一种猪流行性腹泻病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及微生物检测技术领域，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪流行性腹泻病毒的环介导等温扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 猪流行性腹泻（porcineepidemicdiarrhea,PED)是一种由猪流行性腹泻病毒 (porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起的猪的一种高度接触性肠道传染病。PEDV 主要通过粪-口消化道传播，该病流行范围广，呈暴发性流行，传播速度快，不同年龄、性别 和品种的猪均可感染，其中对哺乳仔猪的感染率高，致死率可达100%。
[0004] 猪流行性腹泻于1971年在英国首次被报道，1976年在比利时、英国法国、荷兰、德 国等多个欧洲国家流行，之后该病迅速蔓延至亚洲，并在多个养猪国家暴发性大流行。近年 来，PED呈高发态势，2007年下半年泰国暴发PED，新生仔猪死亡率高达100% ;PED已蔓 延美国13个州且难以控制，疫情暴发导致哺乳仔猪大规模死亡，目前PED已成为世界主要 的流行性疾病，是各养猪国家导致仔猪早期死亡的重要疫病之一。2010年以来，我国南方 超过10个省份暴发PH)疫情，导致超过100万头哺乳仔猪死亡，死亡率为100%。大量仔猪 死亡导致猪肉价格严重下跌，给我国养猪业造成了极大的经济损失。由于PED的发病日龄 小，感染率、死亡率高，因此很有必要对猪流行性腹泻的快速诊断方法进行研究来有效而快 速地防控PED。
[0005] 对猪流行性腹泻病毒的快速准确诊断是临床上防治猪流行性腹泻的关键。目前实 验室诊断PEDV的方法大致可分为2类：①血清学方法，如ELISA方法、血清中和实验、免疫 荧光等；②分子生物学方法。血清学方法特异性不够高，难以满足临床特别是基层兽医临床 诊断的需求。分子生物学方法包括普通RT-PCR、实时荧光定量PCR，虽然PCR方法较病毒分 离鉴定方法快速准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝 胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决基层检测猪流行性腹泻病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问 题，提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，为实现本发明目的 所使用的技术方案为：一种猪流行性腹泻病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包 括RT-LAMP引物、2X反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪流行性腹泻病毒RNA 模板；所述的RT-LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)与B3(SEQIDN0:2)、内引物 FIP(SEQIDN0:3)与BIP(SEQIDN0:4)和环引物LF(SEQIDN0:5)与LB(SEQID NO：6)； 其中： F3CCGACAGGTCTGCATTCC B3CCGGACATAGAAGGCCCAA FIPCCTGTACGCCAGTAGCAACCTTGAGCACCAACTGGTGTAACG BIPTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCCAGTGCCAGATGAAGCAT LFCAAGCAATGTACCACTAAGGAGT LBAACAATTGTCTACGGACGTGTT； 所述的 2X反应缓冲液是Tris_HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0007] 以上所述的猪流行性腹泻病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提 取的猪流行性腹泻病毒的RNA。
[0008] 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。
[0009]以上所述的 2X反应缓冲液包括Tris-HCL35-50mM、KCL15-35mM、MgS04 15-20mM、（NH4)2S04 15-25mM、Tween20 0· 4-0. 8%、Betaine1· 5-3. 0M和dNTPs2. 5-4mM， 其配制方法在pH为8. 7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0010] 一种猪流行性腹泻病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检 测疑似猪流行性腹泻病变组织或猪粪便排泄物中是否含有猪流行性腹泻病毒，具体检测步 骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪流行性腹泻病毒RNA模板的提取 (3) RT-LAMP反应体系建立 (4) RT-LAMP检测方法。
[0011] 以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25μ1计， 2X反应缓冲液 12. 5yL EM 1 yL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20 pmol LB 20 pmol F3 5pmol B3 5pmol 猪流行性腹泻病毒RNA 5 yL 超纯水 补足25 μL。
[0012] 以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测 的方法。
[0013] 以上所述的RT-LAMP检测方法采用LoopampLA-320C实时浊度仪进行密闭全程监 控，反应温度为63°C、反应在10-30分钟间出现扩增。
[0014] 本发明的实质性特点和进步是： 1)特异性强 本发明的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出 来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
[0015] 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为1. 08X10 5ng/μL，而使用本发明的RT-LAMP检测方法， 检测限约为1.08X10 7ng/μL，是普通PCR的100倍。
[0016] 3)迅速获得结果 普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应 方法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA 提取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的RT-LAMP检测方法反应在12分钟 左右出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进 行比较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反 应管底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物；或加入荧光染料，阳 性反应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫 外线分析显像来判定结果，从基因组RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
[0017] 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本发明的荧光染料是在 反应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。此外，本发明的 RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进 行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
[0018] 5)可实时定量 本发明利用Tubidimeter real-time LA-320池度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果， 不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可 求出各时间的猪流行性腹泻病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明的RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1:猪流行性腹泻病毒；2:猪 繁殖障碍与呼吸综合征病毒；3 : 口蹄疫病毒；4 :猪瘟病毒；5 :猪圆环病毒2型；6 :猪细小 病毒；7 :猪传染性胃肠炎病毒；8 :猪伪狂犬病毒；9 :空白对照(水)。结果显示猪流行性腹泻 病毒反应管出现浊度的上升曲线，7株对照病毒反应管和水对照反应管均无扩增。
[0020] 图2和图3是分别使用本发明RT-LAMP方法和普通RT-PCR方法进行的猪流 行性腹泻病毒敏感性检测的结果。其中1:1.08x1ο1ng/μL;2 :1. 08X10°ng/μL;3: 1. 08X10ng/yL； 4 ： 1. 08X10 2ng/μL；5 ： 1. 08X10 3ng/μL；6 ： 1. 08X10 4ng/μL；7 ： 1. 08X10 5ng/yL;8 :1. 08X10 6ng/yL;9 :1. 08X10 7ng/yL; 10 :水(空白对照)。猪流 行性腹泻病毒基因组RNA的起始浓度为1. 08X101ng/μL，经10倍倍比连续稀释后，进行 RT-LAMP和PCR扩增，结果显示本发明的RT-LAMP法检测限约为1. 08X10 7ng/μL，而普通 PCR方法检测限约为1. 08X10 5ng/μL。
[0021] 图4是加入荧光染料后肉眼观察结果：左管为以猪流行性腹泻病毒基因组RNA为 模板的反应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0022] 图5是本发明猪流行性腹泻病毒定量标准曲线：利用不同的标准样品的浓度对应 的浊度值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪流行性腹泻 病毒拷贝数。
【具体实施方式】
[0023] 1、材料的准备 猪流行性腹泻病毒、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病 毒2型、猪细小病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪伪狂犬病毒，均为市售疫苗。RT-LAMPRNA扩 增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204 ;病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒， 购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0548。
[0024] 2、RT_LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的猪流行性腹泻病毒Μ基因序列，利用RT-LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorerV4软件设计一套RT-LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引 物，LF和LB为环引物，其中 F3CCGACAGGTCTGCATTCC B3CCGGACATAGAAGGCCCAA FIPCCTGTACGCCAGTAGCAACCTTGAGCACCAACTGGTGTAACG BIPTTCGTCACAGTCGC