一种肺炎支原体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种肺炎支原体IgG化学发光免疫测定试剂盒，所述试剂盒包括：肺炎支原体抗原包被的磁微粒、吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体、肺炎支原体IgG定标品、预激发液、激发液。另外本发明还公开了一种肺炎支原体IgG化学发光免疫测定试剂盒的制备方法。本发明所述试剂盒与现有试剂盒相比操作简便，灵敏度高，检测范围广等优点。
【专利说明】
一种肺炎支原体I gG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及体外诊断免疫检测领域，具体地，本发明提供了一种化学发光免疫检测肺炎支原体IgG试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002]肺炎支原体/Me?o/3iae，MP)是介于细菌和病毒之间的一种超过滤性病原微生物，主要通过呼吸道飞沫以气溶胶微粒的形式传播。1962年首先从人类原发性非典型肺炎(primary atypical pneumonia，PAP)患者的痰液中分离和培养而来。20世纪90年代以来，随着肺炎病原学的变迀，MP已成为小儿肺炎的重要病原体，MP感染不仅引起肺部病变，且能侵犯心、脑、肝、肾等其他器官，引起多种肺外表现。MP还是社区获得性肺炎(CAP)的重要病原，尤其是5岁以上小儿，MP在非流行年占CAP病原10?20%。因MP生长缓慢、潜伏期及带菌时间长，形成间歇期发病缓慢、长时期传播的流行特点，流行可达数月至数年。近些年来，流感人群比例逐年增加，不仅侵犯青少年和儿童，婴幼儿发病率也呈增多趋势，且由于MP感染常无特异性临床表现，容易与一般的病毒性感冒相混淆，因此能够及时确诊何种病因致病，做到早发现早治疗，减少儿童急性肺炎病情恶化，故早期诊断极为重要。
[0003]肺炎支原体抗体分为IgG抗体和IgM抗体两种，因为肺炎支原体感染的潜伏期为2周-3周，当患者出现症状而就诊时，IgM抗体已达到相当高的水平，因此，IgM抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。如IgM抗体阴性，也不能否定肺炎支原体感染，还需检测IgG抗体。I gG较I gM出现晚，需动态观察。肺炎支原体I gG抗体的测定，同时结合肺炎支原体I gM抗体的检测，可以用于辅助诊断支原体肺炎等疾病。
[0004]临床检测肺炎支原体IgG的主要方法为酶联免疫吸附法，但该方法存在着下述的不足之处:
(1)使用12X 8型、6 X 8型、8 X 12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；
(2)定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；
(3)缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；
(4)检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；
(5)检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差； (6)在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数X48/96人份，如果需要检测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10X48/96人份，如果只有一份样本需要检测10个不同的项目，也需要配置10 X 48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
【发明内容】
[0005]目前肺炎支原体IgG检测技术存在以下缺点:检测成本高、检测灵敏度低、检测线性范围窄、重现性低、不能定量、操作复杂等。
[0006]本发明正是为了克服以上所述缺点，公开了一种检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广、重现性高、可以定量、操作简单的肺炎支原体IgG试剂盒及其制备方法。本发明首先制备化学发光免疫分析试剂盒，主要包括:肺炎支原体IgG单克隆抗体包被的磁颗粒、肺炎支原体IgG单克隆抗体包被的吖啶酯以及肺炎支原体IgG定标品;然后利用全自动化学发光免疫分析仪对定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件，测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度;最后对肺炎支原体IgG全自动化学发光免疫分析系统进行性能(灵敏度、线性、精密度、干扰性)的评价。
[0007]本发明与目前技术相比，具有以下优点:
1、本发明选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析系统，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统检测灵敏度高，能够达到2.0AU/mL；
3、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统线性范围宽，能达到2.0-300.0AU/mL;
4、本发明选用的吖啶酯化学发光免疫分析系统重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析系统难以达到的；
5、本发明的化学发光免疫分析系统已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
6、本发明的化学发光免疫分析系统已实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。
[0008]
【附图说明】
[0009]
图1为实施例3得到的肺炎支原体IgG标准曲线图。
[0010]
【具体实施方式】
[0011]
实施例1:肺炎支原体IgG化学发光免疫测定试剂盒制备方法
(I)肺炎支原体I gG单克隆抗体包被的纳米磁珠制备:
取50mg羧基化的磁微粒(粒径为0.05-lum)悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5MES缓冲液重悬，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3_5mg肺炎支原体IgG单克隆抗体，室温下混悬2-10 h，磁分离，去除上清，用含2% BSA的0.1M pH为8.0的Tris缓冲液重悬到lmg/mL，得到肺炎支原体IgG单克隆抗体包被的磁颗粒，每瓶5mL分装保存于4°C备用。
[0012](2 )肺炎支原体I gG衍生物标记的吖啶酯的制备:
取50 uL 25mg/mL的肺炎支原体IgG衍生物，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1-2 h后取出，用2 mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的肺炎支原体IgG衍生物标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到肺炎支原体IgG衍生物标记的吖啶酯，每瓶5 mL分装保存于4°C备用。
[0013](3)肺炎支原体IgG定标品的制备:
用标准品缓冲液(40 mM Tris-HCl,0.5% BSA,1% NaCl,pH 8.0)将肺炎支原体IgG配置成浓度为O AU/mL、20AU/mL、40 AU/mL^80 AU/mL、160 AU/mL^320 AU/mL，每瓶0.5 mL分装冻干，4 °C保存备用。
[0014](4)化学发光预激发液的配制:
量取1.0升纯化水，依次加入80uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、1.0克叠氮化钠、1.5克吐温20，摇匀后避光存放。
[0015](5)化学发光激发液的配制:
量取1.0升纯化水，依次加入0.6克氢氧化钠、0.5克PC300、0.5g叠氮化钠、1.5克TritonX-405，摇匀后避光存放。
[0016]实施例2:肺炎支原体IgG化学发光免疫检测方法:
本发明以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，本发明的方法学模式为竞争法，即仪器依次加入20 uL的样品、50 uL的肺炎支原体IgG单克隆抗体包被的磁颗粒以及50 uL的肺炎支原体IgG包被的吖啶酯，反应10 min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入50uL化学发光预激发液、50uL化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品的肺炎支原体IgG含量。
[0017]实施例3:肺炎支原体IgG化学发光免疫测定试剂盒性能评价检测曲线见附图1。
[0018]灵敏度的检测:
参照CLSI EP17-A文件推荐实验方案，计算肺炎支原体IgG化学发光免疫层析试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为lng/ mL。
[0019]线性的检测:
对浓度为O AU/mL、20AU/mL、40 AU/mL^80 AU/mL、160 AU/mL^320 AU/mL标准品做线性分析，计算线性相关系数，r=0.9990，另外，该试剂盒对肺炎支原体IgG样品检测的线性范围为1.5-300 AU/mLο
[0020]精密度测定:
取浓度为50 AU/mL及200AU/mL两个肺炎支原体IgG样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5%。
[0021]干扰性实验:
取混合血清分别添加干扰物包括:结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例按照1:20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS的文件标准，可用于临床实验室肺炎支原体IgG浓度的准确评估。
[0022]实施例4:肺炎支原体IgG化学发光免疫测定试剂盒的灵敏度实验
分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为O AU/mL的校准品或样本稀释液为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M-2SD，将该发光值代入校准曲线计算得到相应的浓度值小于2.0 AU/mLο
【主权项】
1.一种肺炎支原体IgG化学发光免疫测定试剂盒，所述试剂盒包括:肺炎支原体抗原包被的纳米磁微球、吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体、化学发光底物液、肺炎支原体IgG定标品。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肺炎支原体抗原包被的固相载体为磁微粒。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肺炎支原体抗原包被的固相载体为羧基化的粒径为0.05-lum磁微粒。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为吖啶酯、吖啶酯磺酰胺、吖啶酯甲苯磺酰胺、吖啶酯对甲基磺酰胺、吖啶酯三氟甲基磺酰胺。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物优选吖啶酯。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包括化学发光激发液、化学发光预激发液。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光预激发液为质量分数.0.005%?0.5%的双氧水(!1202)溶液，激发液为0.00511101/1?0.025mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液。8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述肺炎支原体IgG定标品为用标准品缓冲液将肺炎支原体IgG配制成浓度为O AU/mL、20AU/mL、40 AU/mL、80 AU/mL、160 AU/mL、.320 AU/mL,4 °C保存备用。9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括肺炎支原体抗原包被的磁微粒的制备、吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体的制备、化学发光底物液的制备、肺炎支原体I gG定标品的制备。10.根据权利要求1和权利要求9所述试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)肺炎支原体抗原包被的磁微粒的制备: 取羧基化的纳米磁珠悬浮液，磁分离去上清，MES缓冲液重悬，加入EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入肺炎支原体抗原，室温下混悬2-10 h，磁分离，去除上清，Tris缓冲液重悬，得到肺炎支原体抗原包被的磁微粒； 可选的，羧基化纳米磁珠直径为0.1wi ~ 2.0ym; MES缓冲液浓度为1mM?10mM,pH 5.5?8.5； .2)吖啶酯标记的鼠抗人IgG抗体的制备: 取鼠抗人IgG抗体，加入碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入吖啶酯混匀，室温下避光反应，.1-2 h后取出，离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的鼠抗人IgG抗体衍生物标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到鼠抗人IgG抗体衍生物标记的吖啶酯； .3 )肺炎支原体I gG定标品的制备: 用标准品缓冲液将肺炎支原体IgG配置成浓度为O AU/mL、20AU/mL、40 AU/mL,80 AU/mL、160 AU/mL、320 AU/mL，分装冻干，4 °C保存备用； .4)化学发光预激发液的制备: 量取1.0升纯化水，依次加入0.5?10uL质量分数为20%的双氧水(H2O2)、0.5?5克防腐剂、0.5?5克表面活性剂，摇匀后避光存放； 可选的，防腐剂为商品化叠氮化钠、PC300，表面活性剂为吐温20、吐温80、Triton X-.10^Triton X-405； 5)化学发光激发液的制备: 量取1.0升纯化水，依次加入0.2?I克氢氧化钠、0.5?5克防腐剂、0.5?5克表面活性剂，摇匀后避光存放； 可选的，防腐剂为商品化叠氮化钠、PC300，表面活性剂为吐温20、吐温80、Triton X-1OO^Triton X.405。
【文档编号】G01N33/577GK106053440SQ201610503653
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】周湧, 徐向红, 夏福臻, 钱纯亘, 刘星
【申请人】深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司