与玉米抗粗缩病主效qtl紧密连锁的分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及与玉米抗粗缩病主效QTL 紧密连锁的分子标记。
【背景技术】
[0002] 玉米（ZeamaysL.)是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学工业的原 料。我国是仅次于美国的世界第二大玉米生产国，特别是近30年来，我国玉米生产发展 迅速，种植面积扩大、生产总量增加的速度均超过水稻、小麦等其它作物。玉米生产在我 国农业生产和经济发展中占有日益重要的地位，但其面临多重逆境影响，特别是随着气 候变暖、耕作制度改变和单一品种大面积种植，病虫害发生流行严重影响了玉米的稳产 性（陈建军等，2009 ;陈永坤，2006 ;苗洪芹等，1997)。玉米粗缩病（MaizeRoughDwarf Disease，MRDD)是全球玉米种植区广泛发生的病毒性病害，玉米感病后呈现系统侵染，生长 发育受阻，主要由灰飞虱（LaodelphaxstriatellusFallen)以持久性方式传播的玉米粗缩 病毒或者水稻黑条矮缩病毒引起。20世纪70年代中期，曾导致河北、北京大面积的玉米减 产或绝产。目前，该病害已成为我国黄淮海玉米主产区的主要病害之一。在玉米抗粗缩病 资源鉴定筛选基础上，部分学者对粗缩病的抗性遗传规律进行了研究。多数研究结果表明， 玉米对粗缩病的抗性呈数量性状（王飞，2007;Shietal.，2012;Luanetal.，2012)。大 面积种植感病品种、病毒和寄主之间失去平衡是导致粗缩病发生的主要原因。玉米生产上 采取的农业防治措施存在易造成环境污染且防治效果差等缺点，因此，培育和种植抗病品 种是防控粗缩病的有效途径。
[0003] 分子标记基于DNA水平的差异，常用的分子标记包括简单串联重复标记（simple sequencerepeat，SSR)与单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms,SNPhSSR 序列由于核心序列重复数目不同，形成了丰富的长度多态性，而SSR两侧序列一般是相对 保守的单拷贝序列（任敬雯，2011)。SNP是指同一物种不同个体间在相同染色体座位上存 在变化，SNP变化形式包括单个碱基的转换、颠倒、插入或缺失，发生转换和颠换的频率比发 生插入和缺失的频率高。由于分子标记具有数量庞大，检测不受环境条件、发育时期和表达 等因素影响，共显性分子标记能提供完整丰富的遗传信息等优点，已被广泛应用于种质资 源鉴定、群体遗传多样性分析、转基因阳性植株筛选、QTL定位及基因克隆、分子标记辅助选 择等方面。分子标记辅助选择就是利用分子标记与目标性状基因紧密连锁的特点，通过检 测分子标记，即可检测目的基因，达到选择目标性状的目的，具有快速、准确、不受环境条件 干扰的优点。利用抗病自交系CL1165衍生的近等基因系在Bin8. 03定位到1个主效抗病 QTL，利用与抗病QTL紧密连锁的分子标记，对来源于PB类群的沈137进行分子标记辅助选 择，有效地提高了选择材料的抗病性（张彦军，2012)。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的与玉米抗粗缩病主效QTL紧密连锁的分子标记， 所述玉米抗粗缩病主效QTL是位于玉米第8号染色体Bin8. 03区域内的qMrdd8,与其紧密 连锁的分子标记包括2个InDel标记一IDP25K和IDP27K，以及1个SNP标记；InDel标记 IDP25K和IDP27K的InDel物理位置分别为103537713和103634975,SNP标记的SNP物理 位置为103446448 ;上述物理位置均参考玉米自交系B73AGPv3 ;各分子标记的引物如下：
[0006] IDP25K的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO. 1和2 ;
[0007] IDP27K的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO. 3和4 ;
[0008] SNP标记的正向引物和反向引物序列分别为SEQIDNO. 5和6。
[0009] 其中，利用SEQIDNO. 1和2在玉米抗粗缩病自交系X178中可扩增出大小为 2925bp的含标记IDP25K的特征条带，其中，标记IDP25K的核苷酸序列如SEQIDN0. 29所 示；利用SEQIDNO. 3和4在玉米抗粗缩病自交系X178中可扩增出大小为3048bp的含标 记IDP27K的特征条带，其中，标记IDP27K的核苷酸序列如SEQIDN0. 30所示的特征条带。 在玉米感病自交系B73中无法扩增出上述2925bp、3048bp的特征条带。
[0010] 利用SEQIDN0. 5和6可在玉米中扩增出大小为361bp的条带，且所述SNP标记在 玉米抗粗缩病自交系X178的物理位置为103446448处的碱基为T，在玉米感病自交系B73 的物理位置为103446448处的碱基为C。
[0011] 本发明还提供所述分子标记在鉴定玉米抗粗缩病的主效QTL位点qMrddS中的应 用。
[0012] 本发明还提供所述分子标记在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。所述 应用包括如下步骤：
[0013] 1)提取待测植株的基因组DNA;
[0014] 2)以待测植株的基因组DNA为模板，利用扩增上述分子标记的引物，进行PCR扩增 反应；
[0015] 3)检测PCR扩增产物。
[0016] 优选地，步骤3)中采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测1标记10?251(、10?271(的？〇? 扩增产物，采用DNA测序技术检测SNP标记的PCR扩增产物。
[0017] 本发明还提供所述分子标记在玉米分子标记辅助育种中的应用。
[0018] 本发明还提供根据所述InDel分子标记IDP25K和IDP27K开发的与玉米抗粗缩病 主效QTL紧密连锁的分子标记及其在筛选或鉴定玉米抗粗缩病种质资源中的应用。。
[0019] 本发明进一步提供用于鉴定玉米抗粗缩病种质资源的PCR检测试剂盒，所述试剂 盒包含扩增上述各分子标记（即IDP25K和IDP27K，及SNP标记）的引物。
[0020] 本发明通过精细定位玉米抗粗缩病的主效QTL位点qMrdd8,发现了与玉米抗粗缩 病基因紧密连锁的3个分子标记，包括2个InDel标记一IDP25K和IDP27K，以及1个SNP 标记。所述分子标记的开发为高产玉米分子辅助育种提供了一条可行的途径。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明实施例1中利用F2群体定位主效抗病QTLqMrdd8的遗传图谱。
[0022] 图2为本发明实施例2中2014年主效QTLqMrdd8的精细定位结果。
[0023] 图3为本发明实施例3中InDel25的序列。
[0024] 图4为本发明实施例3中InDel27的序列。
[0025] 图5为本发明实施例3中2015年主效QTLqMrdd8的精细定位结果。
[0026] 图6为本发明实施例4中玉米自交系B73与X178的SNP7基因型。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0028] 实施例1 2012年玉米抗粗缩病主效QTLqMrdd8定位
[0029] 1. 1材料与方法
[0030] 1. 1. 1试验材料
[0031] 前期以X178与B73的重组自交系群体（RIL)在Bin8. 03定位到了一个主效抗病 QTL(Shietal.，2012)。本发明以来源于X178与B73的RIL群体的家系NL203为抗病亲 本，B73为感病亲本，构建了 3个F2群体，分别表示为F2-UF2-2和F2-5,分别包含24U253 和312个单株。
[0032] 1. 1. 2抗病性鉴定
[0033] 3个F2群体采用不同的鉴定方法，其中F2-1和F2-2在江苏南京进行人工接种鉴 定，F2-5在江苏盐城进行自然发病鉴定。在江苏盐城对F2-5群体进行自然发病鉴定时，选 择靠近小麦或水稻的长方形试验地。整个F2-5群体种植成21行，每行15株，行长4米，行 宽0. 6米，设置自交系NL203为抗病对照，B73为感病对照。播种时不使用杀虫剂，苗期进 行正常田间管理，不进行病虫害防治。
[0034] 在江苏南京采用网箱集团接种结合移栽的方法对F2-1和F2-2群体进行人工接 种鉴定。首先将F2-1和F2-2群体的种子播种在发苗盘内（60cmX40cm)，每个发苗盘播种 50粒，包括抗病对照NL203和感病对照B73各10粒。发苗盘放置在无灰飞虱的地方，防止 在玉米苗期灰飞虱意外传毒。当玉米生长至2叶1心时