一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的ssr分子标记方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于果树分子遗传育种技术领域，提供了一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的 SSR分子标记方法，可用于砂梨品种抗黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病育种，以提高砂梨抗 病育种效率，适用于从事梨科研、育种及生产的科研单位和公司。
【背景技术】
[0002] 梨是世界上重要的水果之一，它已经在世界范围内50个国家进行很长时间的商 业化栽培。但梨树病害是制约梨产业发展的一个重要因素。由互隔交链孢菌 引起的梨黑斑病是砂梨重要的病害之一。梨黑斑病主要危害梨树叶片、果实和 新梢。叶部受害，幼叶先发病、褐色或黑褐色圆形斑点，后逐渐扩大，形成近圆形或不规则形 病斑，病叶即焦枯、畸形，引起早期脱落。果实受害，果面出现一个至数个黑色斑点，逐渐扩 大，颜色变浅，形成浅褐至灰褐色圆形病斑，略凹陷。发病后期病果畸形、龟裂，裂缝可深达 果心，果面和裂缝内产生黑霉，并常常引起落果。果实近成熟期染病，前期表现与幼果相似， 但病斑较大，黑褐色，后期果肉软腐而脱落。梨黑斑病的潜伏侵染能够引起梨果在贮藏期的 腐烂，因此在梨的进出口贸易中受到进口国的严密关注。
[0003] 梨黑斑病防治不当造成梨树叶片提前脱落，容易使梨树形成二次花，严重影响次 年梨果产量，给梨农造成严重的经济损失。目前防治梨黑斑病的方法是使用甲基托布津、代 森锰锌和苯醚甲环唑等化学药剂，长期使用这些化学药剂，必然会引起病原菌对化学药剂 产生抗药性、污染环境和对人体健康产生危害等问题。
[0004] 植物抗病育种是一种有效经济的防治病害的手段，由于梨树的童期长，遗传背景 复杂等造成传统的抗病育种效率较低，而采用分子育种则可以避开童期的干扰，向现有栽 培品种引入抗病基因（R-gene)的同时，不会形成基因的大规模重组。抗病基因在分析植物 抗病机理中具有重要作用，一大批的抗病基因在水稻、小麦、大豆、苹果和葡萄等植物中被 分离出来。近年来梨科研工作者已经从梨中分离出梨火疫病、疮痂病等抗病相关的抗病基 因，但目前还没有梨黑斑病相关的抗病基因被分离克隆出来。转录组测序分析能够在基因 表达水平反映植物在生长发育或由外界环境诱导所产生的变化，最新的双末端测序技术能 够提高DNA的测序效率和提高测序片段的长度，提供更好的转录组分析。基因水平的表达、 基因表达的功能注释、新基因的挖掘、SSR筛选和SNP的发现等转录组信息利用生物信息学 手段进行研究，以便更好深入了解生物进程。这些信息有助于预测单个基因的作用，也能阐 述更为复杂的信号途径和揭示潜在的网络关系。
[0005] 多年来，我们一直围绕确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记的分离工作进 行研究，利用转录组测序技术，通过对抗梨黑斑病种质和感梨黑斑病的种质的接种后的差 异表达基因的分析，筛选鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记。本研究为砂梨品种抗 黑斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病分子育种奠定理论基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对梨树的童期长，遗传背景复杂等造成传统的抗病育种效率较 低的问题，提供鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的SSR分子标记分子标记，以提高砂梨品种抗黑 斑病早期鉴定和砂梨抗黑斑病育种的效率。
[0007] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施： 本发明是通过对高抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种"红粉梨"离体叶 片接种病原和无菌水后进行转录组测序分析，获取响应病菌诱导和品种之间的差异表达基 因，再通过差异基因的基因序列，筛选SSR位点，并根据SSR位点序列设计SSR引物，通过对 抗病梨品种"金晶梨"和感病品种"红粉梨"的PCR扩增来确定鉴定砂梨品种抗梨黑斑病的 SSR分子标记。
[0008] 1. -种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，其特征在于，包括如下步骤： A、 梨黑斑病接种 利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种"红粉梨"的叶 片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照；接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行 取样，提取RNA; B、 上机测序RNA样品制备 每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光 光度计进行检测；先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μ1，然后将0天，1天，2 天，3天和4天的RNA分别取40μ1混合成200μ1RNA混合液，得到四个处理的RNA样品； 用带有Oligo的磁珠富集真核生物的mRNA; 加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模版，用random hexamers合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseΗ和DNApolymeraseI合成 第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、3' 加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增， 建好的文库用IlluminaHiSeqTM2000进行测序； C、 测序序列组装及差异表达基因分析 利用已发表梨基因组作为参照基因组，使用快速拼接程序Bowtie对测序片段进行组 装，原始的基因表达数据使用RPKM进行标准化计算； 为了比较处理与对照样品的差异基因，筛选差异显著性P-valUe〈0. 005、错误率FDR彡0. 01且倍数差异在2倍以上的做为差异表达基因（DEGs); D、 抗黑斑病紧密相关基因的筛选 使用EBSeq软件检测4个样品中的差异表达基因（DEGs); "红粉梨"接种菌株与"红粉梨"接种清水样品比较获得差异表达基因，"金晶梨"接种 菌株与"金晶梨"接种清水样品比较获得差异表达基因；比较来自"红粉梨"与来自"金 晶梨"之间的差异表达基因，获得了抗黑斑病紧密相关基因DEGs; E、 抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选 基于上述筛选的抗黑斑病紧密相关基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)软件筛选 出SSR位点； F、 砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选 基于上述SSR位点，利用引物设计软件Primer3进行引物设计，每个SSR位点设计2对 引物；然后利用设计的SSR引物对"红粉梨"和"金晶梨"的DNA进行扩增，筛选出引物能够 区分高抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种"红粉梨"（如表1)。
[0009] 上述的砂梨抗黑斑病的SSR分子标记在梨树育种上的应用。
[0010] 使用上述方法可以确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，以提高砂梨抗黑 斑病育种的效率，为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。
【附图说明】
[0011] 图1 "红粉梨"与"金晶梨"接种梨黑斑病的发病症状； 图2 "红粉梨"与"金晶梨"样品间比较获得差异表达基因分析的韦恩氏图； 图3 "红粉梨"与"金晶梨"基于11对SSR引物扩增的电泳图。
【具体实施方式】
[0012] 一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，是通过下列步骤获得： 1、梨黑斑病接种 利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种"红粉梨"的叶 片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照。接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行取 样，提取RNA。
[0013] 2、上机测序RNA样品制备 每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光 光度计进行检测。先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μ1，然后将0天，1天，2 天，3天和4天的RNA分别取40μ1混合成200μ1RNA混合液，得到四个处理的RNA样品。 用带有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物的mRNA(若为原核生物，则用试剂盒去除rRNA后进 入下一步)。加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模版，用random hexamers(六碱基随机引物）合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseΗ和DNA polymeraseI合成第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之 后做末端修复、3'加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最 后进行PCR扩增，建好的文库用IlluminaHiSeqTM2000进行测序。
[0014] 3、测序序列组装及差异表达基因分析 利用已发表梨基因组作为参照基因组，使用快速拼接程序Bowtie对测序片段进行组 装，原始的基因表达数据使用RPKM进行标准化计算。为了比较处理与对照样品的差异基 因，筛选差异显著性P-value〈0.005、错误率FDR< 0. 01且倍数差异在2倍以上的做为差异 表达基因（DEGs)。
[0015] 4、抗黑斑病紧密相关基因的筛选 使用EBSeq软件（版本1. 1. 3)检测4个样品中的差异表达基因（DEGs)。"红粉梨"接 种菌株与"红粉梨"接种清水样品比较获得909个DEGs，"金晶梨"接种菌株与"金晶梨"接 种清水样品比较获得501个DEGs;比较来自"红粉梨"与来自"金晶梨"之间的差异表达基 因，获得了 152个抗黑斑病紧密相关基因DEGs。
[0016] 5、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选 基于上述筛选的152个抗黑斑病紧密相关基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)软 件筛选出34个SSR位点。
[0017] 6、确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记 基于34个SSR位点，利用引物设计软件Primerf进行引物设计，每个SSR位点设计2 对