一种快速检测桑尼短体线虫的环等温扩增引物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病原物检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测桑尼短体线 虫的环等温扩增引物及其应用。
【背景技术】
[0002] 短体线虫，也称为根腐线虫，是一种重要的迀移性内寄生线虫。这类线虫能在植物 跟内移动、穿刺和取食会，同时会引起根组织形成坏死斑、空腔进而使根组织坏死。由于根 部坏死，所以被根腐线虫危害的植物会表现出缺水和营养不足的症状。短体线虫是造成农 作物损失最多的三种植物线虫之一，其中桑尼短体线虫（Pratylenchusthoreni)是最重要 的短体线虫之一。它们不单分布广泛，而且可以侵染多种重要的农作物。但是，不同种类作 物或不同的品种对桑尼短体线虫的抗病性和耐病性有差异，因此，轮作和种植抗病品种是 防治这种短体线虫的有效方法。如此一来，只有正确的鉴定这种线虫，才能在实际工作中选 择合适的作物或品种种植来防治它们。
[0003] 但是，目前主要还是通过形态学的方法进行鉴定，而形态学鉴定桑尼短体线虫和 桑尼短体线虫是一个复杂和耗费大量时间的工作，而且对于大部分人来说这是一个非常困 难的工作，往往也会造成准确性低的问题。此外，形态学的鉴定方法只能准确的鉴定短体线 虫的成熟雌虫，但是在田间调查的时候，常常会分离到大量不同龄期的幼虫。因此，要通过 形态学方法准确的鉴定桑尼短体线虫幼虫，目前在技术上还是不可能的。
[0004] 目前，国外有报道通过PCR或实时荧光PCR方法检测和定量桑尼短体线虫的方法， 但是，该方法需要使用昂贵的PCR仪，而且，还需要进行电泳检测，对操作人员的技术要求 较高，不利于在基层检测单位中推广和使用。因此，在实际的应用中，使用环等温扩增的方 法检测桑尼短体线虫会大大减轻的基层人员的工作量和检测成本。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有桑尼短体线虫检测技术的不足，为解决快速 检测桑尼短体线虫提供一组引物组和检测方法。
[0006] 本发明的目的是提供一种快速检测桑尼短体线虫的环等温扩增引物。
[0007] 本发明另一目的是提供上述环等温扩增引物的应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：
[0009] 一种快速检测桑尼短体线虫的环等温扩增引物，包括外侧引物ptF31/ptB31和内 侧引物ptFIPl/ptBIPl;引物ptF31的序列（如SEQIDNO. 1所示），引物ptB31的序列（如 SEQIDN0. 2所示），引物ptFIPl的序列如（SEQIDN0. 3)所示，引物ptBIPl的序列（如 SEQIDN0. 4 所示）。
[0010] 上述环等温扩增引物在检测桑尼短体线虫方面的应用或者在制备检测桑尼短体 线虫的试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。
[0011] -种快速检测桑尼短体线虫的环等温扩增方法，该方法是以样品DNA为模板，利 用上述引物对ptF31/ptB31和引物对ptFIPl/ptBIPl进行环介导等温扩增反应。
[0012] 所述环介导等温扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出 现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有桑尼短体线虫DNA，即为桑尼短体线虫阳性；或者 向扩增产物中加入SYBR green I或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定 样品中含有桑尼短体线虫DNA，即为桑尼短体线虫阳性。
[0013] 优选地，所述环等温扩增方法的反应体系为：1μLDNA，引物ptFIPl和ptBIPl各 1. 6μM，引物ptF31 和ptB31 各 0· 2μM，dNTP0· 35μM，2. 5μL10XBST2. 0DNA聚合酶缓冲 液，0· 8Μ甜菜碱，L5μLMgS04 (100mM)，1μLBST2. 0DNA聚合酶，余量ddH20补足，共 25μL。
[0014] 优选地，所述环等温扩增方法的反应条件为：65°C反应60min。
[0015] -种快速检测桑尼短体线虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对ptF31/ptB31 和引物对PtFIPl/ptBIPl。
[0016] 所述试剂盒所使用的检测方法即为上述环等温扩增方法。
[0017] 上述环等温扩增方法或上述试剂盒在检测桑尼短体线虫方面的应用也都在本发 明的保护范围之内。
[0018] 本发明通过大量的研究和探索，最终得到的引物对ptF31/ptB31和引物对 ptFIPl/ptBIPl配合使用，建立的环等温扩增方法，不仅能够非常特异的检测桑尼短体线 虫，而且检测灵敏性达到了单条，甚至是0. 1条的灵敏度，检测效果非常好。而且环等温扩 增方法不需要依赖于任何昂贵的仪器，对实验检测人员的要求也很低，是一种安全、简单、 快速、成本低的检测方法。
[0019] 本发明具有以下有益效果：
[0020] 本发明提供了一组快速检测桑尼短体线虫的环等温扩增引物。所述引物特异性 强、灵敏度好、且具有很好的重复性。本发明利用所述引物进行环介导等温扩增反应检测桑 尼短体线虫，检测灵敏性达到了单条，甚至是0. 1条的灵敏度。
[0021] 本发明仅需使用简单的恒温仪器就能完成全部的检测，不需要依赖于任何昂贵的 仪器，并且检测时间仅为60min，比普通的荧光定量PCR方法节省了 2~3h，简单快速、对环 境要求低、无需大型仪器，非常适合在基层检测单位中使用。
[0022] 另外，本方法检测结果的判定方法多样，可根据实际情况进行选择。本方法还可以 实现扩增反应结果的可视化，准确可靠，无需电泳检测，不使用溴化乙锭，保障了工作人员 的安全，为桑尼短体线虫的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广 应用价值。
【附图说明】
[0023] 图1为不同引物的LAMP电泳图对扩增效率的影响。
[0024] 图2为引物组1的LAMP特异性检测结果。图中3~8为不同种群的桑尼短体线 虫，1，2,9~24为非靶标线虫（具体种类见表1)。
[0025] 图3为引物组2的LAMP特异性检测结果。图中3~8为不同种群的桑尼短体线 虫，1，2,9~24为非靶标线虫（具体种类见表1)。
[0026] 图4为不同浓度的线虫DNA的可视化检测结果，0. 1、1、10和100表示使用的DNA 来自于〇. 1、1、1〇和100条桑尼短体线虫，CK表示使用灭菌水作为模板。
[0027] 实施例1引物设计
[0028] 1、根据NCBI中多种短体线虫的28s核糖体DNA序列（基因登录号为：EU130854、 JX046968、KM200579、JQ303333、JX261951、JX261960、JX261954、EU130875、EU130866、 EU130873、EU130845、JN244270、EU130889、HQ662581、JN091970、AM231916、JX261948、 肝765435、〇0498832、几047005、几003994、《]214114、几144360)，设计引物如下 ：
[0029] (1)引物组 1:
[0030] 外侧引物ptF31 (如SEQIDNO. 1 所示）
[0031] 5' -TGAAACACGGACCAAGGAGT-3'
[0032]外侧引物ptB31 (如SEQIDNO. 2 所示）
[0033] 5, -CACCATCTTTCGGGTCTCAC-3，
[0034] 内侧引物ptFIPl(如SEQIDNO.3 所示）：
[0035] 5' -GCGAGGGATGCCTTCACTTTCAtttaaaTTATCGTGTGCGCAAGTCAT-3'
[0036] 内侧引物ptBIPl(如SEQIDNO. 4 所示）：
[0037] 5, -GGTGTCCGAGTGCAGCATGGttttttGCGTACGCTCTTCCTCCA-3'
[0038] (2)引物组 2
[0039] 外侧引物ptF32 (