请人还提供了一种嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌二联灭活疫苗的制备方 法，包括以下步骤：将保藏号为CCTCC N0:M 2013566的嗜水气单胞菌和保藏号为CCTCC N0:M 2013565的维氏气单胞菌增殖培养后，收集菌体，加入磷酸缓冲液（PBS)至菌浓为 I X 10scfu/mL，然后加入终浓度为0. 2%的甲醛溶液，28°C摇床培养24h，嗜水气单胞菌和维 氏气单胞菌的含量均为50%，制得二联菌的灭活疫苗。
[0008] 上述抗原菌株的分离鉴定方法如下所述：
[0009] 嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌菌株，申请人自新乡市患细菌性败血病的病鱼体 内分离，其中嗜水气单胞菌32株，维氏气单胞力20株，冷冻干燥保存。根据攻毒试验 中，每组鲫鱼的死亡情况，并结合个菌株毒力因子的特点，筛选出了毒力因子多，毒性强 的菌株作为疫苗制备备用菌株：嗜水气单胞菌XDMG(I)AeromonashydrophilXDMG(I), 其LDm为 1.5X105cfu/mL。维氏气单胞菌XDLG⑴AeromonasveroniiXDLG(I),其LD50 为4. 5X105cfu/mL。以上菌株均于2013年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏地址：中国湖北省武汉市武汉大学。其保藏号分别为CCTCCN0:M2013566和 CCTCCN0:M2013565。取样时间为2010年7月，地点：新乡，卫辉东湖，分别取自于麦 穗鱼和鲢鱼的肝部。
[0010] 本发明选取豫北地区毒力因子多、免疫源性高、毒性强的嗜水气单胞菌XDMG(I) AeromonashydrophilXDMG(I)及维氏气单胞菌XDLG(I)AeromonasveroniiXDLG(I)制成 二联灭活疫苗。采用甲醛灭活制备疫苗，对鲫鱼（30~35g)进行腹腔注射，进行血清抗 体效价检测，病理切片分析和攻毒保护试验。结果表明，鲫鱼在经注射免疫后，第3周即 检测到凝集抗体，于第6周凝集效价达到高峰，而对照组在整个实验过程均没有检测到抗 体；病理切片也表明，该疫苗能够对鲫鱼靶器官产生很好的保护作用；攻毒保护试验中， 免疫组的免疫保护率达100%，且免疫保护期长达6个月以上。嗜水气单胞菌XDMG(I) AeromonashydrophilXDMG(I)及维氏气单胞菌XDLG(I)AeromonasveroniiXDLG(I)灭活疫 苗对鲫鱼有显著的免疫保护效应，可作为预防细菌性败血症感染的疫苗。
【附图说明】
[0011]图 1 是 3 株A.AeromonashydrophilXDMG(1)中aer(I)、alt(2)、ahp(3)以及 0-hly(4)基因的PCR扩增结果。
[0012] 图2三种来源苗菌株四种毒力基因相对表达1典型病鱼分离菌株2鱼源菌株3水 源菌株。
[0013] 图3各组血清抗体效价平均值。
[0014] 图4光镜下实验组与对照组鱼的肝脏、脾脏、肾脏、肠道组织的组织切片。
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明更易于理解，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。单本实施 例不是对本发明的限制。
[0016] 实施例
[0017] 1 材料
[0018] I. 1 菌株
[0019] 嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌菌株，自新乡市患细菌性败血病的病鱼体内分离， 其中嗜水气单胞菌32株，维氏气单胞力20株，冷冻干燥保存。
[0020] 1. 2试验动物
[0021] 健康鲫鱼购自新乡市郊某渔场，每条鱼质量约为30g，长度为12~15cm。使用前 先于实验室驯养1周，充气，控制水温28°C左右，定期清污换水、喂食。
[0022] 1. 3培养基
[0023] LB营养肉汤的配制：牛肉膏3. 0g，蛋白胨10. 0g，氯化钠5. Og,磷酸二氢钾I. 0g， 蒸馏水lOOOmL，混勾，加热溶解，调PH值至7. 6,分装，112kPa高压灭菌15min。
[0024] LB琼脂平板的配制：牛肉膏3. Og，蛋白胨10.0 g，氯化钠5. Og，磷酸二氢钾I.Og， 琼脂15g，蒸馏水lOOOmL，混匀，加热溶解，调PH值至7. 6,分装，112kPa高压灭菌15min，冷 却至45 °C无菌倾注平板。
[0025] 2 方法
[0026] 2. 1疫苗菌株的筛选
[0027] 2. I. 1毒力因子PCR检测及分型
[0028] 4种引物：气溶素（aer)、(6-溶血素（P-hly)、细胞兴奋肠毒素（alt)、丝氨酸胞 外蛋白酶（ahp)均由上海生工生物技术公司合成，其序列见表1。采用25 yL体系进行PCR 反应，模板浓度为30ng/ y L，琼脂糖凝胶进行电泳，检测4种毒力因子。
[0029] 表1 4种毒力基因PCR扩增引物序列及目的片段大小
[0030]
[0031] 2. L 2毒力因子的实时定量分析
[0032] 设计的4种毒力基因的实时定量引物（见表2)。筛选出毒力因子多的菌株，提取 RNA时行反转录合成cDNA，采用10 y L体系在PR0961101428实时定量PCR仪器上进行反应， 检测4种毒力因子的相对表达量。
[0033] 表2 4种毒力基因实时引物序列及目的片段大小
[0034]
[0035] 2. I. 3半数致死浓度（LDJ的测定
[0036] 实验室保存的菌株活化后，接种于营养肉汤28°C摇床培养16h。培养物利用血小 球计数板计数，每株菌的实验组分5组，每组10尾鱼，将菌液以10 \ 10 2, 10 3, 10 4倍比稀 释，每稀释度菌液腹腔注射鲫鱼，每尾注射〇.2mL，同时设生理盐水对照。实验鱼养于已消 过毒的水族箱里，自来水已曝气24h，充气，控制水温28°C左右，定期清污换水、投喂食物。 每天记录每组鱼的死亡情况，参考Reed-Muench法计算半数致死浓度（LDJ。
[0037] 2. 2全菌灭活疫苗的制备
[0038] 2. 2. 1菌种来源
[0039] XDLG(I)；XDMG(l)〇
[0040] 2. 2. 2菌种活化与扩大培养
[0041] 在无菌条件下从嗜水气单胞菌及维氏气单胞菌原菌种干粉中挑取少量菌苔，接种 于营养肉汤试管中摇床培养后，画线接种于琼脂平皿，28°C培养18 - 24h，生长出菌落，经 检查无杂菌后，再挑取单菌落接种于盛200mL营养肉汤培养基三角瓶中（pH 7.2)，28°C振 荡培养（振荡频率为120次/分一 130次/分），培养18 - 24h待用。
[0042] 菌种可继续用三角瓶进行扩大培养，接种量为10%，培养方法同菌种的培养，然后 加入终浓度为〇. 2%的甲醛溶液，28°C摇床培养24h，嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌的含量 均为50%，制得二联菌的灭活疫苗。但用摇床培养时，产量较低，因此一般采用发酵罐培养。
[0043] 种子罐培养
[0044] 发酵罐灭菌后冷却到28°C即可接种。在无菌条件下按1%的比例将制好的扩大菌 液接种于冷却到28°C的种子罐内进行培养。接种后控温28°C，压力为0.05MPa通气量1 :1 和220r/min搅拌条件下培养18 - 24h。接种后22h开始每隔2h取样一次检测，当菌体生 长整齐；处于对数生长期；含菌量为I X 10scfu/mL以上；无杂菌污染；pH 7. 0-7. 5。即可移 种至发酵罐内发酵培养。
[0045] 发酵罐培养
[0046] 在无菌条件下将种子罐的细菌培养液按1%的接种比例接种于冷却到28°C的发 酵罐内进行培养，培养条件及检测指标同上。当含菌量达到生产需要后，即可以发酵罐菌液 进行灭活。
[0047] 2. 2. 3 灭活
[0048] 将发酵罐内细菌培养液加入福尔马林，终浓度为0. 2%，28°C条件下灭活24h