专利名称：用于检测猪鼻支原体的lamp试剂盒及其制备和使用方法
技术领域：
本发明属卫生检验领域，涉及一种用于检测猪鼻支原体的试剂盒，特别涉及一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒及其建立方法和应用
背景技术：
猪鼻支原体hyorhinis, Mh)是猪呼吸道的常在菌,但病原的全身侵害将导致多浆膜炎、关节炎等疾病的发生。猪鼻支原体除了污染各种细胞，引起猪病，近年来被发现其与人胃癌、大肠癌有高度相关性，已经被认为是一种新的人传染病的病原。与猪肺炎支原体相似，猪鼻支原体能够黏附到猪呼吸道上部和下部有纤毛的上皮细胞上。呼吸道内一些猪鼻支原体的菌株能够引起肺炎。此外，猪鼻支原体感染能够引发中耳炎，当存在于咽鼓管内的支原体黏附到上皮细胞的纤毛上时可能会损害黏液纤毛器官。当其与其它细菌，如多杀性巴氏杆菌和化脓隐秘杆菌共同感染时，可能会使感染上移。呼吸道疾病的发生多是由猪鼻支原体与呼吸道其他病原，如猪繁殖呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感引起，偶尔单独由猪鼻支原体感染引起。在检测方面，国内外已建立了多种血清学检测方法,如免疫琼扩和间接血凝等,但免疫琼扩和间接血凝法存在着灵敏度不高等问题。由于缺乏简单、快速的检测方法，该病原在人群中的感染情况尚不清楚。因此，该病原检测方法的研究将是流行病学研究的关键。环介导等温扩增技术(LAMP)是由T. Notomi (2000)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。今年来，国外已将该技术广泛应用于病原体的检测。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；NobuyukiHayashi等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了 LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以用于检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血症(VHS )、巨细胞病毒(CMV)、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄黄化曲叶病毒等。LAMP还可以用于对动物早期胚胎性别鉴定等。目前国内外均未见有用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒及在猪鼻支原体检测中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用方便、敏感度高、鉴定简便的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒。本发明的另一个目的是为检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒提供一种使用方便、敏感度高、鉴定简便的检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒的制备方法。本发明的再一个目的是为检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒提供一种正确的使用方法。本发明的主要目的所述的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒，其结构主要由LAMP反应液、阳性模板和核酸染料组成，具体如下所述(1)LAMP反应液所述LAMP反应液中的每24μ1 LAMP反应液的配制比例为10 X ThermoPol buffer 2. 5M-L> 100 mM MgSO4 O. 5 I. 5μ1、8Μ Betaine O. 5 2. OML、IOmMdNTPs 2 3· 5μ 、10μΜ 上游引物 F3 O. 25 2μ 、10μΜ 下游引物 Β3 O. 25 2μ 、40μΜ 内上游引物FIP O. 25 2μ 、40μΜ内下游引物BIP O. 25 2PL、8U/^L Bst DNA聚合酶大片段O. 5 2. Ομ 、用灭菌ddH20补至24μ ；
(2)阳性模板猪鼻支原体pMD-18T/P37核酸；
(3)核酸染料=SYBRGreen I。如上所述的每24μ1 LAMP反应液的优选配制比例为10XThermoPol buffer2·5μ 、100 mM MgSO4 1·0μ1、8Μ Betaine 2·0μ 、10πιΜ dNTPs 2μ 、10μΜ上游引物 F3 O. 5μ ,ΙΟμΜ下游引物 Β3 O. 5μ 、40μΜ 内上游引物 FIP O. 5μ 、40μΜ 内下游引物 BIP O. 5PL、8U/^LBst DNA聚合酶大片段I. 5μ 、用灭菌ddH20补至24μ ；
上述的上游引物F3、下游引物Β3、内上游引物FIP、内下游引物BIP分别为1F3、1Β3、1FIPUBIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP 组成的第三套引物，所述 1F3、1B3、1FIP、1BIP 或 2F3、2B3、2FIP、2BIP 或 3F3、3B3、3FIP、3BIP的序列分别如下
下表中的排序序号中的I 4为第一套引物，5 8为第二套引物，9 12为第三套引物。
权利要求
1.一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒，其特征在于包含如下组分 (1)LAMP反应液所述LAMP反应液中的每24WLAMP反应液的配制比例为10 X ThermoPol buffer 2. 5M-L> 100 mM MgSO4 0. 5 I. 5M<1、8M Betaine 0. 5 2. OML、IOmMdNTPs 2 3. 5ML、10剛上游引物F3 0. 25 2ML、10剛下游引物B3 0. 25 2ML、40剛内上游引物FIP 0. 25 2ML、40剛内下游引物BIP 0. 25 2ML、8U/ML Bst DNA聚合酶大片段0. 5 2. 0ML、用灭菌ddH20补至24ML ； (2)阳性模板猪鼻支原体pMD-18T/P37核酸； (3)核酸染料=SYBRGreen I。
2.如权利要求I所述的用于检测猪鼻支原体的LAMP试 剂盒，其特征在于所述的每24WLAMP 反应液的优选配制比例为10XThermoPol buffer 2.5ML、100 mM MgSO4 1.0W、8MBetaine 2.0ML、10mM dNTPs 2ML、10剛上游引物 F3 0. 5ML、10剛下游引物 B3 0. 5ML、40剛内上游引物FIP 0. 5ML、40剛内下游引物BIP 0. 5ML、8U/ML Bst DNA聚合酶大片段I. 5ML、用灭菌ddH20补至24ML。
3.如权利要求I或2所述的用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒，其特征在于所述上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP分别为1F3、1B3、IFIP、IBIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物，所述 1F3、1B3、1FIP、1BIP 或 2F3、2B3、2FIP、2BIP 或 3F3、3B3、3FIP、3BIP 的序列分别如下 下表中的排序序号中的I 4为第一套引物，5 8为第二套引物，9 12为第三套引物。
4. 一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒的制备方法，其特征在于其方法的步骤如下 (1)从基因数据库检索获得猪鼻支原体特异性P37基因序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得猪鼻支原体特异性P37基因序列的保守部分DNA序列； (2)设计LAMP引物；将所得猪鼻支原体特异性P37基因序列的保守部分DNA序列，依据LAMP引物设计原则筛选设计了 3套上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP组成的LAMP引物，即卟3、183、卟1 、181 组成的第一套引物，或2 3、283、2 1 、281 组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物； (3)配置LAMP反应液所述LAMP反应液中含有10X ThermoPol buffer、MgSO4,Betaine、dNTPs、上游引物F3、下游引物B3、内上游引物FIP、内下游引物BIP、Bst DNA聚合酶大片段和灭菌ddH20 ;其配制比例为每24W LAMP反应液中含有=IOXThermoPolbuffer 2. 5M-L ； 100 mM MgSO4 0. 5-1. 5M-1 ；8M Betaine 0. 5-2. OM-L ； IOmM dNTP 2-3. 5M-L ；lOm上游引物F3 0. 25-2ML ;10剛下游引物B3 0. 25-2ML ;40剛内上游引物FIP..0. 25-2ML ;40剛内下游引物 BIP 0. 25-2ML ;8U/ML Bst DNA聚合酶大片段0. 5-2. OML ;用灭菌 ddH20 补至 24ML ； 所述上游引物F3、下游引物B3、内上游弓丨物FIP、内下游引物BIP分别为1F3、1B3、1FIPUBIP组成的第一套引物，或2F3、2B3、2FIP、2BIP组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物； (4)制备阳性模板用第三套上游引物3F3和第一套下游引物1B3为引物，以猪鼻支原体基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆入pMD-18 T载体获得猪鼻支原体pMD_18T/P37核酸为阳性模板；(5)用卟3、183、卟1 、181 组成的第一套引物，或2 3、283、2 1 、281 组成的第二套引物，或3F3、3B3、3FIP、3BIP组成的第三套引物中的任一套作为上游引物F3、下游引物B3、内 上游引物 FIP、内下游引物 BIP，与 IOXThermoPol buffer、MgSO4、Betaine、dNTPs、Bst DNA聚合酶大片段和灭菌ddH20配制好LAMP反应液，猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸为阳性模板，和商品化的SYBR Green I核酸染料组装成盒即为用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒。
5. 一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒的使用方法，其特征在于其方法的步骤如下 首次使用或间隔时间较长后首次使用检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒时，应先用试剂盒中的阳性模板检验试剂盒中的LAMP反应液的有效性，其检验方法的步骤如下 (I)取试剂盒中的阳性模板即猪鼻支原体pMD-18 T/P37核酸1ML，再取试剂盒中的24ML LAMP反应液，将IML阳性模板加入到24ML LAMP反应液中，经瞬时离心混匀得阳性模板反应液； (2 )将阳性模板反应液置60 V 62°C恒温40min进行LAMP扩增，然后经80 V 5min进行酶的灭活；取出扩增反应管，对阳性模板和LAMP反应液的有效性进行判定； 在确认LAMP反应液有效的情况下，再对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体的检测，其检测方法的步骤如下 (1)提取待测样品的核酸； (2)取IML待测样品的核酸，再取试剂盒中的24MLLAMP反应液，将IML待测样品的核酸加入到24ML LAMP反应液中，经瞬时离心混匀得待测样品反应液； (3)将待测样品反应液置60°C-62°C恒温40min进行LAMP扩增，然后80°C 5min进行酶的灭活；取出扩增反应管，对待测样品的核酸进行是否含有猪鼻支原体进行判定； 对上述的检验和检测结果的判定方法为如下方法之一或其结合 (1)在扩增反应管的LAMP产物中加入试剂盒中的适量的核酸染料IXSYBRGreen I，根据反应液的颜色变化的结果判断为如颜色变绿说明待测样品中存在猪鼻支原体，棕色说明待测样品中不存在猪鼻支原体； (2)或取5-8MLLAMP产物进行I. 5%琼脂糖电泳观察，如观察到梯状条带则说明待测样品中存在猪鼻支原体，没有梯状条带则说明待测样品中不存在猪鼻支原体； (3)或将LAMP产物进行7000r/min离心5min，观察，如出现沉淀则说明待测样品中存在猪鼻支原体、没有沉淀则说明待测样品中不存在猪鼻支原体。
全文摘要
本发明属于卫生检验领域，涉及一种用于检测猪鼻支原体的LAMP试剂盒及其建立的方法和应用。该试剂盒主要包含由四条LAMP引物的LAMP反应液和阳性模板及核酸染料组成。经检测验证，本发明试剂盒具有良好的特异性、灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便。本发明的检测体系在60℃-62℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏度地检测到猪鼻支原体，不需要复杂仪器，能较好满足对猪鼻支原体的现场检测，为兽医安全卫生的检测提供了新的技术平台，能较好的满足目前对猪场养殖现场检测的迫切需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
文档编号C12R1/35GK102653797SQ20121017078
公开日2012年9月5日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者冯志新, 刘茂军, 杜改梅, 熊祺琰, 白方方, 邵国青 申请人:江苏省农业科学院