一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种禽流感复合灭活疫苗的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)属于正粘病毒科、流感病毒属、A型流 感病毒。AIV感染禽类后可引起一种以呼吸系统乃至全身性败血症为特征的传染性疾病， 即禽流感(Avian infIuenza，Al)。AI不仅可以在家禽中传播，严重影响畜牧养殖业的生存 和发展;而且还可以由家禽传给人类，直接威胁人类的健康，对人类造成极大危害。在20世 纪，人类历史上共暴发了 4次世界性流感大流行，其中以1918年暴发的"西班牙流感"对人类 社会的危害最大。据不完全统计，那次世界性流感大流行至少夺去了 2000多万人的生命，被 感染者多达2亿。禽流感之所以能多次大流行与禽流感病毒表面抗原成份频发的变异有很 大关系，抗原的变异使得禽流感病毒可以逃逸机体的免疫防御，而且使许多应用中的疫苗 失去防御效果。随着分子生物学的发展，人们对禽流感病毒分子结构、免疫原性及抗原变异 的分子基础都有了较深入的认识，并且随着对禽流感病毒分子生物学特性的了解及深入， 相应的开发出了一些更加安全有效的疫苗，由于禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异频繁， 使得机体不能有效防御病毒的侵袭，同时这也为疫苗的研究开发提出了严峻的考验。目前 虽然已有多种疫苗应用于禽流感的防治，但他们的防御效果距离人们的期望水平还有差 距，所以人们还在不断研发更加行之有效的产品。但无论那种疫苗都有其自身的优缺点。
[0003] 目前商品化禽流感疫苗大都为灭活疫苗，该种疫苗具有制备工艺简单、免疫效果 确实、免疫持续时间较长等特点，已被许多国家地区使用，并且在预防和控制禽流感暴发中 起到一定的积极作用。
[0004] 到目前为止我国对家禽疫病的预防措施仍然是以疫苗接种为主，辅以其它方法但 是所用的疫苗以常规疫苗占主导，包括灭活苗和弱毒或无毒活苗，而且多为单苗，在规定的 免疫程序中需进行多次免疫接种，这不仅浪费人力物力，而且易引起家禽的应激反应，造成 生产力的下降和抗病力降低。
[0005] 水包油包水乳化佐剂具有铝胶佐剂、水包油佐剂和油包水佐剂的特点，与油包水 乳化佐剂相比，其制备疫苗所需要的抗原浓度大大降低，另外因其具有水包油佐剂的特性， 使得其可以添加水溶性的免疫增强剂、中药多糖和镇痛剂(维生素），在疫苗免疫机体时可 以缓解疼痛，减少动物应激，同时免疫增强剂、中药多糖还具有提高免疫效果，预防疾病等 功能。
[0006] 卵黄抗体（IgY)分子的结构与哺乳动物免疫球蛋白类似。卵黄抗体作为一种具有 生物学活性的免疫球蛋白，在生产，加工，储存以及摄食及消化过程中，保持抗体的活性是 关键的。多项实验表明鸡IgY具有良好的稳定性、耐酸、耐热。IgY在室温中保存6个月，其中 和病毒能力无明显改变。李春晖等(2002)研究了胃蛋白酶对抗狂犬病毒IgY活性的影响。结 果表明IgY经胃蛋白酶酶解24h后仍保持中和抗原的作用，其酶解片段也具有抗体活性。卵 黄抗体在生产上还具有无可比拟的优越性。首先，产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是 高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。其 次，收集鸡蛋方便，无需采血，无损伤，符合现代动物保护规则。欧洲替代方法验证中心 (ECVAM)建议以IgY代替哺乳动物IgG作为实验和生产抗体的来源。第三，每个蛋大约含 IOOmg以上的IgY，一个月可达3g相当于兔子的10-20倍;卵黄中没有其他的Ig，易于提纯。第 四，由于受到卵黄的保护，鸡蛋贮存在4°C条件下6个月，IgY活性损失很小。所以可待蛋收集 到一定量时再进行大规模地提纯IgY。
[0007] 黄酮类化合物是自然界中存在的多元酚类物质，也是自然界药用植物中的主要活 性成分之一。它是指具有15个碳原子并以C6-C3-C6的方式构成的三环天然有机物，是植物 在长期自然选择中产生的二级代谢产物，现在已分离鉴定的有4000多种。它广泛存在于果 蔬、中草药中，无毒副作用，它具有显著的清除机体内自由基、抗老化、抗突变、调血脂降血 压等药理保健功能，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂，这些抗氧化活性物质可以 减少和清除机体内自由基，具有预防疾病的作用。
[0008] 法氏囊素(bursin，BS)是从禽类特有的体液免疫中枢淋巴器官法氏囊(Bursa Of fabricius)中分离出来的一种活性三肽物质，其结构为L-LyS-His-Gly-NH2。研究表明，BS 能促进禽类和哺乳动物B淋巴细胞前体的分化、增殖，能提高B细胞系Daudi细胞内第二信使 cAMP和cGMP水平，加快B细胞内DNA转录成mRNA的速度，促进B细胞内蛋白质的生成，从而使B 细胞产生和分泌抗体能力加强。
[0009] 本发明基于上述技术背景，提出一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，该疫苗由 禽流感灭活抗原，加适量含免疫增强剂制成，剂型为水包油包水型。通过该方法制备的复合 灭活疫苗，因其拥有水包油，油包水两种特性，使得水溶性的卵黄抗体、法氏囊素、中药黄酮 等免疫增强剂与镇痛剂易于溶解，利于动物机体吸收，免疫时可降低动物应激，减少动物痛 苦，可提高动物福利；同时免疫增强剂可大大提高活疫苗的细胞免疫，迅速提高机体抗体水 平，产生较高的中和抗体，大幅提高保护率。
【发明内容】
[0010] 针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种禽流感复合灭活疫苗 的制备方法的技术方案，采用本方法制备疫苗，可提高疫苗质量，大幅度提高疫苗。
[0011] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于包括以下工艺步骤： 1) 灭活病毒悬液制备 采用禽流感病毒稀释液稀释禽流感病毒至5000-10000倍，接种9-10日龄鸡胚，0.1-0.15ml/胚，36-37°C继续培养至96小时，弃去48小时前死亡鸡胚，收获48-96小时死活胚液， 既得禽流感病毒混合病毒液； 2) 禽流感复合灭活疫苗制备 将步骤1)中得到的病毒液进行无菌检验、病毒含量测定，检验合格后进行甲醛灭活，灭 活检验合格后，在每1000 ml灭活检验合格的禽流感病毒抗原液中加入1~2份免疫增强剂混 合均匀，然后与桑米特家畜水包油包水佐剂按体积比3:2进行乳化分装制成禽流感复合灭 活疫苗。
[0012] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中禽流感 病毒稀释液为每1000 ml磷酸缓冲液中含有以下重量配比的组分:氨基酸组合5~10g、复方 中药黄酮5~20g和脂质体10~20g，所述的氨基酸组合包括甘氨酸、烟酰胺、亮氨酸和抗坏 血酸，所述的复方中药黄酮由黄连、苦参、椿白皮、白薇、龙胆草和夏枯草提取得到。
[0013] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中每份免 疫增强剂含有中药黄酮10~30g、卵黄抗体6~IOg和法氏囊素5~15mg。
[0014] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的氨基酸组合含有 以下重量百分比含量的氨基酸:甘氨酸10~40%、烟酰胺20~40%、亮氨酸30~60%和抗坏血 酸10~30%。
[0015] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的复方中药黄酮按 以下步骤制得： a、 按黄连20~40份、苦参5~20份、椿白皮10~30份、白薇5~20份、龙胆草10~30份和 夏枯草10~30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量15倍的纯 化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小时，熬制过程中每10分钟搅拌一次； b、 弃去a中药渣，收集药液，室温冷却后经1000 Orpm离心10分钟，弃去沉淀，收集上清； c、 将b中上清进行醇沉，上清即得粗制中药黄酮； d、 将c中粗制中药黄酮进行减压真空浓缩，浓缩物用次灭菌注射用水稀释清洗，再次进 行减压真空浓缩，如此三次后，最后经0.22um滤膜过滤除菌，然后经冷冻真空干燥即得到复 方中药黄酮。
[0016] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的脂质体通过以下 步骤制得:按大豆卵磷脂3重量份和甘氨胆酸1重量份称取大豆卵磷脂和甘氨胆酸，用氯仿 进行溶解，并使其混合均匀，并通过减压法去除溶液中氯仿，制备脂质体膜;配制PH值为7.0 ~8.0、浓度为0. lm/1的枸橼酸和0. lm/1的枸橼酸钾缓冲溶液，将该缓冲溶液加入到脂质体 膜溶液中，脱水后用匀浆机制备成脂质体。
[0017] 所述的一种禽流感复合灭活疫苗的制备方法，其特征在于所述的中药黄酮通过以 下步骤制得： a、 按金钱草10~30份，穿心莲10~30份，地锦草20~40份，金银花10~20份，白头翁10 ~30份，半边莲10~30份称取各中药原料，切碎、洗净后用冷水浸泡过夜，再加入原料重量 15倍的纯化