专利名称：一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物学-分子核酸检测试剂盒领域。
背景技术：
支原体(Myc叩lasma)是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，在自然界分布极为广泛。 从人体分离的20种支原体中，9种与人类疾病的关系密切，即肺炎支原体(M. pneumoniae)、 角早脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、 人型支原体(M. hominis)、 生殖支原体 (M. genitalium)、 发酵支原体(M. fermentans)、 穿透支原体(M. penetrans)、 梨支原体 (M. pirum)、关节炎支原体(M. arthritidis)及猪鼻支原体(M. hyorhinis)。除对人体致病外， 支原体还常常感染动物和细胞培养物。自从1956年Robinson L B等首次报道细胞培养中的 支原体污染以来，国内外关于支原体污染细胞和疫苗等生物制品的报道屡见不鲜。细胞培养 (特别是传代细胞)被支原体污染是个世界性问题，细胞培养物被支原体污染率在20% 50% 之间。国内外研究表明，98%以上是以下8种支原体口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体 (M. arginini)、猪鼻支原体(M. hyorhini s)、发酵支原体(M. fermentans)、人型支原体 (M.hominis)、唾液支原体(M. salivarium)、肺支原体(M. pulmonis)和莱氏无胆甾原体 (A. laidlawii)。
由于支原体无细胞壁，可通过细菌滤器，所以在细胞培养和生产生物制剂过程中，极易 污染支原体，给科研及生物制品业带来很多麻烦。因此，建立一种快速、灵敏、广谱的支原 体检验方法十分必要。目前，其检测方法主要有形态学检査(相差显微镜、电镜)、分离培 养法、DNA荧光染色法、血清学方法(酶联免疫吸附试验、免疫荧光法)以及核酸探针杂交 法等，这些方法或特异性差，或灵敏度低，或成本高，或耗时长，或操作繁琐，均不能成为 理想的检测手段。随着分子生物学的发展，人们对支原体的结构及分子组成越来越了解。到 20世纪卯年代初，国际上已开始把PCR技术应用于支原体的检测，使得支原体检测变得简 便、快速、敏感、特异，为支原体的检测和实验研究开辟了一个广阔的前景。2006年欧洲药 典已将PCR作为常规检测方法。目前检测支原体的PCR方法主要有一步PCR(贾丽艳等2005 年，李明生等2006年，倪红霞等2007年)，巢式PCR (郭玉广等2005年，戴悦等2005年， 李彦明等2007年)，PCR-ELISA (刘晋平等2007)，实时定量PCR等，其中实时定量PCR 由于价格因素尚未普及应用，而其他PCR方法容易出现假阳性(交叉污染)和假阴性(模板 不完整)结果。本发明根据上述14种支原体的16SrRNA基因高度保守区，开发了一种支原 体检测的报告基因扩增试剂盒，选取支原体一段保守序列作为杂交探针，与一段无关序列构 建报告基因，与待测样本杂交后再PCR扩增报告基因，规避常规PCR易交叉污染的缺点。 参考文献
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发明内容
本发明提供"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"。
所述发明将常规的检测支原体基因就扩增其基因的观念发展为支原体基因通过探针杂交 交联一无关的报告基因，再扩增报告基因间接检测的新概念。其特征在于将两段相邻的探 针(与待测支原体基因16srRNA互补的短序列为探针，且两段序列连续，不少一个碱基，只
是它们之间没有形成磷酸二酯键)分别连接在一段无关的报告基因首尾末端，带探针的报告 基因可通过首尾探针序列与待测模板互补杂交，从而其首尾末端靠近衔接，杂交体单链缺口
被耐热连接酶连接封闭，使报告基因DNA成环。再采用报告基因中间的序列为引物，反向 扩增含探针的环状报告基因。如果没有特异性的待测支原体基因杂交，报告基因不能成环， 也就不能反向PCR扩增。调节耐热连接酶反应条件，下调/放弃一些过剩的系统灵敏度，可 使少量交叉污染不敏感，不易杂交报告基因，也就减少了假阳性。如果系统污染了，就可换 一套报告基因，多一种失败的补救措施。所述一个探针序列长度为10-100base，优选为 20-30base。所述无关的报告基因为与待测基因序列无关的任何DNA，种属与待测基因越远越 好，本发明实施例采用植物抑南芥LFY保守序列作为报告基因。所述报告基因长度为 80-1000base pair(bp)，优选为200-500bp。所述杂交-耐热连接酶反应是94。C-50。C循环，循环 数为1-30个，优选2-10个循环。所述耐热连接酶连接温度为30'C-80'C，优选为50'C-6(TC。 所述耐热连接酶是指Taq ligase。所述反向PCR扩增是采用报告基因正中间的短序列，右半 部分以有意义链序列作为上游反向PCR引物F，左半部分以反意义链序列作为下游反向PCR 引物R，反向扩增环状报告基因。所述试剂盒成份包括带探针报告基因，Taq连接酶及缓 冲液，10mMdNTPs， Taq聚合酶及缓冲液，反向引物F/R和凝胶电泳试剂。 本发明工作流程如下
1. 准备报告基因选择14种支原体的16S rRNA基因一段高度保守的核酸序列 (gg/act/aaactatgtgccagcagc/tcgcggtaatacatagg)作为杂交探针。将杂交探针右半部分序列(有意义 链序列)加在一段无关LFY序列5'端序列前面合成正向引物，左半部分序列(反意义链序 列)接在一段无关LFY序列3'端序列后面合成反向引物。以磷酸化的引物用PfU酶扩增该 无关LFY序列生成报告基因。
2. 待测样本一报告基因的杂交-连接酶反应报告基因与待测标本杂交，如有阳性模板则 通过其保守序列与报告基因两头末端序列杂交，使报告基因5'末端和3'末端因结合待测模板杂交序列而靠近契合，其缺口经耐热连接酶连接修复而生成环状报告基因，并且杂交链缺 口两侧碱基要完全匹配才能修复成环。
3.报告基因的反向PCR:采用LFY正中间的序列作为反向引物按常规方法进行反向 PCR，间接反映检测结果。同时使用了生物素-亲合素系统即引物标记生物素，电泳缓冲液中 加入适量亲合素标记的琼脂糖凝胶颗粒，进一步减少污染造成的假阳性结果。
优点
本发明的杂交-连接酶反应步骤不仅提高了系统灵敏度，还极大地增加了系统的可调节 性，随着耐热连接反应循环次数的l-10次的增加，系统的检测灵敏度将逐步从ng水平到pg 水平以及fg水平，最高灵敏度与二次扩增法的巢式PCR相当。调节耐热连接反应循环数及 温度、报告基因的比例，还可避免加样加试剂时标本间气雾胶的交叉污染，即真正阳性标本 其阳性基因含量大于fg或pg水平能有效检测，而标本间气雾胶交叉污染的数个拷贝分子不 能检测。
图1本发明原理示意图 两段序列相邻的探针(与待测模板互补的序列)分别连接在一段无关序列的首尾末端构成 报告基因，报告基因可通过首尾与待测模板互补杂交，从而其首尾末端靠近衔接，杂交体单 链缺口被连接酶连接，使报告基因成环，再反向PCR扩增报告基因。如果没有待测模板的存 在，报告基因不能成环，反向PCR不扩增。
图2本发明检测样本中支原体的结果 1 PCR空白对照；2胎牛血清1; 3胎牛血清2; 4山羊血清；5 E.coli DH5 a ; 6阳性对照；7未杂交-连接的反应液；8阴性对照；9 DNA标准
具体实施例方式
严格按照基因扩增检验实验室的管理规范进行实验操作如PCR实验严格分区操作；各 区应有专用的手套、移液器等，不得交叉使用，避免污染；工作人员应遵循从一区到二区的 单方向工作原则，各工作区相对隔离；进行PCR实验的工作桌面和相关物品应定期用1%次 氯酸钠、75%酒精、lmol/L盐酸或紫外灯进行灭菌和消毒。
1引物设计
报告基因构建引物根据GenBank中公布的14种支原体的16S rRNA基因序列，用 DNAMAN 5.2.2 软件分析，选择一段高度保守的核酸序列 (gg/act/aaactatgtgccagcagc/tcgcggtaatacatagg)作为杂交探针。将杂交探针右半部分序列(有意义 链序列)加在一段无关LFY序列5'端序列前面合成正向引物MyF,左半部分序列(反意义 链序列)接在一段无关LFY序列3'端序列后面合成反向引物MyR。 MyF: 5，-ag c/tcgcggtaat aca tag gtc gcc ggt gac ac -3， ； MyR: 5，- get ggc aca tag tt a/t g t/c cca etc tec tc -3，
报告基因反向PCR引物取报告基因正中间约30bp长的序列，右半部分约15base长的 有意义链序列作为正向引物RevF，左半部分约15base长的反意义链作为反向引物RevR。RevP 5'-tat gaa gga cga gga g-3，； RevR: 5，-ccc aca agc gtg ctc-3'，其中正向引物RevF的5，端标记 生物素。
2准备报告基因
选取与支原体无关的拟南芥LFY基因一段约300 bp的序列人工合成后构建质粒pUCIdl 。 以磷酸化的报告基因构建引物和用Pfu酶扩增该质粒生成报告基因。质粒pUCIdl MyF引物(5uM) MyR引物(5uM) 10 Xpfu buffer 10mMdNTPs pfii polymerase dH2Q_
PCR反应条件为95。C变性3分钟，25个循环，94°C 35秒，52'C 35秒，72'C35秒。 25个循环后72°C10分钟。产物用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。
3待测样本与报告基因的杂交-连接酶反应
2(HU反应体系中加入待测样本lnl，报告基因lpl， 10XTaq连接酶缓冲液2pl， Taq连接 酶0.5pl, 15.5^1 dH20。 95。C变性5分钟，50'C温育10分钟。l-2个循环。
此步骤采用连接酶链反应(Ligase Chain Reaction)热循环连接催化，第一循环产生的报告 基因环可以作为第二轮循环的杂交模板，从而提高最终PCR检测的灵敏度。
选取包含杂交探针的一段支原体核酸序列(约U0bp)人工合成后插入质粒载体pUC19， 构建质粒pUCMyco作为阳性对照，用质粒载体pUC19做阴性对照。
4报告基因反向PCR:
杂交连接酶反应液 2ul
RevF引物(5uM) lul
RevR引物(5uM) lul
10mMdNTPs lul
10 XTaq buffer 5ul
PCR反应条件为94。C变性3分钟，25个循环，94°C 30秒，52°C 30秒，72'C30秒。 最后72°C10分钟。PCR产物经1.5-2% agarose电泳分析，电泳缓冲液中加入适量亲合素标记 的琼脂糖凝胶颗粒。
用本发明对待测样品进行检测，PCR空白对照用等量灭菌超纯水，阳性对照为质粒 pUCMyco，阴性对照为质粒载体pUC19，扩增结果见图2。由图2可知，阳性对照产生一条 约330bp的特异性产物，而空白、阴性对照没有特异性扩增条带，符合理论分析结果。4个 待测样品均为阴性。
Taq polymerase dH，O_
5结果
权利要求
1“一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒”将支原体保守16sRNA基因通过杂交探针交联一无关的报告基因，再扩增报告基因间接检测。其特征在于预设两段与待测支原体16sRNA互补的短序列为探针序列，两探针序列相邻，且碱基连续。将两段探针分别连接在一段无关的报告基因首尾末端，带探针的报告基因可通首尾探针序列与待测模板互补杂交，从而其首尾末端靠近衔接，杂交体单链缺口被耐热连接酶循环催化连接，使报告基因DNA成环，再采用报告基因中间的序列为引物，反向扩增含探针的环状报告基因。如果没有特异性待测基因帮助，报告基因不能成环，也就不能反向PCR扩增。
2. 根据权利要求1所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述双探针序列为与支 原体16sRNA保守区互补的DNA序列，所述双探针长度为20-200base，单探针长度为 10-100base。
3. 根据权利要求2所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述双探针序列长度为40-60base，单探针长度为20-30base。 ]
4. 根据权利要求l所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述报告基因为与支原体基因序列无关的任何DNA，所述报告基因长度为80-1000basepair(bp)。
5. 根据权利要求4所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述报告基因长度为200-500bp。
6. 根据权利要求1所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述杂交-耐热连接酶反应是94'C-5(TC循环，所述循环次数为1-30次。
7. 根据权利要求6所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述杂交-耐热连接酶反应循环次数是2-10次。
8. 根据权利要求6所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述杂交-耐热连接酶反应的连接温度为30。C-80。C
9. 根据权利要求6所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述杂交-耐热连接酶反应的耐热连接酶是Taq DNALigase。
10.根据权利要求1所述的"一种支原体检测的报告基因扩增试剂盒"，所述试剂盒成份包括带探针报告基因，Taq连接酶及缓冲液，10 mM dNTPs， Taq聚合酶及缓冲液，反向引物F/R和凝胶电泳试剂。
全文摘要
细胞培养的支原体污染难题和各种支原体感染诊断急需可靠、高效的试剂盒。支原体培养加荧光染色法可靠，但费时费事，培养物还加剧污染。常规检测支原体就扩增支原体基因的直接PCR方法易交叉污染，假阳性高只作为辅助参考。本发明涉及支原体保守基因通过杂交探针交联植物拟南芥LEY序列为报告基因DNA，再扩增报告基因间接检测。其特征在于将支原体16sRNA与首尾带支原体保守序列探针的LEY报告基因DNA的首尾部位杂交，经耐热连接酶催化报告基因DNA成环，再反向PCR扩增环状报告基因，间接反映支原体的检测。调节连接酶反应，交叉污染不易杂交报告基因，也就减少了假阳性；如果系统污染了，还可换一套报告基因。
文档编号C12Q1/68GK101580867SQ20081009456
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月14日 优先权日2008年5月14日
发明者辉 张, 洪 江 申请人:北京泰格瑞分子检验有限公司;张 辉;江 洪