一种体外套式环介导等温扩增法的检测嗜肺军团菌的试剂及检测嗜肺军团菌的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种体外检测嗜肺军团菌的试剂及方法。
【背景技术】
[0002]嗜肺军团菌(Leg1nella pneumophila )于1976年首次在美国被发现，是一种革兰氏阴性条件致病菌，主要通过污染建筑物中的水系传播，易大规模爆发和流行。该菌感染后发病进程快，死亡率高。在西欧国家，每年军团菌的发病人数接近10万例。随着经济发展，中央空调的普遍使用，军团菌爆发的危险性日益增加，已有多个国家将军团肺炎列为法定传染病。我国卫生部2003年颁布了《集中式空调通风系统卫生规范》，目的就是为了切断嗜肺军团菌的传染源和传播途径。目前该菌是国境口岸微小环境重点关注的微生物病原体，也是卫生检疫在口岸卫生监督的重要环节，2007年曾经在杭州机场口岸有报道检出。
[0003]军团菌病的传播特点与军团菌的生存方式有很大关系。在人工水体中，供水温度较高，或者供水管道和蓄水池的管壁和池壁上形成积垢和生物膜，就会为军团菌的大量增殖提供适宜的环境和营养条件。冷却塔的循环水和空调的冷凝水，由于水温较高，管道中容易藏污纳垢，且容易形成死水区，为军团菌提供了良好的栖息和繁殖环境。空调通风系统中军团菌大量繁殖容易形成微生物气溶胶，如遇管道渗漏，冷却塔或蒸发凝水中染有军团菌，送风时，带菌的水即被吹成细小微粒或气溶胶。在夏秋季节，军团病容易发生在配备有封闭式中央空调的公共场所中，人群普遍易感。嗜肺军团菌培养要求苛刻，生长缓慢，一般从水样收集到培养鉴定需要7?10天。培养结果受标本采集质量、操作技术的影响，阳性率不一。血清免疫学方法灵敏度和特异性不高。新型等温扩增检测方法应用于嗜肺军团菌，可对嗜肺军团菌进行快速检测，提高检测效率，并控制在比较低的成本，并对仪器设备的要求较低，有利于在基层单位中的推广。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种体外套式环介导等温扩增法的检测嗜肺军团菌的试剂，可以用于快速准确地检测嗜肺军团菌。为此，本发明采用以下技术方案:
它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物Loop-f、环引物Loop-r，套弓丨物FNP、套引物BNP;引物基因序列如下:
外弓 I 物F3:GCTGCAACCGATGCCACA；
外引物B3: TTGGGCCAATAGGTCCGC ；
内引物FIP:
TTGCTGTTCGGTTAAAGCCAATTGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCG；
内引物BIP:
ACTGAAAACAAAAACAAGCCAGGCGCGTTGCTGGCTTACCAGTTT；
环引物Loop-f: CATGCAAGACGCTATGAGTGG ；环引物Loop-r: CGGGTTTAACACCATTTCCA ；
套引物FNP:
TTCAGCAGTACGCTTAGCCATCAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCG；
套引物BNP:
AAGCGGATGAAAATAAAGTAAAAGGGCCATCAATCAGACGACCAGTAT。
[0005]本发明第二个目的是提供运用上述试剂的体外新型高效等温扩增检测嗜肺军团菌的方法，可以快速准确地检测嗜肺军团菌。为此，本发明采用以下技术方案:
反应体系如下:引物混合物叫1，10\131^6^.541^，模板0嫩lyL，BstDNA聚合酶1 yL，浓度为8mol/L的甜菜碱2yL，浓度为100mmol/L的dNTP 1 yL，浓度为100mmol/L的MgSOU.2yL，Eva_greenlyL，加入灭菌去离子H20补足25yL混匀；各引物在引物混合物中浓度分别如下:F3、B3 各 lymol/L，FIP、BIP 各 15“11101/1丄00?^00?1各5411101/1，卩陬、8陬各15411101/1;
所述方法的步骤为:将阴性对照、阳性对照和待测样本分别按上述反应体系孵育63°C40-45分钟进行反应，结果判断可采用以下方式:
在荧光定量PCR仪上观察实时荧光曲线，出现S形扩增曲线者含有嗜肺军团菌，结果为阳性，未出现S形扩增曲线者，则为没有嗜肺军团菌，结果为阴性;或者:
取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，检测样本孔中如产生阶梯状条带则含有嗜肺军团菌，反之没有嗜肺军团菌。
[0006]环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplificat1n, LAMP)依赖于4条能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，不需要热变性的DNA作为模板，在恒温下就可进行高效、快速、高特异地扩增靶序列。
[0007]本发明所提供的检测嗜肺军团菌试剂，其引物之间的关系采用本发明所提供的体外套式快速环介导等温扩增方法中的方案，利用上述方案建立的套式恒温扩增嗜肺军团菌检测方法具有操作简便，高效、快速、特异性高的优点；该方法的建立，对样本的检测只需30-45分钟左右即可完成，比加入环引物的LAMP反应时间缩短30%-50%左右，对疾病的快速诊断具有重要的现实意义。
【附图说明】
[0008]图1为嗜肺军团菌等温扩增的特异性试验产物电泳结果，1:marker，2:标准株33152，3-4:嗜肺军团菌，5:长滩军团菌标准株，6:大肠杆菌，7:金黄色葡萄球菌，8:沙门氏菌9:阴性对照。
[0009]图2为嗜肺军团菌等温扩增的灵敏度试验产物电泳结果，Μ为marker，2为3X106拷贝 /VL，3 为3 X 105 拷贝 /VL，4 为3 X 104 拷贝 /yL，5为3 X 103 拷贝 /yL，6为3 X 102 拷贝 /yL，7为3X 101拷贝ΛΛ，8为7为3 X 10°拷贝ΛΛ，9为阴性对照。
[0010]图3为嗜肺军团菌不同方式等温扩增比较结果，1为套式LAMP扩增反应，2为加入环引物的LAMP扩增反应，3为阴性对照。
【具体实施方式】
[0011]实施例1嗜肺军团菌的检测。
[0012]引物设计。
[0013]根据嗜肺军团菌mip基因的保守序列，设计一系列引物，分别是外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物Loop-f、环引物Loop-r，套引物FNP、套引物BNP。引物基因序列如下:
外弓 I 物F3:GCTGCAACCGATGCCACA；
外引物B3: TTGGGCCAATAGGTCCGC ；
内引物FIP:
TTGCTGTTCGGTTAAAGCCAATTGTTGTCTTATAGCATTGGTGCCG；
内引物BIP:
ACTGAAAACAAAAACAAGCCAGGCGCGTTGCTGGCTTACCAGTTT；
环引物Loop-f: CATGCAAGACGCTATGAGTGG ；
环引物Loop-r: CGGGTTTAACACCATTTCCA ；
套引物FNP:
TTCAGCAGTACGCTTAGCCATCAAAATCAAGGCATAGATGTTAATCCG；
套引物BNP:
AAGCGGATGAAAATAAAGTAAAAGGGCCATCAATCAGACGACCAGTAT。
[0014]在上述引物中，外引物F3、B3和内引物FIP、BIP是常规环介导等温扩增法(LAMP)的引物；
加入环引物Loop-f、环引物Loop-r，可使LAMP反应中引物和核酸模板接触的位置增加2个;等温扩增反应不但能用套内引物FNP与BNP根据核酸模板进行扩增，同时也可以和外侧常规LAMP引物扩增的产物结合并扩增，使和核酸模板接触的位置又增加了 4个；
套内引物FNP不但可以和套内引物的BNP联合进行扩增反应，同时也能跟外侧的常规内引物BIP联合进行扩增，增大了与核酸模板结合和扩增的机会，反之，套内引物BNP也可以和套内引物的FNP联合进行扩增反应，同时也能跟外侧的常规内引物FIP联合进行扩增反应；
利用上述引物对目的基因进行环介导等温扩增，常规LAMP反应和加入环引物的LAMP的扩增产物只有1种产物的循环序列，加入环引物不改变产物的序列；在加入套内引物后，产物就是4种扩增产物的循环序列，即内引物FIP、BIP的扩增产物，套内引物FNP、BNP的扩增产物，内引物FIP和套内引物BNP的扩增产物，套内引物FNP和内引物BIP的扩增产物。
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