一种辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物及其基因芯片和实时荧光定量pcr评 ...的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及医药技术生物标志物领域，具体涉及血浆microRNA -27a_3p作为辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物的医药用途。本发明还涉及血楽microRNA -27a-3p作为辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物的评价方法。
【背景技术】
[0002]急性缺血性脑卒中是指因脑部血液供应障碍，导致局部脑组织缺血缺氧性坏死，而出现相应神经功能缺损的一类临床综合征(Brott T，Bogousslavsky J.Treatment ofacute ischemic stroke.N Engl J Med，2000，(343):710_722)。目前在临床上，缺血性脑卒中超早期的诊断、病情评估主要还是依靠病史及临床表现、头颅电子计算机断层扫描CT或磁共振成像MRI及正电子发射断层扫描PECT等检查(Liebeskind DS，Sanossian N，YongWH?Starkman S，Tsang MP，Moya AL，Zheng DD，Abolian AM，Kim D，Ali LK，Shah SH，Towfighi A，0vbiagele B，Kidwell CS，Tateshima S，Jahan R，Duckwiler GR?Vinuela F，Salamon N，Villablanca JP ?Vinters HV，Marder VJ? Saver JL.CT and MRI earlyvessel signs reflect clot composit1n in acute stroke.Stroke，2011，(42):1237-1243； Hanson SK，Grotta JC，Rhoades H，Tran HD，Lamki LM?Barron BJ，Taylor WJ.Value of single-photon emiss1n-computed tomography in acute stroketherapeutic trials.Stroke，1993，(4): 1322-1329)，但均有其局限性，CT 在其超早期一般不能显示病灶，而MR1、PECT虽可以显示，但设备昂贵不能广泛普及。但是在脑卒中早期，血清生化标志物的变化较早于影像学(CT、MRI)检查，并且检测方法简单易行。因此，血清生化标志物是当前研究缺血性脑卒中诊断及治疗的热点。目前研究发现，一些血清标志物和缺血性脑卒中的发展与病情评估密切相关，比如细胞间黏附分子l(ICAM-l)(Iida Η，Schmeichel AM ，Wang Y ，Schmelzer JD ，Low PA?Orchestrat1n of the inflammatoryresponse in ischemia-reperfus1n injury?J Peripher Nerv Syst，2007，(12):131-138)、超敏C反应蛋白(CRP)(律静，同型半胱氨酸联合超敏C反应蛋白、D-二聚体、颈动脉内膜厚度与脑梗死的关系，陕西医学杂志，2013，(42): 1602-1603)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)(黄招君，李辉华，李名生，神经元特异性烯醇化酶与急性脑梗死的相关性研究，中国医药科学，2013，(3):12-14)、超氧化物酶(S0D )(陆建明，马云宝，高雷华，缺血性脑卒中患者血浆ET-CGRP和血清MDA?S0D的测定及其意义.，标记免疫分析与临床，2005,(12):7-9)等。
[0003]MicroRNAC miRNA)是长度21?25 nt的RNA分子，可以特异性识别靶mRNA并调控编码基因的表达，它们通过促进mRNA降解或抑制基因转录而影响mRNA在转录和转录后水平的表达。miRNA可调节不同的生物学过程，如细胞分化、增殖、代谢、耐药和细胞死亡(Ambros V.MicroRNA pathways in flies and worms:Growth?death?fat?stress?andtiming.Cell，2003，(113):673-676)。现在普遍认为，miRNA异常的表达与急性缺血性脑卒中发生、发展、诊断、治疗及预后关系密切(Rink C，Khanna S.MicroRNA in ischemicstroke et1logy and pathology,Phys1l Genomics，2011，(43): 521-528)，比较急性缺血性脑卒中患者血浆miRNA表达谱的差异，有助于发现脑卒中早期诊断和预测疗效及患者预后新的生物标志物，调节具有生物标志物的miRNA表达可能成为预测和治疗急性缺血性脑卒中的新方法，结合传统影像学诊疗方法与相关血浆生物标记物也为急性缺血性脑卒中的治疗研究提供了新的策略。综上，设计或寻找以健康人与急性缺血性脑卒中患者血浆中差异microRNA对预防和治疗急性缺血性脑卒中具有积极意义。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物。本发明寻找健康人与急性缺血性脑卒中患者血浆中的差异mi croRNA，采用mi croRNA芯片检测血浆miRNA表达水平，实时定量PCR测定miRNA表达水平。在此基础上考察了microRNA _27a_3p对急性缺血性脑卒中的诊断效能。本发明还提供血楽microRNA _27a_3p作为辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物的基因芯片和实时荧光定量PCR评价方法。
[0005 ]本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，
一种辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物，其特征在于，为血浆中的microRNA-27a_3p0
[0006]本发明要解决的另一个技术问题是，提供血浆microRNA -27a_3p作为辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物的基因芯片评价方法，其步骤包括，
(1)抽取受试者清晨空腹外周血3mL于氟化钠/草酸钾管内，并在2 h内，于4 °C，3 000r/min离心10 min，留取上层血楽置于-80 °C冰箱保存备用；
(2)血楽miRNA的提取按照miRcutemiRNA提取分离试剂盒说明书，采用吸附柱法提取血楽miRNA;
(3)采用Affymetrix2.0昂飞芯片检测血楽miRNA表达水平。
[0007]本发明要解决的第三个技术问题为血浆microRNA_27a_3p作为辅助诊断急性缺血性脑卒中的早期生物标志物的实时荧光定量PCR评价方法，其步骤包括，
(1)抽取每例受试者清晨空腹外周血3mL于氟化钠/草酸钾管内，并在2 h内，于4 °C，3000 r/min离心10 min，留取上层血楽置于-80 °(3冰箱保存备用；
(2)按照ReverseTranscript1n System说明书，使用miR-27a_3p引物将miRNA逆转录为cDNA;
(3)按照GoTaqOqPCR Master Mix说明书进行荧光定量PCR，以5 s为内参；
(4)实时定量PCR检测在LightCycler1.5仪器进行，以2—(AAet)表示每个miRNA的相对表达量，每例样本重复检测3次，统计学方法应用SPSS15.0软件，结果采用X 土 s表示。
[0008]作为优化，所述5s、miR-27a-3p引物由上海伯豪生物医药有限公司提供；
作为优化，步骤(4)中，结果正态分布连续变量资料采用t检验，非连续变量资料采用x2检验，以接受者操作特征曲线(R0C)检验诊断效能。
[0009]本发明采用基因芯片结合实时定量PCR技术发现了血楽microRNA-27a_3p的差异性表达。在此基础上考察了microRNA _27a_3p对急性缺血性脑卒中的诊断效能。实验结果表明，血楽microRNA _27a_3p在急性缺血性脑卒中患者血浆中表达水平显著低于健康人水平，并初步确定了通过mi croRNA _27a_3p辅助诊断急性缺血性脑卒中患者的临界值及灵敏度和特异度。
【附图说明】
[0010]图1为本发明实施例1中miR-27a-3p在急性缺血性脑卒中患者和健康者血浆中的相对表达情况；
图2为本发明实施例2中血楽miR-27a-3p浓度的ROC曲线分析。
【具体实施方式】
[0011]下面通过实施例详细说明本发明的内容。本实验得到南昌大学第一附属医院的承认与允许，所有标本的采集均获得入组人员的知情同意。
[0012]对比例1
研究对象选取2014年4月至2015年4月就诊于南昌大学第一附属医院神经内科门诊及病房的急性缺血性脑卒中患者32例和体检中心的健康老年者3