引物；然后利用设计的68对SSR引物对"红粉梨"和"金晶梨"的DNA在3%浓度的琼脂 糖胶进行扩增，筛选出5对引物能够区分高抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种 "红粉梨"（见表1 ;图3)。引物3436a在240片段和420片段位置同时出现条带表明被检 测品种为抗黑斑病品种；在240片段位置出现条带但在420位置没有条带表明被检测品种 为感黑斑病品种；引物6484a在280片段和350片段位置同时出现条带表明被检测品种为 抗黑斑病品种；在280片段位置没有出现条带但在350位置有条带表明被检测品种为感黑 斑病品种；引物12717a在300片段位置出现条带但在450位置没有出现条带表明被检测品 种为抗黑斑病品种；在300片段和450片段位置同时出现条带表明被检测品种为感黑斑病 品种；引物15001b在300片段和400片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品 种；在300片段位置出现条带但在400位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种；弓丨 物15305a在320片段没有条带但在380片段位置出现条带，表明被检测品种为抗黑斑病品 种；在320片段位置出现条带但在380位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种。
[0018] 因此鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5个 SSR分子标记中抗黑斑病标记的条带位置，但又不出现感黑斑病条带的位置，即可判断该 品种为抗黑斑病品种；同理鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、1500lb和 15305a等5个SSR分子标记中感黑斑病标记的条带位置，但又不出现抗黑斑病条带的位置， 则判断该品种为感病品种。
[0019] 使用上述方法可以确定鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，以提高砂梨抗黑 斑病育种的效率，为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。
[0020] 实验例证1 :采用本方法筛选5对鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记，5对引 物见表1 : 表1 11对SSR分子标记引物序列
[0021] 3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5对引物在3%浓度的琼脂糖胶上对"红 粉梨"和"金晶梨"的DNA进行扩增，可以扩增出条带，并且通过条带的片段大小，可以将高 抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种"红粉梨"进行区分。表1中" + "表示在对 应扩增出的片段位置有条带，表示在对应扩增出的片段位置无条带，条带有无情况见 图3。
[0022] 引物3436a对"金晶梨"扩增在240片段和420片段位置同时出现条带表明该品 种为抗黑斑病品种；对"红粉梨"扩增在240片段位置出现条带但在420位置没有条带表明 该为感黑斑病品种；引物6484a对"金晶梨"扩增在280片段和350片段位置同时出现条带 表明该品种为抗黑斑病品种；对"红粉梨"扩增在280片段位置没有出现条带但在350位置 有条带表明该品种为感黑斑病品种；引物12717a对"金晶梨"扩增在300片段位置出现条 带但在450位置没有出现条带表明该品种为抗黑斑病品种；对"红粉梨"扩增在300片段和 450片段位置同时出现条带表明该品种为感黑斑病品种；引物15001b"金晶梨"扩增在300 片段和400片段位置同时出现条带表明该品种为抗黑斑病品种；对"红粉梨"扩增在300片 段位置出现条带但在400位置没有条带表明该品种为感黑斑病品种；引物15305a"金晶梨" 扩增在320片段没有条带但在380片段位置出现条带，表明该品种为抗黑斑病品种；对"红 粉梨"扩增在320片段位置出现条带但在380位置没有条带表明该品种为感黑斑病品种。
【主权项】
1. 一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，其特征在于，包括如下步骤： A、 梨黑斑病接种 利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种"红粉梨"的叶 片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照；接种后分别在0天，1天，2天，3天和4天进行 取样，提取RNA; B、上机测序RNA样品制备 每个处理样品的RNA使用TRIzol方法进行提取，RNA的纯度检测使用Nanodrop分光 光度计进行检测；先将每个处理样品的RNA浓度都稀释到750ng/μ1，然后将0天，1天，2 天，3天和4天的RNA分别取40μ1混合成200μ1RNA混合液，得到四个处理的RNA样品； 用带有Oligo的磁珠富集真核生物的mRNA; 加入fragmentationbuffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模版，用random hexamers合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNaseΗ和DNApolymeraseI合成 第二条cDNA链，在经过QiaQuickPCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、3' 加polyA并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增， 建好的文库用IlluminaHiSeqTM2000进行测序； C、 测序序列组装及差异表达基因分析 利用已发表梨基因组作为参照基因组，使用快速拼接程序Bowtie对测序片段进行组 装，原始的基因表达数据使用RPKM进行标准化计算； 为了比较处理与对照样品的差异基因，筛选差异显著性P-valUe〈0. 005、错误率FDR彡0. 01且倍数差异在2倍以上的做为差异表达基因（DEGs); D、 抗黑斑病紧密相关基因的筛选 使用EBSeq软件检测4个样品中的差异表达基因（DEGs); "红粉梨"接种菌株与"红粉梨"接种清水样品比较获得差异表达基因，"金晶梨"接种 菌株与"金晶梨"接种清水样品比较获得差异表达基因；比较来自"红粉梨"与来自"金 晶梨"之间的差异表达基因，获得了抗黑斑病紧密相关基因DEGs; E、 抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选 基于上述筛选的抗黑斑病紧密相关基因DEGs，利用MIcroSAtellite(MISA)软件筛选 出SSR位点； F、 砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选 基于上述SSR位点，利用引物设计软件Primer3进行引物设计，每个SSR位点设计2对 引物；然后利用设计的SSR引物对"红粉梨"和"金晶梨"的DNA进行扩增，筛选出引物能够 区分高抗黑斑病梨品种"金晶梨"和高感黑斑病梨品种"红粉梨"。2. 如权利要求1所述的砂梨抗黑斑病的SSR分子标记方法，其特征在于：步骤F中： 设计引物 3436a，F:GTGGTCTTGAGGGCGTTTA;R:CGTCAGCCGGTGATACTT，在 240 片段和 420 片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在240片段位置出现条带但在 420位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种； 设计引物 6484a，F:ATAAGTTGCGGCACTCTG;R:CGTACCAAAAGCTAAAAT，引物 6484a在 280 片段和350片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在280片段位置没有 出现条带但在350位置有条带表明被检测品种为感黑斑病品种； 设计引物 12717a，F:TTTGTGATGCCTCGATAT;R:ACCGTGATTCAATAGTTC，引物 12717a在 300片段位置出现条带但在450位置没有出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在300 片段和450片段位置同时出现条带表明被检测品种为感黑斑病品种； 设计引物 15001b，F:AGGAGGAATGAGACAATAGA;R:CATCACCGTGTACCACA，引物 15001b在 300片段和400片段位置同时出现条带表明被检测品种为抗黑斑病品种；在300片段位置 出现条带但在400位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种； 设计引物 15305a，F:AGCCCGTTAGAATGAGAT;R:AGCAGTATAGGCAGGGA，在 320 片段没有条 带但在380片段位置出现条带，表明被检测品种为抗黑斑病品种；在320片段位置出现条带 但在380位置没有条带表明被检测品种为感黑斑病品种； 鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等5个SSR分子 标记中抗黑斑病标记的条带位置，但又不出现感黑斑病条带的位置，即可判断该品种为抗 黑斑病品种；同理鉴定砂梨品种同时满足引物3436a、6484a、12717a、15001b和15305a等 5个SSR分子标记中感黑斑病标记的条带位置，但又不出现抗黑斑病条带的位置，则判断该 品种为感病品种。3.如权利要求1或2所述的砂梨抗黑斑病的SSR分子标记方法在梨树育种上的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记方法，其方法步骤为：A、利用梨黑斑病菌株对高抗黑斑病梨品种和高感黑斑病梨品种的叶片进行室内接种，以喷雾无菌水作为对照，提取RNA；B、上机测序混合RNA样品制备；C、测序序列组装及差异表达基因分析；D、抗黑斑病紧密相关基因的筛选；E、抗黑斑病紧密相关SSR位点筛选；F、砂梨抗黑斑病紧密相关的SSR分子标记筛选。使用本方法筛选的鉴定砂梨品种抗黑斑病的SSR分子标记可以为砂梨抗黑斑病分子育种和抗黑斑病机理的研究奠定理论基础。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105349676
【申请号】CN201510878315
【发明人】杨晓平, 胡红菊, 孙中海, 张靖国, 陈启亮, 范净, 田瑞, 何秀娟
【申请人】湖北省农业科学院果树茶叶研究所
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月4日