mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其制备方法和CTL细胞的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其 制备方法和CTL细胞。
【背景技术】
[0002] 对肺癌的过继免疫治疗是将自身或异体的抗肿瘤效应细胞的前体细胞，在体外采 用IL-2、抗CD3单抗，特异性多肽等激活剂进行诱导、激活和扩增后，再转输给肿瘤患者，从 而提高患者抗肿瘤免疫力，以达到治疗的目的。目前在临床中使用最多的过继免疫细胞主 要是 DC(dendritic cell，树突状细胞）和 CIK(Cytokine_Induced Killer，细胞因子诱导 的杀伤细胞）。
[0003] 其中，DC是从骨髓组织、血液中分离得到，具有很强的捕获抗原、呈递抗原的能力 和分泌能力，能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应。在DC制备中为了使其具备肺癌 特异性的免疫能力，一般在DC培养时将肺癌肿瘤细胞灭活后刺激DC细胞，通过肺癌肿瘤细 胞携带的抗原信息刺激来提升DC的抗原提呈性能。但是这一种抗原刺激的方式存在不足， 首先本身肺癌细胞携带的抗原信息相对于肺癌全面抗原信息是不完整的，只能将一部分的 抗原信息传递给DC;其次，某种蛋白质的产生量不够的话，或者产生一些断裂蛋白的话，抗 原性又会更进一步降低；第三，由于肺癌细胞扩增能力远远强于DC，为避免在DC培养中肺 癌细胞造成DC生长受抑制而最终无法收获到DC的情形，对DC刺激之前要进行灭活，灭活 中很多的抗原簇被破坏掉了；所以现有针对肺癌培养得到的过继免疫的DC，引发的免疫反 应较弱，杀瘤能力不强。
【发明内容】
[0004] 本发明实施的目的在于克服现有的缺陷，提供一种肺癌抗原信息更全，且免疫反 应性更强的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗及其制备方法和CTL细胞。
[0005] 为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
[0006] -种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0007] 获取肺癌干细胞的mRNA ;
[0008] 将所述mRNA转染至DC中；
[0009] 将转染有所述mRNA的DC进行体外培养。
[0010] 在上述方法步骤的基础上，本发明还提出由上述方法直接制备得到的mRNA-DC肺 癌治疗性疫苗。
[0011] 本发明的方法过程，基于DC能够接受外源mRNA并进行翻译，且密码子具有通用性 的基础，以肺癌干细胞的mRNA导入后表达成抗原蛋白替换灭活蛋白刺激的方式对DC进行 刺激；其针对可能造成癌症复发并随血液转移到患者其他器官组织的肺癌干细胞，携带的 抗原信息更为全面；而且自行表达生成抗原蛋白还能避免外源刺激的抗原蛋白失活、断裂 等进一步会造成抗原信息缺失的不足；从而最终获得具有捕获、呈递抗原能力并能够诱导 持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应的DC。
[0012] 在上述mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的基础上，本发明进一步还提出将上述mRNA-DC 肺癌治疗性疫苗用于CTL技术中，与T淋巴细胞进行共培养获得的得到的细胞毒性T淋巴 细胞（简称：CTL细胞）。本发明所制备的CTL细胞，可以在MHC限制的条件下，直接、连续、 特异性的杀伤靶细胞，并且在杀伤靶细胞的过程中本身不受损伤，且适用于肺癌的类型更 多更广泛。
【附图说明】
[0013] 下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
[0014] 图1为本发明实施例制备mRNA过程中用Trizol法提取的总RNA后电泳检测结 果。（Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA，市面上均 有Trizol提取试剂销售。）
【具体实施方式】
[0015] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。
[0016] 本发明实例提出一种mRNA-DC肺癌治疗性疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0017] S10,获取肺癌干细胞的mRNA ;
[0018] S20,将肺癌干细胞的mRNA转染至DC中；
[0019] S30,将转染有肺癌干细胞的mRNA的DC进行体外培养。
[0020] 本发明的上述治疗性疫苗制备，以DC细胞免疫为基础，在DC的成熟和抗原刺激上 采用肺癌干细胞的mRNA转染的方式实现；经过对DC的试验和考察，其能够接受外源mRNA 并进行翻译，由于所有生物从最低等的病毒直至人类密码子具有通用性，翻译之后会得到 肺癌干细胞的抗原性蛋白，该蛋白可以对DC产生免疫刺激，从而最终获得具有捕获、呈递 抗原能力并能够诱导持久有力的特异性抗肿瘤免疫反应的DC。
[0021] 在本发明经过反复的试验和考量，步骤SlO选取用来对DC进行免疫刺激的物质为 肺癌干细胞的mRNA。在肺癌细胞所携带的表面抗原信息在不完整的情况下，经过分析，抗 原蛋白的上游是转录生成的mRNA。在代谢的过程中，mRNA是细胞体内携带了细胞全部"有 效"成分的最基本物质，mRNA通过转录合成，最后在细胞质中指导蛋白质的翻译过程；基本 上，mRNA在转录过程中提取了 DNA的信息，其自身也就负载了细胞的全部有效信息，所以细 胞内所有产生的蛋白基本上全部都涵盖在mRNA所携带的密码子信息中，所以在DC具备接 收外源mRNA并翻译的情形下，采用mRNA作为抗原刺激的物质对DC进行刺激，所能够得到 的肺癌的抗原信息较为全面。
[0022] 同时，本发明中采用mRNA来自于肺癌干细胞，相比其他普通的肺癌细胞的mRNA， 细胞的区别在于肺癌干细胞本身属于癌症干细胞的一类，具有"自我复制"以及"具有多细 胞分化"的性能，有更强的传播性；不仅造成原位癌的生长，还可以随血液移动，造成肿瘤的 扩散。在对比分析和试验之后，肺癌干细胞的mRNA转染进树突状细胞（DC)中，由于其细胞 的分化程度比较低，mRNA中所具有的肺癌抗原蛋白的信息类型比普通的肺癌细胞的mRNA 要均衡；刺激树突状细胞产生肿瘤免疫反应效果优于选用进行肿瘤免疫刺激的效果。所以 本发明采用肺癌干细胞的mRNA作为抗原性物质进行DC的诱导和成熟。
[0023] 进一步，步骤S20将步骤SlO所获取的携带有较为全面、均衡的肺癌信息的肺癌干 细胞的mRNA进行转染；转染的过程是使将肺癌干细胞的mRNA导入至DC中。转染的操作过 程需要注意的是，转染操作过程时间尽量加快，并且保证确认无RNase污染的，且也尽量避 免和质粒DNA转染混用。不过由于本发明中提取的mRNA是人的肺癌干细胞的mRNA，真核的 哺乳动物的mRNA分子带有5'端帽子结构和3'端PolyA尾巴，此外还有成为IRES (internal ribosomal entry site，内部核糖体进入位点序列）的核糖体结合区，这些结构或者有助于 提高mRNA的稳定性；所以，在保证无RNase污染和无菌条件下仔细一点进行转染操作，基本 上就能得到比较好的结果。
[0024] 同时，虽然实施过程中，真核mRNA具有上述自身的稳定修饰结构，但是本身mRNA 的稳定性不如双螺旋的DNA高，转染之后还有一点需要担心的是DC细胞自身很可能会对 这一外源性的mRNA进行免疫攻击，对其进行破坏和降解，最终导致转染后的mRNA所携带 的抗原信息无法翻译和表达；所以基于这一情形，本发明中采用在转染之前，即步骤S20之 前、步骤SlO之后，将步骤SlO获得的肺癌干细胞的mRNA进行稳定性修饰，修饰的方法为将 mRNA分子上的尿嘧啶进行修饰，成为1-甲基假尿嘧啶。经过该甲基修饰和替换后的mRNA 可以避免DC启动具有潜在危险性的炎性免疫应答反应，有效的避开了 DC的防御系统，增强 了 mRNA在DC内的稳定性，甚至能够选择这种导入后持续的周期。
[0025] 当然，在该步骤S20中经过反复的实验和考察，mRNA转染的用量必须要控制，因为 mRNA的量决定了转染复合物的结构和净电荷，以及是否容易被细胞膜吸附和内吞；mRNA的 量如果少了固然表达不好，太多也会对DC细胞有毒性的问题。当然，如果转染过程对细胞 没有太大影响，将mRNA和细胞共同孵育的时间越长越好。所以基于上述情形，本发明中在 转染的过程中，按照2. 5xl06~5x106数量的DC细胞个数，用mRNA转染量为50 y g~250 y g 的量比范围进行转染，即mRNA转染量：DC细胞个数的比例为1x10 5~1x10 4Ug/个）。通 过反复的考量和验证，在该大致的对应转染范围量下，转染之后DC自身的生长代谢还比较 正常，之后进行培养过程中肺癌干细胞mRNA也能进行良好地翻译和表达。而进一步加大转 染的量之后，再将DC进行培养的过程中，肺癌干细胞mRNA的表达量增大，加大了 DC自身的 生长代谢的负担使得DC生长逐渐受到抑制，持续一段时间之后就基本就走向死亡了。
[0026] 同时，由于本身DC在转染之后仍然需要保持或者维持其细胞性状，在转染的过程 中经过研究，如果采用转染试剂与mRNA形成复合体进行转染，转染试剂之后一直会结合在 DC的细胞膜上，持续影响DC的细胞膜结构，不利于保持DC的代谢活性。所以在本发明中 该步骤S20的转染过程采用电转染的方式进行，通过脉冲电压在DC细胞膜上产生mRNA导 入孔而进行导入。当然，相比转染试剂转染的方式，电转染在脉冲电击时对细胞的伤害比较 大，但是比较短暂，持续性比较低，后续细胞膜本身流动性自动修复以后基本上性状和代谢 情况影响不大。同时，为了进一步减低电击中对细胞的影响，采用于4°C的温度下用700~ 800V的电压脉冲时程200~250 y s进行瞬间稳定转染，这样将电击细胞的伤害减到最小。
[0027] 步骤S20的转染过程结束之后，步骤S30将导入有肺癌干细胞的mRNA的DC进行 培养，在培养的过程中肺癌干细胞的mRNA在DC内翻译成抗原蛋白，从而刺激DC产生免疫 应答，进行抗原信息的负载，得到肺癌细胞的靶向杀伤功能。
[0028] 在该步骤S30中DC培养采用含8~12%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37°C、 5% 0)2培养箱中培养至DC细胞性状成熟后，收获细胞即可。
[0029] 本发明的治疗性疫苗制备过程，以肺癌干细胞的mRNA导入后表达成抗原蛋白替 换直接用灭活抗原的方式，作为抗原刺激物对DC进行刺激；首先，针对的不是普通的肺癌 细胞而是可能造成癌症复发并随血液转移到患者其他器官组织的肺癌干细胞，携带的抗原 信息更为全面；而且自行表达生成抗原蛋白还进一步避免了外源刺激的抗原蛋白失活、断 裂等进一步会造成抗原信息缺失的不足。
[0030] 在上述mRNA-DC肺癌治疗性疫苗制备方法的基础上，本发明进一步还提出一种有 上述方法制备的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗，根据上述制备方法收获到的实质上是DC免疫细 胞。其细胞由于收到的抗原刺激信息更加全面和多样，所以细胞具有更加完整和多样的表 面抗原表型，具有更强的免疫疫苗反应效果。
[0031] 而进一步，本发明由于上述制备得到的mRNA-DC肺癌治疗性疫苗实质上是DC免疫 细胞，因此具体使用时可以借助