一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡新城疫病毒、传染性支气管 炎、禽腺病毒三联灭活疫苗。
【背景技术】
[0002] 鸡新城疫具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养 殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。
[0003] 鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis, IB)感染可导致雏鸡、肉鸡发育缓 慢，产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE将其列为B类疫病。
[0004] 通过对I群禽腺病毒的流行病学调查，该病在我国鸡群中发病率较高，可通过水平 和垂直两种途径传播，且呈逐年上升趋势。发病的宿主范围也越来越广，白羽肉鸡、肉种鸡、 蛋鸡、黄羽鸡均可感染发病，特别是2010年以后发病呈现增加趋势，在全国范围内均有流 行。许多I群禽腺病毒可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但是I群4型 禽腺病毒例外，可直接引起鸡群发病，主要病变表现为心包积液和肝、肾肿大，本病于1963 年首次在美国发生，随后在世界各地相继出现，是全世界家禽和野禽常见的传染病原。1976 年我国台湾省首次发生本病，之后全国各地均有发生本病的报道，且呈逐年上升趋势，给鸡 养殖业带来严重的危害。
[0005] 近些年来，鸡新城疫、传染性支气管炎是较为常见的严重威胁家禽的2种重要疾 病;而鸡群对I群4型禽腺病毒的感染愈来愈多，此病很容易引起继发感染疫病，给禽业养殖 户带来很多烦恼，而且多次使用疫苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时 多次抓鸡的注射应激，还会影响生产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来毒株 的不断变异，使得虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面，所以 需要筛选获得新的流行毒株来应对变异所造成的新的危害。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种鸡新城疫病毒、传染性支气管炎、禽腺病毒三联灭活疫 苗，从而弥补现有技术的不足。
[0007] 本发明的三联灭活疫苗，其中抗原为灭活的鸡新城疫病毒、传染性支气管炎和禽 腺病毒；
[0008] 其中鸡新城疫病毒优选为鸡新城疫病毒La Sota株；
[0009] 其中传染性支气管炎病毒优选为传染性支气管炎病毒M41株；
[0010] 禽腺病毒为I群4型禽腺病毒YBAV-4株，其保藏编号为CCTCC NO.V201541。
[0011] 上述的灭活疫苗，其中病毒的灭活采用甲醛灭活；
[0012] 本发明的灭活疫苗的制备方法如下：
[0013] 1)油相制备：
[0014] 取矿物油95份，硬脂酸铝1份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80°C后，再加5份 司本80(Span-80)，至温度达到115°C时维持40分钟，冷却后完成油相制备；
[0015] 2)水相制备：
[0016] 将灭活的新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、I群禽腺病毒毒液混合;取混合 抗原液95份，灭菌的5份吐温80，充分混匀；
[0017] 其中新城疫病毒液、传染性支气管炎病毒液、I群禽腺病毒的数量比优选为1:1:2;
[0018] 3)乳化
[0019] 取油相2份放入乳化罐中，加入水相1份后，再以3500r/min搅拌30~40分钟完成乳 化制备。
[0020] 本发明的疫苗所使用的I群4型禽腺病毒YBAV-4株新毒株的TCID5O效价高、免疫原 性好并能抵御禽腺病毒病各地方分尚毒的攻击。本发明制备的疫苗的安全性良好，未出现 由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数 据的分析，结果与同类产品的单苗相比较，三联苗无明显差异，均稳定有效;效力试验结果 证明，三联苗和三种单苗抗体均保持高水平，比同类产品产生抗体快，而对照组抗体为阴 性。
【具体实施方式】
[0021] 申请人筛选获得了一株新型变异的I群4型禽腺病毒，将该病毒与鸡新城疫病毒、 传染性支气管炎一起来制备联合疫苗，从而促成了本发明。
[0022]下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0023] 实施例1:YBAV_4株毒株的筛选
[0024] 1、流行病学调查自2010年以来，山东、江苏等地区的部分肉种鸡、蛋鸡及麻鸡出现 了一种以死亡率高，解剖主要表现为肝脏肿大、心包积水为特点的疾病，经临床调查和实验 室检测，初步诊断为I群C-4型禽腺病毒引起的心包积水肝炎综合征。2010年，发明人从山东 淄博某养殖场有包涵体肝炎和心包积水典型症状的病死鸡肝脏中成功分离到1株病毒。 [0025] 2、病毒分离取病死鸡的肝脏研碎后，用按1:5的比例加入灭菌生理盐水制成悬液； 反复冻融3次后，3000r/min离心30min，取上清;加入青霉素和链霉素各10000IU/ml，4°C过 夜，经微孔滤器过滤，无菌检验合格后保存备用。将上述制备的病毒液以0.2ml/胚的剂量， 经卵黄囊途径接种6.5日龄SPF鸡胚，弃24h内死胚，取接种48h~168h内死亡鸡胚的尿囊液 和胎儿，用上述方法处理后连续传代，观察第3代死胚的肝组织，鸡胚表现为死胚、胚体矮 小、发育迟缓、胎儿卷曲、肝脏肿大和质脆，胚胎充血。收集死胚尿囊液和胎儿，一20°C保存。 [0026] 3、病毒的鉴定
[0027] 3.1血凝特性鉴定无菌采集SPF鸡和鸭血液5~10ml，反复洗3~5次，末次用生理盐 水将血细胞泥稀释成0.8 %、1 %和2%浓度，4°C保存备用。按常规方法检测分离毒株是否具 有凝集这些红细胞的特性。同时设m群禽腺病毒EDSV-76为凝集反应阳性对照。结果:分离 毒不能凝集SPF鸡和鸭红细胞，即使改变红细胞的浓度，也不能使之凝集。m群禽腺病毒 EDSV-76能够凝集鸡、鸭的红细胞。
[0028] 3.2理化特性检验参照《动物病毒学》介绍的方法，病毒液分别以5-溴尿嘧啶-2 ' - 脱氧核苷(BUDR)、氯仿、乙醚、盐酸(pH3)、氢氧化钠(pHIO)、温度(60°C、lh)处理后，接种鸡 胚(0.2ml/胚），另设生理盐水处理组作为对照。接种5d后观察鸡胚病变。结果:分离毒分别 经BUDR、氢氧化钠(pHIO)和60°C、lh处理后，接种鸡胚，鸡胚表现正常，PCR检测阴性。表明 BUDR能抑制病毒在鸡胚中的复制，分离毒株的核酸类型为DNA，病毒不耐碱，对热敏感，60 °C，Ih可被灭活。而经乙醚、氯仿和盐酸(pH3)处理的毒株，不影响病毒在鸡胚中的增殖，出 现明显的鸡胚病变，PCR检测结果阳性。表明病毒没有脂质囊膜，对乙醚和氯仿有抵抗力，耐 酸。
[0029] 3.3血清学鉴定
[0030] 3.3.1群特异性鉴定利用琼脂凝胶扩散试验(AGP)制备琼脂凝胶平板对分离毒株 进行群特异性鉴定。琼脂凝固后，用打孔器打孔，打孔图案为中央1孔四周6孔，孔径4mm，孔 距为4mm，孔底封闭。待检病毒置于中间孔，周围孔加 I群禽腺病毒标准株、EDSV-76京911株 标准阳性血清及阴性血清。将琼扩板放置于加盖湿盒中37°C作用，24~48h观察是否出现凝 集沉淀线。结果:分离毒抗原仅能与I群禽腺病毒4型阳性血清出现明显沉淀线，而与m群禽 腺病毒H)SV-76京911株标准阳性血清及阴性血清之间均未出现沉淀线。
[0031] 3.3.2型特异性鉴定I群禽腺病毒1~12型标准阳性血清首先作1:10稀释，再按 2010年版《中国兽药典》附录固定病毒稀释血清法，将I群禽腺病毒1~12型标准毒株、分离 毒对I群禽腺病毒1~12型标准阳性血清进行交叉中和试验，记录中和效价结果。结果:分离 毒测4型标准阳性血清的中和效价（1: 501)与4型标准毒株测4型标准阳性血清的中和效价 (1:537)较接近;分离毒株测其它型标准阳性血清的中和效价均在1:10以下。表明分离株是 血清4型。
[0032] 3.4PCR检测及基因测序病鸡肝脏无菌研磨，反复冻融3次，利用柱式动物DNA提取 试剂盒提取病毒DNA，进行PCR检测。1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。将阳性样品进行Hexon基 因测序，并进行遗传进化分析。根据Hexon基因序列比对和遗传进化分析结果可以看出，分 离毒与I群禽腺病毒属于同一分支，与血清4型同源性最接近，但也存在序列上的差异;与血 清6型、7型、8a和8b型同源性更低。
[0033]该病毒株于2015年10月15日保藏于武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保 藏编号为CCTCC NO.V201541。
[0034] 实施例2:YBAV_4株毒种的制备 [0035]