一种基于生物发光法测定斑马鱼m受体水平的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，步骤包括：取斑马鱼组织上清液将GDP和GMP转化为GTP；将ATP和UTP破坏掉；将GTP转化为ATP；检测ATP并进行数据处理计算得出斑马鱼M受体水平变化。本发明首次提出基于生物发光法检测斑马鱼M受体的含量变化，无需测定M受体蛋白含量，该方法灵敏度高、稳定性好、不需要复杂设备；本发明操作简单快捷、特异性高、成本低，从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制，再结合斑马鱼行为变化方面的研究，最终实现对水质的实时在线评估与监测。
【专利说明】
一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法
技术领域
[0001]本发明属于生理生态学技术领域，具体涉及一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着经济的快速发展，水污染问题日益突出，严重影响生态环境的平衡和稳定。斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，近年来，众多研究显示斑马鱼应用于环境毒理学研究中有其独特的优势，斑马鱼已逐渐成为环境毒理学家们的新宠，利用斑马鱼对水环境污染物进行快速监测已成为目前研究的热点。
[0003]目前，人们通常依据对斑马鱼死亡率、畸形率、体长、体重、躯体质量指数(BMI)等进行测定，然而斑马鱼的生物的病理损伤或死亡往往较为滞后，难以发挥快速监测的作用。近年来，有越来越多的研究指出鱼类对污染物的适应反应从神经内分泌活动变化开始，而M受体(毒蕈碱型受体)作为神经递质乙酰胆碱的受体，其蛋白含量变化必然受到污染物的影响。因此，对斑马鱼M受体蛋白活性的测定可实现对水环境污染物的快速监测。
[0004]然而，目前对M受体蛋白活性的测定主要集中在大鼠、小鼠、电鳐这些物种上，方法主要是放射结合分析法、Western Blotting、ELISA等，这些方法普遍存在技术步骤繁琐、耗时长、试剂价格昂贵、对实验人员人体有潜在危害等缺点，而目前尚没有明确的方法能对斑马鱼M受体的蛋白含量进行测定，而且由于M受体蛋白组织和种属之间存在差异性，因此测定M受体蛋白含量的方法并不具有普适性，所以亟需研发一种灵敏、快速、简便的测定斑马鱼M受体水平的方法。
【发明内容】
[0005]为解决现有技术中的上述技术问题，本发明人通过研究发现由于斑马鱼M受体属于G蛋白偶联受体，参与细胞信号转导过程，其在信号传导时会消耗GTP，当斑马鱼暴露在环境中污染物之后，作为G蛋白偶联受体的M受体蛋白水平会发生相应变化，此时细胞GTP水平同样会发生变化，因此可以通过GTP水平变化来反映M受体水平变化。本发明即是将GTP转化为ATP通过生物发光法来检测ATP含量，从而实现对GTP的检测，进而测定出斑马鱼M受体水平变化。
[0006]具体的，本发明涉及以下技术方案:
[0007]本发明提供一种生物发光法在测定斑马鱼M受体水平中的应用。
[0008]此外，本发明还提供一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，该方法步骤简单，检测结果准确，能够快速测定斑马鱼M受体水平，包括如下步骤:
[0009]取斑马鱼组织上清液将GDP和GMP转化为GTP ；将ATP和UTP破坏掉；将GTP转化为ATP;检测ATP并进行数据处理计算得出斑马鱼M受体水平变化。
[0010]具体的，一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，步骤包括:
[0011 ] (I)将斑马鱼组织破碎，低温离心处理，取上清液，将上清液等量置于A、B、C三个孵育管中；
[0012](2)将步骤(I)得到上清液中的GDP和GMP转化为GTP;更具体的，首先向各孵育管加入一定量的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的两性离子缓冲液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物质，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鸟苷酸激酶，各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积;将反应混合物孵育再沸水浴终止反应，然后将装有反应混合液的孵育管置于冰块中冷却；
[0013](3)破坏各反应混合液中的ATP和UTP，具体的，从步骤(2)的各孵育管中的混合液中取一定量混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸盐，葡萄糖，NADP+，两性离子缓冲液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶;各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积;将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间后再置于冰块中冷却一定时间；
[0014](4)将各反应混合液中的GTP转化为ATP;具体的，从步骤(3)的各孵育管中取出一定量反应混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，两性离子缓冲液，MgS04，EDTA和二硫苏糖醇，将各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积并将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间；
[0015](5)检测步骤(4)得到的各混合液中的ATP;具体的，从步骤(4)的各孵育管中取出一定量反应混合液，然后向所述各反应混合液中加入一定量萤火虫荧光素酶，在全自动计数菌落器上测试结果；
[0016](6)数据处理；由于细胞内的GTP、GDP、GMP水平是相对恒定的，三个管测试出来的ATP水平分别代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同时间斑马鱼细胞内GTP: GDP: GMP水平变化即可得出斑马鱼M受体水平变化。
[0017]优选的，所述步骤(2)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述两性离子缓冲液的浓度为15mmol/L，所述MgCl2的浓度为1.0mmOl/L，所述KCl的浓度为2.5μmOl/L，所1述磷酸稀醇丙酮酸盐的浓度为0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的浓度为16mg/L，所述ATP浓度为0.4ymol/L，所述鸟苷酸激酶浓度为0.8U/mL；
[0018]优选的，所述步骤(2)中，所述孵育温度为30°C，时间为30min;所述冷却时间为1min；
[0019]优选的，所述步骤(3)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述葡萄糖磷酸盐浓度为0.5mmol/L，所述葡萄糖浓度为0.5mmol/L，所述NADP+浓度为0.5mmol/L，所述两性离子缓冲液浓度为75mmol/L，所述MgCl2的浓度为0.5mmol/L，所述KCl的浓度为
0.0125mmol/L，所述己糖激酶的浓度为2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶的浓度为0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的浓度为lU/mL;
[0020]优选的，所述步骤(3)中，所述孵育温度为30°C，时间为30min;所述冷却时间为1min；
[0021]优选的，所述步骤(4)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述二磷酸核苷激酶浓度为0.025U/mL，所述ADP浓度为37.5pmol/mL，所述两性离子缓冲液的浓度为31.25mmol/L，所述MgSO4浓度为6.25mmol/L，所述二硫苏糖醇的浓度为0.625mmol/L;所述步骤(4)中，所述孵育温度为30°C，时间为5min;
[0022]优选的，所述步骤(5)中，所述萤火虫荧光素酶浓度为20mmol/L。
[0023]本发明还公开了上述方法在水质实时在线评估与监测中的应用。
[0024]本发明的有益效果为:
[0025](I)本发明基于GTP与斑马鱼M受体之间的关系，首次提出基于生物发光法检测斑马鱼M受体的含量变化，无需直接测定M受体蛋白含量，该方法灵敏度高、稳定性好、不需要复杂设备；
[0026](2)本发明操作简单快捷、特异性高、成本低，本发明从分子方面研究胆碱能系统的内在作用机制，再结合斑马鱼行为变化方面的研究，最终能够实现对水质的实时在线评估与监测。
【附图说明】
[0027]图1为实验例I中实验组与对照组GTP: GDP: GMP对比曲线图
【具体实施方式】
[0028]结合附图对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
[0029]实施例1
[0030](I)将斑马鱼组织破碎，低温离心处理，取上清液，将上清液等量置于A、B、C三个孵育管中；
[0031](2)将步骤(I)得到上清液中的GDP和GMP转化为GTP;更具体的，首先向各孵育管加入50yL的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的两性离子缓冲液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物质，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鸟苷酸激酶，各孵育管内反应混合液均用超纯水调至250yL;将反应混合物孵育再沸水浴终止反应，然后将装有反应混合液的孵育管置于冰块中冷却，所述孵育温度为30°C，时间为30min;所述冷却时间为1min;
[0032](3)破坏各反应混合液中的ATP和UTP，具体的，从步骤(2)的各孵育管中的混合液中取出50yL混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸盐，葡萄糖，NADP+，两性离子缓冲液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶;各孵育管内反应混合液均用超纯水调至250yL;将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间后再置于冰块中冷却一定时间，所述孵育温度为30°C，时间为30min;所述冷却时间为1min;
[0033](4)将各反应混合液中的GTP转化为ATP;具体的，从步骤(3)的各孵育管中取出50μL反应混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，两性离子缓冲液，MgSO4，EDTA和二硫苏糖醇，将各孵育管内反应混合液均用超纯水调至400PL并将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间，所述孵育温度为30°C，时间为5min;
[0034](5)检测步骤(4)得到的各混合液中的ATP;具体的，从步骤(4)的各孵育管中取出50yL反应混合液，然后向所述各反应混合液中加入10yL萤火虫荧光素酶，所述萤火虫荧光素酶浓度为20mmol/L，在全自动计数菌落器上测试结果；
[0035](6)数据处理；由于细胞内的GTP、GDP、GMP水平是相对恒定的，三个管测试出来的ATP水平分别代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同时间斑马鱼细胞内GTP: GDP: GMP水平变化即可得出斑马鱼M受体水平变化。
[0036]其中，所述步骤(2)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述两性离子缓冲液的浓度为15mmo I /L，所述MgC12的浓度为1.0mmo I/L，所述KCI的浓度为2.5ymo I/L，所述磷酸稀醇丙酮酸盐的浓度为0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的浓度为16mg/L，所述ATP浓度为0.4ymol/L，所述鸟苷酸激酶浓度为0.8U/mL;
[0037]所述步骤(3)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述葡萄糖磷酸盐浓度为0.5mmol/L，所述葡萄糖浓度为0.5mmol/L，所述NADP+浓度为0.5mmol/L，所述两性离子缓冲液浓度为75mmol/L，所述MgCl2的浓度为0.5mmol/L，所述KCl的浓度为0.0125mmol/L，所述己糖激酶的浓度为2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶的浓度为0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的浓度为lU/mL;
[0038]所述步骤(4)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述二磷酸核苷激酶浓度为0.025U/mL，所述ADP浓度为37.5pmol/mL，所述两性离子缓冲液的浓度为31.25mmol/L，所述MgSO4浓度为6.25mmol/L，所述二硫苏糖醇的浓度为0.625mmol/L。
[0039]实验例I
[0040]1.实验分为实验组和对照组，每组放入6条斑马鱼，每条斑马鱼做为一个样品，分别在2h，4h，6h，8h，1h，12h取一次样品。实验组用0.0lmol/L的阿托品(阻断M受体的抗胆碱药)暴露12h，对照组不添加任何物质。
[0041 ] 2.取出样品加入预冷PBS，冰浴下充分匀浆，然后4°C，12000转离心20分钟，取上清液，分别经以下步骤处理。
[0042]实验组和对照组分别准备A，B，C三个分开的孵育管，分别经以下步骤处理:
[0043](I)将得到的斑马鱼上清液中的GDP和GMP转化为GTP;更具体的，首先向各孵育管加入获得50yL的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的两性离子缓冲液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物质，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鸟苷酸激酶，各孵育管内反应混合液均用超纯水调至250yL;将反应混合物孵育再沸水浴终止反应，然后将装有反应混合液的孵育管置于冰块中冷却，所述孵育温度为300C，时间为30min ；所述冷却时间为1min ；
[0044](2)破坏各反应混合液中的ATP和UTP，具体的，从步骤(I)的各孵育管中的混合液中取出50yL混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸盐，葡萄糖，NADP+，两性离子缓冲液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶;各孵育管内反应混合液均用超纯水调至250yL;将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间后再置于冰块中冷却一定时间，所述孵育温度为30°C，时间为30min;所述冷却时间为1min;
[0045](3)将各反应混合液中的GTP转化为ATP;具体的，从步骤(2)的各孵育管中取出50μL反应混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，两性离子缓冲液，MgSO4，EDTA和二硫苏糖醇，将各孵育管内反应混合液均用超纯水调至400PL并将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间，所述孵育温度为30°C，时间为5min;
[0046](4)检测步骤(3)得到的各混合液中的ATP;具体的，从步骤(3)的各孵育管中取出50yL反应混合液，然后向所述各反应混合液中加入10yL萤火虫荧光素酶，所述萤火虫荧光素酶浓度为20mmol/L，在全自动计数菌落器上测试结果；
[0047](5)数据处理；由于细胞内的GTP、GDP、GMP水平是相对恒定的，三个管测试出来的ATP水平分别代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同时间斑马鱼细胞内GTP: GDP: GMP水平变化即可得出斑马鱼M受体水平变化。
[0048]其中，所述步骤(I)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述两性离子缓冲液的浓度为15mmo I /L，所述MgC12的浓度为1.0mmo I/L，所述KCI的浓度为2.5ymo I/L，所述磷酸稀醇丙酮酸盐的浓度为0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的浓度为16mg/L，所述ATP浓度为0.4ymol/L，所述鸟苷酸激酶浓度为0.8U/mL;
[0049]所述步骤(2)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述葡萄糖磷酸盐浓度为0.5mmol/L，所述葡萄糖浓度为0.5mmol/L，所述NADP+浓度为0.5mmol/L，所述两性离子缓冲液浓度为75mmol/L，所述MgCl2的浓度为0.5mmol/L，所述KCl的浓度为0.0125mmol/L，所述己糖激酶的浓度为2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶的浓度为0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的浓度为lU/mL;
[0050]所述步骤(3)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述二磷酸核苷激酶浓度为0.025U/mL，所述ADP浓度为37.5pmol/mL，所述两性离子缓冲液的浓度为31.25mmol/L，所述MgSO4浓度为6.25mmol/L，所述二硫苏糖醇的浓度为0.625mmol/L。
[0051 ] 实验结果分析:以阿托品模拟污染物，分别以实验组和对照组六条鱼GTP:GDP:GMP水平做一条曲线做对比。如图1所示，阿托品抑制组的GTP含量低于对照组而⑶P和GMP水平高于对照组，表明斑马鱼暴露在阿托品中，M受体含量降低。
[0052]上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1.一种生物发光法在测定斑马鱼M受体水平中的应用。2.—种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，步骤包括:取实验组和对照组斑马鱼组织上清液将GDP和GMP转化为GTP ；将ATP和M TP破坏掉；将GTP转化为ATP;检测ATP并进行数据处理计算得出实验前后斑马鱼M受体水平变化。3.如权利要求2所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，步骤包括: (1)将斑马鱼组织破碎，低温离心处理，取上清液，将上清液等量置于A、B、C三个孵育管中； (2)将步骤(I)得到上清液中的GDP和GMP转化为GTP;更具体的，首先向各孵育管加入一定量的上清液，然后再向各管中加入PH7.5的两性离子缓冲液，MgCl2和KCl，之后A管不再添加任何物质，B管再加入一定量的磷酸烯醇丙酮酸盐和丙酮酸激酶，C管再加入一定量ATP和鸟苷酸激酶，各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积;将反应混合物孵育再沸水浴终止反应，然后将装有反应混合液的孵育管置于冰块中冷却； (3)破坏各反应混合液中的ATP和UTP，具体的，从步骤(2)的各孵育管中的混合液中取一定量混合液置于新的孵育管中，向混合液中加入一定量的葡萄糖磷酸盐，葡萄糖，NADP+，两性离子缓冲液，MgCl2，己糖激酶，6-磷酸葡萄糖脱氢酶和二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶；各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积;将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间后再置于冰块中冷却一定时间； (4)将各反应混合液中的GTP转化为ATP;具体的，从步骤(3)的各孵育管中取出一定量反应混合液置于新的孵育管中，然后向所述各孵育管中加入一定量二磷酸核苷激酶，ADP，两性离子缓冲液，MgSO4,EDTA和二硫苏糖醇，将各孵育管内反应混合液均用超纯水调至相同体积并将含有反应混合液的各孵育管孵育一定时间； (5)检测步骤(4)得到的各混合液中的ATP;具体的，从步骤(4)的各孵育管中取出一定量反应混合液，然后向所述各反应混合液中加入一定量萤火虫荧光素酶，在全自动计数菌落器上测试结果； (6)数据处理；由于细胞内的GTP、GDP、GMP水平是相对恒定的，三个管测试出来的ATP水平分别代表GTP、GDP和GMP水平，所以不同时间斑马鱼细胞内GTP: GDP: GMP水平变化即可得出斑马鱼M受体水平变化。4.如权利要求3所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述两性离子缓冲液的浓度为15mmo 1/L，所述MgCl2的浓度为I.0mmol/L，所述KCl的浓度为2.5ymol/L，所述磷酸烯醇丙酮酸盐的浓度为0.02mmol/L，所述丙酮酸激酶的浓度为16mg/L，所述ATP浓度为0.4μmo 1/L，所述鸟苷酸激酶浓度为0.8U/mL05.如权利要求3所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述孵育温度为30°C，时间为30min;所述冷却时间为lOmin。6.如权利要求3所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述葡萄糖磷酸盐浓度为0.5mmol/L，所述葡萄糖浓度为0.5mmol/L，所述NADP+浓度为0.5mmol/L，所述两性离子缓冲液浓度为75mmol/L，所述MgCh的浓度为0.51111]101凡，所述1((]1的浓度为0.01251]11]101凡，所述己糖激酶的浓度为2U/mL，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶的浓度为0.8U/mL，所述二磷酸尿苷葡萄糖焦磷酸化酶的浓度为lU/mL。7.如权利要求3所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述孵育温度为30°C，时间为30min;所述冷却时间为lOmin。8.如权利要求3所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，各孵育管内反应混合液用超纯水调定体积后，所述二磷酸核苷激酶浓度为0.025U/mL，所述ADP浓度为37.5pmol/mL，所述两性离子缓冲液的浓度为31.25mmol/L,所述MgSO4浓度为6.25mmol/L，所述二硫苏糖醇的浓度为0.625mmol/L，所述孵育温度为30°C，时间为5min。9.如权利要求3所述的一种基于生物发光法测定斑马鱼M受体水平的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述萤火虫荧光素酶浓度为20mmol/L。10.如权利要求2-9任一项所述方法在水质实时在线评估与监测中的应用。
【文档编号】G01N21/76GK106047984SQ201610364625
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】任宗明, 任晴, 张婷婷, 齐鲁慧子, 邢娜, 李尚戈
【申请人】山东师范大学