一种猪博卡病毒环介导等温扩增试剂盒及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明设及微生物检测技术领域，具体说是设及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪博卡病毒的环介导等溫扩增试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0003] 猪博卡病毒(Porcine bocavirus，PBoV)为无囊膜单股线状DNA病毒，属于细小病 毒科细小病毒亚科博卡病毒属，其基因组大小为5.2化左右。动物博卡病毒在20世纪60年 代早期就已被发现，早期的动物博卡病毒包括牛细小病毒（Bovine parvovirus，BPV)和 犬微小病毒（Canine minute virus,CnMV) 2种。2005年，人博卡病毒在一名表现为下呼 吸道疾病的瑞典儿童体内经PCR技术被首次鉴定。2009年瑞典A丄.Blomstrom等利用随机 多重置换扩增方法和高通量基因测序技术，从表现为PMWS的发病猪群中首次检出并鉴定 到猪博卡病毒。继首例报道后，美国、爱尔兰、乌干达等欧洲国家也相继发现PBoV,在中国的 河北、江苏、山东福建、广西、河南、新疆及香港等大部分地区均有检出。近年的资料表明，我 国的PBoVl的感染率为39.3%~63.2%，PBoV2的感染率为0.76%~6.6%，PBoV3的感染率 为12.59%~64.4%，PBoVS和PBoV4在香港的感染率为16.5%。W上数据表明各型别的猪博 卡病毒在我国猪群中已广泛存在。
[0004] 自2009年第一次发现猪博卡病毒W来，大量研究表明，从患断奶猪多系统衰竭综 合症PMWS的病猪组织、粪便等样本内均分离和检测到PBoVs,且病毒的检出率高于正常猪， 运提示PBoVs可能与PMWS的发生有一定关联。另外，该病与猪繁殖与呼吸综合征病毒（ PRRSV)、猪圆环病毒（PCV-2)及猪攝病毒（CSFV)的协同感染也会加剧运些疫病的发 生。因此，对猪博卡病毒病密切监测和快速诊断，有利于上述猪病的防治。
[0005] 目前，PBoV的检测技术主要有血清学方法和分子生物学方法。常规方法是间接免 疫巧光检测，其结果准确可靠，但存在操作复杂、需要抗原分离鉴定和抗体制备、所需时间 长的缺点，不利于猪博卡病毒病的快速诊断。分子生物学的方法是通过聚合酶链式反应 (PCR)方法检测猪博卡病毒病病毒的特异性基因，虽然PCR方法较常规方法快速准确，但需 要设计特异性强的引物和昂贵的仪器设备，成本较高，在结果判定上需要进行琼脂糖凝胶 电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，也不适合基层和现场检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种为基层简便、快捷准确地检测猪博卡病毒的方法，公开 一种快速、实时定量的检测猪博卡病毒环介导等溫扩增试剂盒。为实现本发明目的所使用 的技术方案为:一种猪博卡病毒环介导等溫扩增试剂盒，该试剂盒包括LAMP引物、2 X反应 缓冲液、Bst DNA聚合酶、巧光目视检测试剂、超纯水和猪博卡病毒DNA模板，所述的LAMP引 物包括外引物F3(SEQ ID N0:1)与B3(SEQ ID N0:2)、内引物FIP(沈Q ID N0:3)与BIP(沈Q ID NO:4)和环引物LF(SEQ ID NO:5)与LB(SEQ ID NO:6);; 其中引物的序列分别为：
F3 B3 FIP BIP LF LB 所述的 2X反应缓冲液包括Tris-H化、K化、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和 dNTPs。
[0007] 所述的猪博卡病毒DNA模板，是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒从疑似猪博卡 病毒病变组织、粪便样品或培养物中提取的猪博卡病毒基因组DNA。
[0008] 所述的巧光目视检测试剂采用巧黄绿素巧光试剂，巧光试剂在反应前加入。
[0009] 所述的2X反应缓冲液包括Tris-肥L 35-55mM、K化10-30mM、MgS04l5-28mM、 (NH4)2S04 18-28mM、Tween20 0.5-1.5 %'Betaine 1.3-3.5M 和dNTPs 2.4-4.8mM，其配制 方法在抑为8.6左右条件下，将上述溶剂混合均匀获得。
[0010] -种猪博卡病毒环介导等溫扩增试剂盒的应用，用于检测疑似猪博卡病毒病变组 织、粪便样品或培养物中是否含有猪博卡病毒，具体检测步骤包括： (1) LAMP引物的设计与合成 (2) 猪博卡病毒DNA模板的提取 (3) LAMP反应体系建立 (4) LAMP检测方法。
[001 U 所述的lamp反应体系建立W25化计，
[0012]所述的LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和巧光可视化检测的方法。 [001引所述的lamp检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监控，反应 溫度为63°C、反应在15-20分钟间出现扩增。
[0014]本发明的实质性特点和显著的进步是： 1)特异性强 本发明的LAMP方法特异性检测出猪博卡病毒，所检测的阴性对照病毒和水对照均无阳 性结果出来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。
[0015] 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为9.49 X 1(T8 ng/化，而使用本发明的LAMP检测方法，检测 限约为9.49 X 1 〇-%gAiL，是普通PCR的10倍。
[0016] 3)迅速获得结果 普通的PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的LAMP反应方法在反 应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线显像分析来判读结果，从基因组DNA提取到获取试 验结果，需要4-5小时左右。本发明提供的LAMP检测方法反应在16分钟左右出现扩增，60分 钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比较，通过肉眼可 明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离屯、后，阳性反应管底部有明显的白 色焦憐酸儀沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物;或加入巧光染料，阳性反应管在紫外光下 呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像或者开 盖加入巧光染料进行来判读结果，从基因组DNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。
[0017] 4)不造成污染 目前LAMP方法用于直接观察的巧光染料为反应后加入，而本发明的巧光染料是在反应 前加入的巧黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。此外，本发明的LAMP 检测方法在结果判读上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进行巧光 染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。
[001引 5)可实时定量 本发明利用化bidimeter realtime LA-320浊度仪来实时分析LAMP反应的结果，不 同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求 出各时间的猪博卡病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明LAMP方法特异性检测结果;其中1:猪博卡病毒;2:猪圆环病毒2型;3: 伪狂犬病毒;4:猪攝病毒;5:蓝耳病病毒;6:猪细小病毒;7:传染性胃肠炎病毒;8:流行性腹 泻病毒;9:空白对照(水）。猪博卡病毒反应管出现浊度的上升曲线，为阳性结果，7株对照 病毒反应管和水对照反应管均无扩增，为阴性结果。
[0020] 图2和图3是分别使用本发明LAMP方法和普通PCR方法进行的猪博卡病毒敏感性检 测的结果，其中 1:9.49 X 10 ng/化；2:9.49 ng/化；3:9.49 X lO-Vg/化;4:9.49 X l〇-2ng/y L; 5:9.49 X l〇-3ng/化；6:9.49 X l〇-4ng/化；7:9.49 X l〇-5ng/化；8:9.49 X 1〇-6叫/化；9: 9.49X10-7 ngAiL;10:9.49Xl〇-8 ng/iiL;ll:9.49Xl〇-9 ng/化；12: water。猪博卡病毒原 始DNA的起始浓度为9.49 X 10 ng/化，经10倍倍比连续稀释后，进行LAMP和PCR扩增，结果显 示本发明的LAMP法检测限约为9.49 X l〇-9ngAiL，而普通PCR方法检测限约为9.49 X l〇-8ng/ 化。
[0021] 图4是加入巧光染料后肉眼观察结果:左管为W猪博卡病毒基因组DNA为模板的反 应情况，为阳性结果，右管为阴性对照的反应情况，为阴性结果。
[0022] 图5是本发明猪博卡病毒定量标准曲线；利用不同的标准样品的浓度对应的浊度 值对时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可求出各时间的猪博卡病毒拷贝数。
【具体实施方式】
[0023] 1、材料的准备 猪博卡病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪攝病毒、蓝耳病病毒、猪细小病毒、传染性 胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒；为市售疫苗毒或广西兽医研究所分离鉴定和保存。LAMP DNA扩增试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号LMP204;病毒基因组DNA/RNA提取试 剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，货号CW0552。
[0024] 2、LAMP引物的设计与合成 根据GenBank中的猪博卡病毒NPl基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件 Prime巧xplorer V4软件设计一套LAMP引物，其中F3、B3为外引物，FIP、BIP为内引物，LF 和LB为环引物;其中F3、B3为猪博卡病毒PCR检测引物，其中