绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法，其中试剂盒借助生物信息平台进行大规模基因组分析，根据绿色魏斯氏菌的recN基因设计了四条特异性引物，结合LAMP技术，针对绿色魏斯氏菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低和操作简便等优点，可用于食品、环境以及临床等样品的安全快速检测。
【专利说明】
绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩増快速检测试剂盒及检测方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种利用环介导恒温基因扩增(loop-mediated isothermalamplificat1n of DNA，LAMP)技术进行菌样快速检测的生物检测试剂，属于绿色魏斯氏菌的快速基因分子诊断试剂技术领域，具体涉及一种绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]绿色魏斯氏菌(/feisse_/_/aKi_ric/esce/3s)属于乳杆菌目(Zac1/?aci_/_/a_/es)明串珠菌科(let/co/jos1caceae)魏斯氏菌属(。该菌在微观和宏观形态方面与乳酸菌的其它代表菌株相似，特别是容易与明串珠菌(IeuccMos1c)和乳杆菌(Zac1hciDtAs)相混淆。绿色魏斯氏菌为革兰氏阳性菌，呈不规则的短杆状，两端呈圆形或稍细小，成对或短链排列;在MRS琼脂培养基上形成透明的小菌落，呈微隆起圆形轮廓。
[0003]绿色魏斯氏菌具有异型发酵性新陈代谢，能够参与食品特别是肉制品的腐败变质。当暴露于氧气中时，一些肉制品，如香肠、真空包装肉、烟熏肉等会出现变绿的现象。研究认为，绿色魏斯氏菌是造成肉制品表明出现黏液并发绿的主要原因。黏液起初在单个菌落上出现，之后便逐渐形成一片绿色的黏液，并从肉制品的表面往内部渗透。存在于肉制品中的某些细菌会通过其正常的生理活动产生过氧化氢，而绿色魏斯氏菌具有较低的氧化还原电位，能够造成过氧化氢在肉制品中的积累。过氧化氢通过氧化亚硝基肌色原，最终导致肉制品发绿。绿色魏斯氏菌已经成为威胁肉制品质量与安全的重要腐败菌，给肉类加工行业造成显著的经济损失。
[0004]然而，目前针对绿色魏斯氏菌的检测方法十分有限。传统的鉴定方法需要经过前增菌、选择性培养基再次增菌、培养物在含一种或多种抑制被检菌生长制剂的平板上划线培养、对肉眼可见的特征性菌落进行确认、并对该菌落进行一系列生化和血清型检测做出鉴定等，耗时较长，操作繁琐，且结果可靠性低；扩增核糖体DNA限制性分析(amplifiedribosomal DNA restrict1n analysis,，ARDRA)能够在种的水平上区分魏斯氏菌，但是操作步骤繁琐(PCR扩增，酶切和聚类分析)，需要专门的仪器(PCR仪)及多种限制性内切酶，成本较高;实时荧光定量PCR技术已成功用于绿色魏斯氏菌的分子鉴定，该方法虽然具有准确性好、灵敏度高、特异性强等优点，但是实验所必须的实时荧光定量PCR仪价格昂贵，难以广泛应用与现场检测。
[0005]DNA环介导恒温核酸扩增技术(LAMP)是一种新型的恒温核酸扩增方法，此技术克服了以往基因扩增方法的不足，能够在恒温条件下进行核酸的扩增，具有简单、快速、成本低和特异性强等优点，适于现场检测，有较好的应用性。
【发明内容】
[0006]本发明解决的技术问题是提供了一种快速灵敏准确的绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法。
[0007]本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括:
(1)反应液I:由10臟01/1脱氧核苷三磷酸((1阶？)、10 X ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁(MgS04)、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水(ddH20)组成；
(2)反应液2:由1(^11101/1外引物1(卩3)、1(^11101/1外引物2(83)、4(^11101/1内引物1(卩1?)和40ymol/L内引物2(BIP)组成，引物序列如下:
外引物 1: CTTTGCTCAACGCAACAG、
外引物2: ATTTTCGCGTCGCTCATG、
内引物1:ACCTGCATTAACGCTTGGTG-GAAGTGGGCAATCATTTGG、
内引物2: TAGATGAATACGCATCAAACGCT-CTAACTGTCGATACTCCGC ；
(3)8U/yLBst DNA聚合酶；
(4)显色剂:10wt%SYBR Green I荧光染料;
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液I折合每样品19yL，其组成为:I Ommo I /L脱氧核苷三磷酸(dNTP ) 4yL、1 X ThermoPo I Buffer 反应缓冲液 2.5yL、150mmo I/L硫酸镁(18304)]^、511101凡甜菜碱541^和灭菌双蒸水((1(1!120)6.541^反应液2折合每样品341^，其组成为:10ymol/L外引物1斤3)0.541^、1(^11101/1外引物2(83)0.541^、4(^11101/1内引物1(FIP)IyL 和 40ymol/L 内引物 2(BIP)lyL。
[0008]本发明所述的绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为:
步骤(I)，提取待检样品的基因组DNA 采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA;
步骤(2)，环介导恒温扩增反应
首先取2yL待检样品基因组DNA溶液，加入19yL反应液l、3yL反应液2和IyL Bst DNA聚合酶，再将配置好的反应体系于65°C扩增反应50-70min后取出待检；
步骤(3)，分析判断反应结果
在反应产物中加入IyL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
[0009]本发明具有以下有益效果:rec#基因是魏斯氏菌重组和修复蛋白基因，在魏斯氏菌不同种之间存在差异。本发明基于绿色魏斯氏菌的reel基因设计了四条特异性引物，该基因序列为绿色魏斯氏菌所共有，以保证检测不同来源的绿色魏斯氏菌的可靠性。本发明采用LAMP技术，针对绿色魏斯氏菌建立了快速灵敏准确的检测方法，并构建用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的快速检测试剂盒和检测方法，在反应后可通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，具有检测时间短、特异性强、仪器设备要求低和操作简便等优点，可用于食品、环境以及临床等样品的安全快速检测。
【附图说明】
[0010]图1是不同菌株的阳性扩增结果对比图，其中I号反应管内样品为绿色，2-8号反应管内样品为橙色。
【具体实施方式】
[0011]以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
[0012]实施例1
绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法的建立步骤一，引物的设计、合成试剂盒的组装:
本实施例确定用于检测的引物序列如下:
外引物 1: CTTTGCTCAACGCAACAG、
外引物2: ATTTTCGCGTCGCTCATG、
内引物1:ACCTGCATTAACGCTTGGTG-GAAGTGGGCAATCATTTGG、
内引物2: TAGATGAATACGCATCAAACGCT-CTAACTGTCGATACTCCGC。
[0013]在此基础上设计绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括:
(1)反应液I:由1mmo 1/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)、10 X ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁(MgS04)、5 mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水(ddH20)组成；
(2)反应液2:由1(^11101/1外引物1(卩3)、1(^11101/1外引物2(83)、4(^11101/1内引物1(卩1?)和40ymol/L内引物2(BIP)组成；
(3)8U/yLBst DNA聚合酶；
(4)显色剂:10wt%SYBR Green I荧光染料;
上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液I折合每样品19yL，其组成为:I Ommo I /L脱氧核苷三磷酸(dNTP ) 4yL、1 X ThermoPo I Buffer 反应缓冲液 2.5yL、150mmo I/L硫酸镁(18304)]^、511101凡甜菜碱541^和灭菌双蒸水((1(1!120)6.541^反应液2折合每样品341^，其组成为:10ymol/L外引物1斤3)0.541^、1(^11101/1外引物2(83)0.541^、4(^11101/1内引物1(FIP)IyL 和 40ymol/L 内引物 2(BIP)lyL。
[0014]步骤一■，待检样品的制备:米用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA:
检测菌种绿色魏斯氏菌(riric/esce/3s)为本实验室所保存，编号N08。使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取样品基因组DNA。
[0015]步骤三，进行环介导恒温扩增反应:
首先取2yL待检样品基因组DNA溶液，加入19yL反应液l、3yL反应液2和IyL Bst DNA聚合酶，再将配置好的反应体系于65°C扩增反应50-70 min后取出待检。
[0016]步骤四，分析判断反应结果:
在反应产物中加入IyL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明待检菌株为绿色魏斯氏菌。
[0017]实施例2
阴性对照
步骤一，引物的设计、合成试剂盒的组装:
本实施例确定用于检测的引物序列同实施例1。
[0018]在此基础上设计绿色魏斯氏菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括:(1)反应液1:由10mm〇l/L脱氧核苷三磷酸(dNTP)、10 X ThermoPol Buffer反应缓冲液、 150mmol/L硫酸镁(MgS〇4)、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水(ddH20)组成；(2)反应液2:由 lOwnol/L外引物l(F3)、10wnol/L外引物2(B3)、40wnol/L内引物l(FIP) 和 40wnol/L 内引物2(BIP);(3)8U/yL Bst DNA聚合酶；(4)显色剂:10wt% SYBR Green I荧光染料；上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液1折合每样品19此，其组成为: 1 Ommo 1 /L 脱氧核苷三磷酸(dNTP ) 4yL、10 X ThermoPo 1 Buffer 反应缓冲液2 ? 5yL、150mmo 1 /L 硫酸镁(183〇4)1此、5111〇1凡甜菜碱5此和灭菌双蒸水((1(1112〇)6.5此;反应液2折合每样品3此， 其组成为:10_〇l/L外引物1斤3)0.5此、10_〇1/1外引物2(83)0.5此、40_〇1/1内引物1 (FIP)lyL 和 40wnol/L 内引物 2(BIP)lyL。[0〇19]步骤_■，待检样品的制备:米用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA:使用北京天根生物工程公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取粪肠球菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳明串球菌、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌和希腊魏斯氏菌7种细菌的基因组DNA。
[0020]步骤三，进行环介导恒温扩增反应:首先取2yL待检样品基因组DNA溶液，加入19yL反应液1、3此反应液2和lyL Bst DNA聚合酶;再将配置好的反应体系于65°C扩增反应50-70min后取出待检。[0021 ]步骤四，分析判断反应结果:在反应产物中加入lyL显色剂，混匀，静置2min，肉眼观察颜色变化，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
[0022]如图1所示，编号为1-8的反应管分别对应绿色魏斯氏菌、粪肠球菌、植物乳杆菌、 副干酪乳杆菌、乳明串球菌、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌和希腊魏斯氏菌。
[0023]所述实施例1与实施例2中各阴性对照组比较，实施例1中产生阳性扩增结果，如图 1中1号反应管，而实施例2阴性对照菌株没有产生阳性扩增结果，如图1中2-8号反应管，从而证明本试剂盒及检测方法具有较强的特异性，对绿色魏斯氏菌以外的其它菌株不会产生假阳性结果。
[0024]SEQUENCE LISTING 〈11〇>河南师范大学〈120>绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法 <160>4<170> Patentln vers1n 3.3<210> 1<211> 18<212> DNA〈213>人工序列<400>1ctttgctcaa cgcaacag18<210> 2 <211> 18 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400>2attttcgcgt cgctcatg18<210>3<211>39<212> DNA〈213>人工序列〈400>3acctgcatta acgcttggtg gaagtgggca atcatttgg39<210>4〈211〉42〈212〉 DNA〈213〉人工序列〈400> 4tagatgaata cgcatcaaac gctctaactg tcgatactcc gc42以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围。
【主权项】
1.绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于包括: (I )反应液I:由I Ommo I/L脱氧核苷三磷酸、10 X ThermoPol Buffer反应缓冲液、150mmol/L硫酸镁、5mol/L甜菜碱和灭菌双蒸水组成； (2 )反应液2:由I Ομπιο I /L外引物1、I Oymo I /L外引物2、40ymo I /L内引物I和40ymo I /L内弓丨物2组成，引物序列如下: 外引物 1: CTTTGCTCAACGCAACAG、 外引物2: ATTTTCGCGTCGCTCATG、 内引物1:ACCTGCATTAACGCTTGGTG-GAAGTGGGCAATCATTTGG、 内引物2: TAGATGAATACGCATCAAACGCT-CTAACTGTCGATACTCCGC ； (3)8U/yLBst DNA聚合酶； (4)显色剂:10wt%SYBR Green I荧光染料; 上述环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒中反应液I折合每样品19yL，其组成为:I Ommo 1/L脱氧核苷三磷酸4yL、1 X ThermoPo I Buffer反应缓冲液2.5yL、150mmo 1/L硫酸镁lyL、5mol/L甜菜碱5yL和灭菌双蒸水6.5yL;反应液2折合每样品3yL，其组成为:lOymol/L外引物I 0.5yL、10ymol/L外引物2 0.5yL、40ymol/L内引物I IyL和40ymol/L内引物2 IyL02.—种权利要求1所述的绿色魏斯氏菌环介导恒温基因扩增快速检测试剂盒的检测方法，其特征在于具体步骤为: 步骤(I)，提取待检样品的基因组DNA 采用试剂盒提取法制备待检样品基因组DNA; 步骤(2)，环介导恒温扩增反应 首先取2yL待检样品基因组DNA溶液，加入19yL反应液l、3yL反应液2和IyL Bst DNA聚合酶，再将配置好的反应体系于65°C扩增反应50-70min后取出待检； 步骤(3)，分析判断反应结果 在反应产物中加入UiL显色剂，混匀，静置2min，若反应液显现绿色即为阳性，橙色则为阴性。
【文档编号】C12Q1/68GK106086206SQ201610593823
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月26日 公开号201610593823.9, CN 106086206 A, CN 106086206A, CN 201610593823, CN-A-106086206, CN106086206 A, CN106086206A, CN201610593823, CN201610593823.9
【发明人】姜晓冰, 于涛, 田金河, 董斌, 周丹蕾, 任敏
【申请人】河南师范大学