缺血性脑卒中miRNA标记物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及一种缺血性脑卒中miRNA标记物及其应用。
【背景技术】
[0002] 脑卒中是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞造成血液循环障碍而引起脑组织 损伤的一组疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性脑卒中是指局部脑组织包括 神经细胞、腔质细胞和血管由于血液供应缺乏而发生的坏死。我国每年新发脑卒中病人约 150~200万人，其中缺血性脑卒中占脑卒中病例的60~80%，颈内动脉和椎动脉闭塞和 狭窄可引起缺血性脑卒中，年龄多在40岁以上，且男性较女性多，严重者可引起死亡。
[0003] miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉 默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNA 与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA5' -UTR或者3' -UTR中的互补序列相结 合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
[0004] 检测miRNA的表达水平可以为缺血性脑卒中的临床诊断提供参考。而miRNA的异 常表达直接导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发疾病的发生。虽然已有报道证 明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在缺血性脑卒中中起重要作用，但是其还没有 应用到临床上。目前，尚无快速简便的实验室血液检测方法用于缺血性脑卒中的筛查和早 期检测。
【发明内容】
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊断缺血性脑卒中 的miRNA标记物。相比传统的缺血性脑卒中的诊断方法，使用miRNA标记物来诊断缺血性 脑卒中具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的预 防和治疗措施。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0007] 本发明提供了miRNA-4252在制备诊断缺血性脑卒中的产品中的应用，所述 miRNA-4252 选自以下组中的至少一种：miRNA-4252 初始miRNA、miRNA-4252 前体miRNA、 成熟miRNA-4252 ;所述miRNA-4252初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟 miRNA-4252 ;所述miRNA-4252前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-4252。
[0008] 进一步，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252,核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 进一步，诊断缺血性脑卒中的产品包括芯片或试剂盒；其中，所述芯片包括固相载 体以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于所 述miRNA-4252的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测所述miRNA-4252的表达水平 的试剂。
[0010] 应当知道，本发明的miRNA-4252包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其 显示完整miRNA-4252核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插 入而突变。
[0011] 本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端或者两端增加保 护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术 人员熟知，在不影响miRNA-4252功能的条件下，对miRNA-4252进行碱基修饰或者在两端增 加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0012] 在本发明的一些具体的实施方式中，所述miRNA-4252是成熟miRNA-4252。
[0013] 虽然在某些【具体实施方式】中所使用的是成熟miRNA-4252,但是本领域技术人员可 以预期，初始miRNA(pri-miRNA-4252)、前体miRNA(pre-miRNA-4252)将可以获得与成熟 miRNA-4252同样的技术效果，因为细胞有能力进一步将初始miRNA(pri-miRNA-4252)、前 体miRNA(pre-miRNA-4252)加工为成熟miRNA-4252〇
[0014] 本发明的miRNA-4252核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的 miRNA-4252主要呈单链形式，而miRNA-4252前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发 明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0015] 本发明提供了miRNA-4252在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知 待检测样本中miRNA-4252的表达水平，将待测样本的结果同健康人的样本相比，容易判断 待测样本是否患有缺血性脑卒中以及患缺血性脑卒中的风险。因此，通过高通量测序获得 miRNA-4252表达水平与缺血性脑卒中相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。
[0016] 本发明提供了一种诊断缺血性脑卒中的产品，所述产品能够通过检测miRNA-4252 的表达水平来诊断缺血性脑卒中。
[0017] 进一步，上面所述的产品包括芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及 固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于上面所述 的miRNA-4252的部分或全部序列；所述试剂盒包括用于检测上面所述的miRNA-4252的表 达水平的试剂。
[0018] 进一步，上面所述的寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于诊 断缺血性脑卒中的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通 过检测多种miRNA指标联合诊断缺血性脑卒中的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0019] 进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜，经活性基团（如醛基、氨基等）修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑 料片等。
[0020] 所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如， 如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡 核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序 列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨 基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》； J.L.erisi?V.R.Iyer?P. 0.BROWN.Exploringthemetabolicandgeneticcontrolof geneexpressiononagenomicscale.Science，1997 ;278 :680和马立人，蒋中华主编·生 物芯片.北京：化学工业出版社，2000,1-130。
[0021] 进一步，所述试剂盒包括SYBRGreen聚合酶链式反应体系、用于扩增miRNA-4252 和内参的引物对；所述SYBRGreen聚合酶链式反应体系包含：PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。
[0022] 进一步，所述扩增miRNA-4252的引物对序列如下：正向引物序列为 5' -GGCCACTGAGTCAGCACCA-3'，反向引物序列为 5' -GTGCAGGGTCCGAGGT-3' ；所述内参为U6 snRNA，扩增内参的引物对序列如下：正向引物序列为5' -CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引 物序列为 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
[0023] 进一步，所述试剂盒还包括M-MLV逆转录体系，所述M-MLV逆转录体系包括T重复 寡核苷酸01ig〇-dT、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。
[0024] 进一步，可以将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测 多种miRNA指标联合诊断缺血性脑卒中的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0025] 本发明的miRNA-4252可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达 miRNA-4252的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
[0026] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、疱疹病毒（例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）载体、甲病毒载 体。
[0027] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 pcDNA3. 0表达载体、pcDNA3. 1表达载体、pEGFP表达载体、pEFBos表达载体、pTet表 达载体、PTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、 PCAMBIA1301 等。
[0028] 可以表达miRNA-4252的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中 (http: //microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-4252 在基因组上的位置及 具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-4252初始miRNA的位置，在miRNA-4252初始 miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表 达miRNA-4252 的DNA片段。
[0029] 本发明的优点和有益效果：
[0030] 本发明首次发现了miRNA-4252表达水平与缺血性脑卒中的发生发展相关，通过 检测受试者miRNA-4252的表达水平，可以判断受试者是否患有缺血性脑卒中或者判断受 试者是否存在患有缺血性脑卒中的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治 疗方案。
【附图说明】
[0031] 图1显示利用QPCR检测miRNA-4252在缺血性脑卒中患者血液中的表达情况。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0033] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 实施例1与缺血性脑卒中相关的miRNA的筛选
[0036] 1、样本获取：各收集10例健康人和缺血性脑卒中患者的血液样本。上述所有标本 的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0037] 2、样本总RNA的提取
[0038] 使用U-gene公司的Blood RNA提取试剂盒提取总RNA。具体步骤如下：
[0039] 1)每体积新鲜血液（最大1ml)加入5倍体积的1 XXR-I缓冲液，例如：每1ml血 液中加入5ml的XR-I缓冲液，漩涡振荡混匀；
[0040] 2)冰浴15min，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变清表明红血细胞已裂解。如 果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，延长冰浴时间至20min;
[0041] 3)4°C下450g离心lOmin沉淀白细胞，完全弃去含有裂