一种基于大气压低温等离子体灭活病毒的疫苗制备方法与流程

本发明涉及一种灭活病毒的疫苗制备方法，属于生物技术领域。

背景技术：

疫苗是指为了预防、控制传染病的发生、流行，用于防控机体被病原体感染的生物制品。疫苗的发现可谓是人类发展史上一件具有里程碑意义的事件。疫苗被认为是20世纪最重要的公共卫生成果之一。在未来的5到15年中,新疫苗和新疫苗接种技术将从根本上改变医生预防及治疗疾病的方式,对公共卫生产生巨大影响。传统疫苗有灭活疫苗和减毒疫苗，减毒疫苗存在着再次感染的威胁，传统灭活疫苗因主要基于甲醛灭活方法而会带来机体对疫苗的过敏反应，严重的情况时会导致接种者伤残甚至死亡。同时甲醛的过量使用会给制备疫苗操作者带来健康威胁。因此一种安全无毒且高效的灭活疫苗制备方法对于保护机体，保护操作者以及提高疫苗产业经济效益具有重大意义。

低温等离子体是继固态、液态、气态之后的物质第四态，当外加电压达到气体的着火电压时，气体分子被击穿，产生包括电子、各种离子、原子和自由基在内的混合体。等离子体可分为不同的类别：按热力学平衡分类，等离子体可分为热平衡等离子体和非热平衡等离子体；按系统温度分类，等离子体分为低温等离子体和高温等离子体。热平衡等离子体中所有粒子的温度都一样，宏观上表现为高温等离子体。在非热平衡等离子体中，电子的温度可高达数万度，而离子和中性粒子的温度远小于电子温度，整个体系呈现低温状态，所以也称为低温等离子体。低温等离子体存在着大量的、种类繁多的活性粒子，因此非热平衡等离子体可作为高活性反应物应用于多种实际应用中。已有大量研究证明大气压低温等离子体在灭活细菌、真菌、病毒等病原体具中有卓越的效果。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种物理无毒副作用的灭活病毒制备疫苗的技术方法，本发明采用低温大气压空气等离子体有效灭活病毒，并保留了病毒的免疫原性，进一步辅以佐剂制备病毒疫苗。

本发明提供的一种基于低温大气压空气等离子体灭活病毒并制备疫苗的方法，包括如下步骤：1)向低温等离子体发生装置中通入气体，然后打开电源，激发产生等离子体；2)用激发的大气压低温等离子体处理病毒液，对病毒进行灭活；3)用灭活的病毒病原体制备灭活病毒疫苗；

本发明中，所述病毒疫苗是由大气压低温空气等离子体灭活病毒制备而成。

本发明中，所述大气压低温空气等离子体由电驱动，电驱动可以为直流电，也可以为交流电。

上述方法中，所述的驱动电压参数为0.5-10KV，电流为2-2.5A；

所述大气压低温空气等离子体的频率可为20-100kHz；

上述方法中所述的病毒病原体可以为新城疫病毒(NDV LaSota strain)、禽流感病毒(H9N2AIV)。

上述方法中所述的等离子体与病原体溶液的作用时间范围为30秒-10分钟。

上述的方法中，所述大气压低温空气等离子体采用直流，交流或脉冲电源。

本发明具有以下优点：

本发明采用大气压低温空气等离子体技术处理新城疫病毒和禽流感病毒，有效灭活病毒且保留病毒免疫原性，无毒、无刺激、无异味，有效避免甲醛灭活病毒遗留的毒副作用的不足的问题，同时大气压低温空气等离子体技术装置耗能低，操作简便，有效降低生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例中采用的大气压低温空气等离子体的装置图。图1说明：(a)1.电阻2.高压电源3.高 压铜电极4.绝缘陶瓷5.外部铜电极6.空气气流7.装有病原体溶液的烧杯8.等离子体束；(b)1.空气气流2.绝缘管3.高压电源4.高压电极5.等离子体流；(c)1.空气气流2.绝缘管3.高压电源4.高压电极5.等离子体流

图2为本发明实施例1中大气压低温空气等离子体对病毒的灭活过程。

图3为本发明实施例1中检测灭活病毒免疫原性。

图4为本发明实施例1中鸡的攻毒实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、灭活新城疫病毒NDV LaSota并制备疫苗的方法

病毒采用SPF鸡胚尿囊液进行培养；

1、将NDV LaSota毒株(来自于北京市农林科学院)感染9-11日龄的无特定病原体(SPF)鸡胚。收集尿囊液，低速离心。收集的病毒在使用前保存在-70℃.

2、在等离子体灭活病毒的实验中，首先在37℃解冻10mL含有NDV的尿囊液，然后用低温等离子体分别处理2min，4min，6min。

3、等离子体处理过程中，病毒液置于等离子体激发装置下1-3cm距离，开启电源激发等离子体，使等离子体与病毒液相互作用。未经过处理含有NDV的尿囊液分别作为对照。

4、采用传统的鸡胚致死实验和红血球凝聚分析来判断等离子体对病毒的灭活情况。油佐剂分别与等离子体和甲醛处理后的病毒抗原相混合便可以制成疫苗。pH调整到7。

5、观察胚致死现象，不同的方法处理病毒后，注射到11日龄的含胚鸡蛋中。每24h，进行照蛋器检查，并且记录，直到鸡胚长至120h。死亡鸡胚冷藏在4℃。

6、红细胞凝集试验(HA)，从鸡胚中收集的尿囊液与血清的反应实验在V型微孔平板中进行。

7、评估疫苗的有效性，150个SPF28日龄的鸡被标记，然后随机分到10个组中，包括生理盐水组，甲醛处理NDV组，等离子体处理NDV2min组，等离子体处理NDV4min组，等离子体处理NDV6min组，每组15只鸡。所有的接种疫苗组接种0.2mL的疫苗。免疫原性的测定中的血清来自于第0天，第7，14，21天鸡的翅脉。通过红血球凝聚抑制试验，检测NDV特定抗体的存在。

8、鸡的攻毒实验，为了决定等离子体处理后的抗体的保护作用，在皮下接种疫苗后21天，NDV组中鸡注射具有胚致死毒性的NDV0.5mL。之后每24h拍照，并将死亡的鸡冷藏于4℃下。气管和前胃进行解剖和分析。检测10天内的临床症状和死亡数。

实施例2、灭活禽流感病毒H9N2AIV病毒并制备疫苗的方法

病毒采用SPF鸡胚尿囊液进行培养；

1、将H9N2AIV毒株(来自于北京市农林科学院)感染9-11日龄的无特定病原体(SPF)鸡胚。收集尿囊液，低速离心。收集的病毒在使用前保存在-70℃.

2、在等离子体灭活病毒的实验中，首先在37℃解冻10mL含有AIV的尿囊液，然后用低温等离子体分别处理1min，2min，3min，4min。

3、等离子体处理过程中，病毒液置于等离子体激发装置下1-3cm距离，开启电源激发等离子体，使等离子体与病毒液相互作用。未经过处理含有AIV的尿囊液分别作为对照。

4、采用传统的鸡胚致死实验和红血球凝聚分析来判断等离子体对病毒的灭活情况。油佐剂分别与等离子体和甲醛处理后的病毒抗原相混合便可以制成疫苗。pH调整到7。

5、观察胚致死现象，不同的方法处理病毒后，注射到11日龄的含胚鸡蛋中。每24h，进行照蛋器检查，并且记录，直到鸡胚长至120h。死亡鸡胚冷藏在4℃。

6、红细胞凝集试验(HA)，从鸡胚中收集的尿囊液与血清的反应实验在V型微孔平板中进行。

7、评估疫苗的有效性，150个SPF28日龄的鸡被标记，然后随机分到10个组中，包括生理盐水组，甲醛处理AIV组，等离子体处理AIV1min组，等离子体处理AIV2min组，等离子体处理AIV3min组，等离子体处理AIV4min组，每组15只鸡。所有的接种疫苗组接种0.2mL的疫苗。免疫原性的测定中的血清来自于第0天，第7，14，21天鸡的翅脉。通过红血球凝聚抑制试验，检测AIV特定抗体的存在。