基于环介导等温扩增技术的h5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法

专利名称：基于环介导等温扩增技术的h5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种基于环介导等温扩增 技术的H5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法。 疼豕伎不
目前对H5禽流感病毒有多种检测方法，从以病原微生物分离鉴 定、形态学鉴定和血清学鉴定为主的国家标准(GB/T 18936—2003)， 到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技 术等分子生物学检测方、法(GB 19438.1-2004、 GB/T 19439-2004)。 其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很 大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学 检测旧模式，不需要对微生物进行分离提纯，而直接用样品或样品的 增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及 生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。
以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实 际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要 专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光 实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交 叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术 中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快 速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确 性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最 新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中等 温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测 技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(LAMP) 具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测结核 分歧杆菌的基因快速诊断试剂盒。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、 使用方便、检测快速高效、灵敏度高的基于环介导等温扩增技术的 H5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒，该试剂盒是基于环介导等温扩 增技术来检测H5禽流感病毒的。
本发明的另一个目的是提供上述H5禽流感病毒基因快速诊断 试剂盒的检测方法。
本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的
一、本发明的H5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒，是由两对引 物、B"DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、 显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，其中 所述两对引物为
外引物F3: GAC AGAGC AGGTTGAC AC;夕卜弓I物B3: CCTTCTCCACTATGTAAGACC;
内引物FIP: TAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACA CATGCCCAAG;
内引物BIP: GATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGG CACATTGATGA;
上述反应液含有1.6 2mmol/L dNTP、 20 25mmol/L Tris-HCl、 10 12.5mmol/L氯化钾、10 12.5mmol/L硫酸铵、8 10mmol/L硫酸 镁、0.1 0.125%TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP 各1.6 2mol/L和外引物F3/B3各0.2 0.25mol/L。优选的比例是反 应液含有2mmol/L dNTP、 25mmol/L Tris-Cl、 12.5mmol/L氯化钾、 12.5mmol/L硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125 %TritonX-100、 lmol/L 甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。 (0.1 0.125XTritonX-100是Triton X-100占反应液的体积百分比为0.1 0.125%)
上述逆转录酶优选为AMV逆转录酶。
上述阳性对照为携带H5禽流感病毒基因的质粒DNA。
上述显色液优选为SYBR Green I或EvaGreen。
上述稳定液优选为石蜡油。
二、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺
1、 将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制， 浓度检测，抽样质检；
2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；3、 将稳定液无菌分装，抽样质检；
4、 将逆转录酶无菌分装，抽样质检；
5、 将RNA酶抑制剂无菌分装，抽样质检；
6、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
7、 组装试剂盒。
三、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法
1、 样品处理
样品的采集、保存和处理，可采用GB/T 18936—2003中2.1款 进行；
提取样品核酸，可采用GB/T 19439-2004进行样品核酸提取获 得样品模板或使用等同的商品化核酸提取试剂盒按说明书操作提取 RNA模板。
2、 环介导等温扩增技术反应过程
在反应管中加入反应液38 40体积％、 Bst DNA聚合酶0.9 1.8体积％、逆转录酶0.9 L8体积％、 RNA酶抑制剂0.9 1.8体 积％、稳定液52 54.5体积X、样品模板RNA4.5 7.3体积％，63 65"C恒温反应45 90min。所述体积百分比是指占六个组分总体积 的体积百分比。
3、 反应后处理
在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组 显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。
本发明所说的基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isotherm
al amplication of DNA，简称LAMP)快速检测H5禽流感病毒的方 法，是利用DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、 外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上 的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链 合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结 构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP析出的焦磷 酸根离子与反应溶液中的Mg^结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白 色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 6 5°C)条件下45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没 有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、 容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的 技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器 设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、 快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术 (包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏 度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且 不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检 测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒 出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合 生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2 3天，完成 鉴定报告需10 15天；采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2 小时。并且，本发明的反应液中加入了显色液，鉴定结果更为直观 清晰。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果l.本发明的基因快 速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与 设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段， 四条引物，根据是否扩增就能判断耙标物质的存在与否，因此具有 高特异性；3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到 l小时即可完成扩增，且产率高；4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵 敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试 剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2 +结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加 入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。
具体实施例方式
实施例l试剂盒的制备
(1) 按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物 夕卜弓I物F3: GACAGAGCAGGTTGACAC;
外引物B3: CCTTCTCCACTATGTAAGACC; 内引物FIP: TAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACA CATGCCCAAG;
内引物BIP:
GATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGGCACATTGATGA;
(2) 购置DNA聚合酶fofDNA聚合酶置于容器。
(3) 配制反应液反应液含有2mmol/LdNTP、 25mmol/L Tris-Cl、 12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L硫酸铵、10mmol7L硫酸镁、0. 125体积XTritonX-100、 lmol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol/L 和外引物F3/B3各0.25mol/L，置于容器。
(4)购置逆转录酶AMV逆转录酶置于容器。
(5) 购置RNA酶抑制剂RNA酶抑制剂置于容器。
(6) 购置稳定液石蜡油，置于容器。
(7) 购置显色液SYBRGreenI，置于容器。
(8) 提取阳性对照提取含H5禽流感病毒基因的质粒DNA，置 于容器。
(9) 将上述8个容器装成试剂盒，封装。 制备工艺简述如下
1、 将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制， 浓度检测，抽样质检；
2、 将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、 将稳定液分装，抽样质检；
4、 将BW酶分装，抽样质检；
5、 将逆转录酶分装，抽样质检；
6、 将RNA酶抑制剂分装，抽样质检；
7、 将阳性对照标本制备，分装，抽样质检； .8、将显色液分装，抽样质检；
9、组装试剂盒。
实施例2试剂盒的制备
反应液的配方为反应液含有1.6mmol/LdNTP、 20mmol/L Tris-Cl、 10mmol/L氯化钾、10mmol7L硫酸铵、8mmol/L硫酸镁、 0.1体积XTritonX-100、0.8mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol/L 和外引物F3/B3各0.2mol/L。
显色液为EvaGreen。
其他同实施例1。
实施例3 H5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒的应用
1、 样品处理(模板RNA提取)
按照GB/T 18936—2003中2.1款的方法采集样品，
按照GB/T 19439-2004的方法进行样品核酸提取获得样品模板。
2、 环介导等温扩增技术的反应过程
(1)在200^1反应管配制反应体系反应液22^1， fi^DNA聚合 酶0.5[il (4U)， AMV逆转录酶0.5jJ、 RNA酶抑制剂0.5^1、稳定液 30|il，模板RNA2.5ji1。
(2)将配制好的反应管于63'C恒温反应lh。
3、 反应后处理
向上述反应管中加入2^1 SYBR Green I，混匀，同时也向阳性对 照管(提取含H5禽流感病毒基因的质粒DNA)中加入SYBR Green I混匀，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙 色则为阴性。
权利要求
1、基于环介导等温扩增技术的H5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒，其特征在于由两对引物、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中，上述两对引物为外引物F3GACAGAGCAGGTTGACAC；外引物B3CCTTCTCCACTATGTAAGACC；内引物FIPTAGATCGCAGAGCTTCCCGTTTTTACTGTTACACATGCCCAAG；内引物BIPGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTTTATTCCGGCACATTGATGA；上述反应液含有1.6～2mmol/L dNTP、20～25mmol/L Tris-Cl、10～12.5mmol/L氯化钾、10～12.5mmol/L硫酸铵、8～10mmol/L硫酸镁、0.1～0.125％TritonX-100、0.8～1mol/L甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol/L和外引物F3/B3各0.2～0.25mol/L；上述阳性对照为携带H5禽流感病毒基因的质粒DNA。
2、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述显色液为SYBR Green I或EvaGreen。
3、 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应液含有 2mmol/L dNTP、 25mmol/LTris-Cl、 12.5mmol/L氯化钾、12.5mmol/L 硫酸铵、10mmol/L硫酸镁、0.125%TritonX-100、 lmol/L甜菜碱、内 引物FIP/BIP各2mol/L和外引物F3/B3各0.25mol/L。
4、 利用权利要求1所述试剂盒检测H5禽流感病毒的方法，其 特征在于该方法包括如下步骤(1) 采集样品；(2) 提取样品核酸；(3) 在反应管中加入反应液38 40体积％、 Bst DNA聚合酶0. 9 1.8体积％、逆转录酶0.9 1.8体积％、 RNA酶抑制剂0.9 1.8 体积％、稳定液52 54.5体积％、样品模板DNA 4.5 7.3体积％，恒温反应；(4) 在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样 品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。
5、 根据权利要求4所述检测方法，其特征在于步骤(3)中，恒 温反应的反应条件为温度63 65"C，反应时间45 90min。
6、 根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述稳定液为石 蜡油。
7、 根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述逆转录酶为 AMV逆转录酶。
8、 根据权利要求1所述检测方法，其特征在于所述显色液为S YBR Green I或EvaGreen。
全文摘要
本发明提供一种基于环介导等温扩增技术的H5禽流感病毒基因快速诊断试剂盒及其检测方法，该试剂盒由两对引物、DNA聚合酶、反应液、逆转录酶、RNA酶抑制剂、稳定液、显色液和阳性对照液组成，以上八种液体分别置于容器中。本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性。本发明的基因快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备。本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，更加明显可靠。
文档编号C12Q1/68GK101338345SQ200810030108
公开日2009年1月7日 申请日期2008年8月12日 优先权日2008年8月12日
发明者曹以诚, 晖 李, 李志勇, 杜正平, 柯昌文, 王志强, 谭惠媚, 洵 陈 申请人:广州华峰生物科技有限公司