一种猪肺炎支原体环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪肺炎支原体的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎 (mycoplasmalpneumoniaofswine，MPS)，也称猪气喘病的一种重要的病原，由Goodwin (1964)首次从无细胞培养基中分离出，随后上海农业科学院畜牧兽医研究所于1973年首 次分离到致病性毒株，该病原主要引起猪以咳嗽和气喘为主要症状的慢性接触性呼吸道传 染病。
[0003] Mhp可通过空气传染，很难隔离和阻断其传播途径，造成猪气喘病发病率高，流行 范围广，在世界各地广泛传播，以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低病死率为特点。 病猪长期生长发育不良，生长率和饲料转化率降低，感染后引起猪免疫力降低，临床上经常 与多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪繁殖与呼吸综合症病毒等混合感染，是猪呼吸道 综合症（porcinechronicrespiratoryinfectiousdisease，PRDC)的一个最重要的病 原，对养猪业的危害非常大，给养猪业造成严重的经济损失。
[0004] 对猪肺炎支原体的准确、快速检测，不仅有利于养殖场对猪喘气病做出正确的处 理措施，而且有利于其他猪呼吸道疾病的防治。现有对猪肺炎支原体的病原检测方法中， 病原分离是猪支原体肺炎确诊的最准确的方法，但目前猪肺炎支原体的体外分离培养和鉴 定，难度大、灵敏度低、耗时、需要复杂的设备及培养条件，所以在发展中国家及我国临床条 件有限的地区，建立一种简单、快速的诊断方法就显得尤为重要。聚合酶链式反应（PCR)法 等虽然特导性和敏感性都较高，但却需要昂贵的PCR仪、电泳槽等精密仪器，不适用于基层 开展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪肺炎支原体的方法，公 开一种快速、实时定量的检测猪肺炎支原体环介导等温扩增试剂盒。为实现本发明目的所 使用的技术方案为：一种猪肺炎支原体环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、 2X反应缓冲液、BstDNA聚合酶、荧光目视检测试剂、超纯水和猪肺炎支原体DNA模板，所 述的LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)、内引物FIP(SEQID NO:3)与BIP(SEQIDNO:4)和环引物LF(SEQIDNO:5)与LB(SEQIDNO:6);其中引 物的序列分别为： F3 AGGCAGCAACTTCAACAA B3 ATCAGATCCAGTAATTAGTCGA FIPGGCGCTGGACTTAAATTAGCTCAAAAAACCAGGATGCACAA BIPATTGCCCCTGAAAATGGAAGTTCATAGGCAACAATCGGAAT LFGCTTGCTGAGTGAGTCAGTTAT LBAGTTGGAACTGCTGTTAATACA 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0006] 所述的猪肺炎支原体DNA模板，是使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取的猪肺炎 支原体培养物或疑似感染猪肺炎支原体的临床病变肺组织的基因组DNA。
[0007] 所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0008] 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL25-60mM、KCL15-40mM、MgS04 10-20mM、 (NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0.3-0.8%、Betaine1.5-4M和dNTPs2.5-5mM，其配制方 法在pH为8. 5左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0009] -种猪肺炎支原体环介导等温扩增试剂盒的应用，用于检测疑似猪支原体肺炎或 检测疑似感染猪肺炎支原体的临床病变肺组织是否存在猪肺炎支原体，具体检测步骤包 括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 猪肺炎支原体DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
[0010] 所述的LAMP反应体系建立以25μL计， 2X反应缓冲液 12. 5yL Bst DNA聚合酶 1μL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5pmol LF 20 pmol LB 20 pmol 猪肺炎支原体DNA 2 μL 超纯水 补足25μL。
[0011] 所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测的方法。
[0012] 所述的LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控。
[0013] 本发明的实质性特点和显著的进步是： 1)特异性强 本发明的LAMP方法特异性检测出猪肺炎支原体，所检测的阴性对照支原体、细菌和水 对照均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。
[0014] 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为1. 50X10-5ng/μL，而使用本发明的LAMP检测方法，检 测限约为1.50X10-7ng/μL，是普通PCR的100倍。
[0015] 3)迅速获得结果 普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在 反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析来判读结果，从基因组DNA提取到获 取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在13分钟左右出现扩 增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过 肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管底部有明 显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳性反应管在紫 外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像 或者开盖加入荧光染料进行来判读结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时 内完成。
[0016] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在反 应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖，有效的避免污染试 验环境。此外，本发明的LAMP检测方法在结果判读上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度 值来判定结果，可不进行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要 开盖，能有效避免污染。
[0017] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeter real-time LA-320池度仪来实时分析LAMP反应的结果，不 同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求 出各时间的猪肺炎支原体拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明猪肺炎支原体LAMP检测方法的特异性结果；其中1 :猪肺炎支原体； 2 :绵羊肺炎支原体；3 :中度无胆留原体；4 :丝状支原体；5 :大肠杆菌；6 :2型链球菌；7 :沙 门氏菌；8 :波氏杆菌；9 :空白对照(水)。结果显示猪肺炎支原体反应管出现浊度的上升曲 线，为阳性结果，3株对照支原体反应管、4株对照细菌反应管和水对照反应管均无扩增，为 阴性结果。
[0019] 图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪肺炎支原体敏感 性检测的结果，其中M:Mark;1 :1· 50X10ng/yL;2 :1· 50ng/yL;3 :1. 50X10-lng/yL; 4 ：1. 50X10-2ng/yL； 5 : 1· 50X10_3ng/μL;6 : 1· 50X10_4ng/μL;7 : 1· 50X10_5ng/ μL;8 : 1· 50X10-6ng/μL;9 : 1· 50X10-7ng/μL; 10:water。猪肺炎支原体原始DNA的起始浓度为1. 50X10ng/μL，经10倍倍比连续 稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的LAMP法检测限约为1. 50X10-7ng/μL， 而普通PCR方法检测限约为1. 50Χ10-5ng/μL。
[0020] 图4是本发明猪肺炎支原体LAMP检测方法的荧光可视化检测结果：左管为以猪肺 炎支原体基因组DNA为模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性 结果。
[0021 ]图5是本发明猪肺炎支原体LAMP检测方法定量标准曲线；利用不同的标准样品的 浓度对应的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪肺 炎支原体拷贝数。
【具体实施方式】
[0022] 1、材料的准备 猪肺炎支原体、绵羊肺炎支原体、中度无胆留原体、丝状支原体、大肠杆菌、链球菌2 型、沙门氏菌和波氏杆菌，为广西兽医研究所分离鉴定和保存。LAMPDNA扩增试剂盒购自北 京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204 ;细菌基因组DNA提取试剂盒购自康为世纪生物科 技有限公司，货号CW0552。
[0023] 2、LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的猪肺炎支原体P46基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物， 其中F3、B3为猪肺炎支原体PCR检测引物，其中 F3 AGGCAGCAACTTCAACAA B3 ATCAGATCCAGTAATTAGTCGA FIPGGCGCTGGACTTAAATTAGCTCAAAAAACCAGGATGCACAA BIPATTGCCCCTGAAAATGGAAGTTCATAGGCAACAA