基于fish的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及检测厌氧消化液中微生物种类的分子生物学方法，是一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，即一种检测厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的荧光原位杂交方法。【
背景技术：
】[0002]沼气发酵是一种由多种降解微生物参与的极其复杂的生物化学过程，分为水解，酸化，产甲烷三个阶段。整个发酵过程是一个产甲烷菌与非产甲烷菌相互作用，相互制约的过程。非产甲烷菌为产甲烷菌提供代谢底物，产甲烷菌利用有机酸和H2生成CH4,从而为非产甲烷菌解除反馈抑制从而促进其生长。发酵液中有机酸、氨氮等物质的积累会抑制产甲烷菌的活性，从而打破这种平衡，造成产气失败。同时优势产甲烷菌受环境条件影响，也在不断变化。因此研究消化液中厌氧菌的组成、结构和功能对防止有机酸积累和氨抑制及掌握菌群随底物变化的规律有重要作用。[0003]利用荧光标记的探针在细胞内与特异的互补核酸序列杂交，通过激发杂交探针的荧光来检测信号的FISH技术近几年在水污染控制微生物生态学的研究中得到一定发展。利用FISH技术可掌握微生物在发酵液中的数量、形态和分布，但在应用中还存在诸多问题需要改进，例如杂交过程的各种条件包括杂交和洗脱温度、变性剂浓度、探针浓度都需要优化，这些杂交条件关系着探针与被检测物结合的强度和FISH的检测效果。另外，FISH技术是利用荧光探针按照碱基互补配对原则在菌体内部与同源16SrRNA特异结合，发酵残余物附着在菌体表面及周围，在很大程度上会使荧光探针的穿透率不足，从而导致杂交率低及细胞观察准确率低等问题。【
发明内容】[0004]针对上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，即检测厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的荧光原位杂交技术，首先提出了一种有效分离菌体与发酵残余物的方法，利用分层离心的方法使菌体、发酵残余物按照自身不同密度分散在碘海醇溶液中的不同位置，分离效果明显，从而解决了发酵残余物对杂交效果的影响；另外，本发明系统的优化了针对厌氧消化液中产甲烷菌的荧光原位杂交技术从稀释倍数、变性剂浓度、杂交温度、湿度及时间到杂交液和洗脱液的配制，探针的浓度等的各项条件，使杂交的准确性和灵敏性大大提高，对今后FISH技术在厌氧发酵过程中产甲烷菌的检测具有重要意义。通过上述改进，本发明最终解决了FISH技术检测菌体时常常出现的杂质过多，镜检背景昏暗，计数不准确以及试验条件不明引起的杂交效果不理想等问题。[0005]本发明是通过以下的技术方案实现的：[0006]本发明提供一种基于FISH的厌氧消化发酵液中产甲烷菌群的检测方法，所述检测方法具体为:在分离去除发酵液中发酵残余物获得分离产物后再对分离产物进行荧光原位杂交。[0007]优选地，所述分离具体采用离心的方式；[0008]优选地，所述离心的条件为13000rpm、30min，此步是发酵液中所有物质通过离心在碘海醇溶液中均匀分布的过程，离心时间低于30min则菌体和发酵残余物来不及在碘海醇溶液和水相中充分分布，降低分离效果，离心时间高于30min可导致本应处于碘海醇溶液与水相交界处的菌体因过度沉降而转移到碘海醇溶液层，降低分离效果；[0009]优选地，所述离心是在向所述发酵液中加入碘海醇溶液后进行的；[0010]优选地，所述碘海醇溶液的浓度为〇.6g/lmL;碘海醇溶液浓度过高会引起所分离菌体的失水和收缩，密度过低会降低菌体与杂质的分离效果;所述加入具体指采用针头和注射器向所述发酵液中慢慢加入。[0011]通过上述操作，离心管中的混合液从离心管顶部至底部分为4层:第1层为上清层，第2层为微生物层，第3层为碘海醇溶液层，第4层为发酵残余物层;收集上述第1、2、3层即为分离产物。[0012]优选地，所述分离后需对分离产物进行清洗；[0013]优选地，所述清洗的方式为加入磷酸缓冲液后离心；[0014]优选地，所述离心的条件为13000rpm、4min，此步离心主要起到收集菌体的目的，转速和离心时间的选择主要基于离心效率和效果的考虑;所述清洗的次数为2次。[0015]优选地，所述清洗后还需对分离产物进行固定获得固定试样;所述固定具体为向所述分离产物中加入PBS、多聚甲醛后置于4°C下3-4h;4°C条件下固定的速度适宜，高于4°C则会导致过度固定，使菌体的抗原性逐渐丧失；固定3-4h、4%的多聚甲醛能较好的保持组织及细胞内的RNA，并保持较好的形态，固定时间过度延长可导致细胞内大分子的过度交联，降低探针的穿透力，影响杂交效率，多聚甲醛固定后用PBS清洗，清洗后再加入PBS、冰乙醇，-20°C保存，即得。[0016]优选地，所述杂交前固定试样处理具体指，向所述清洗后的分离产物中加入Na5P3〇io溶液稀释、超声分散，即可;加入Na5P3〇io溶液后分离产物中的Na5P3〇io的最终浓度为400mg/L;所述超声分散的时间为3min。[0017]优选地，所述荧光原位杂交前还需将分离产物脱水固定；[0018]其中，所述脱水固定的具体操作为:将所述分离产物滴至载玻片孔、干燥;然后再向载玻片孔中加入琼脂糖溶液、再干燥;最后将载玻片浸入乙醇中脱水、干燥；[0019]其中，每个载玻片孔中滴加分离产物的量为5-10yL，所述干燥的条件为46°C、15min;每个载玻片孔中加入琼脂糖溶液的量为8yL，少于8yL则琼脂糖溶液不能将孔完全覆盖，多于8yL则导致干燥后覆盖在样品上的琼脂糖层偏厚，不利于探针与被检测物的结合；所述再干燥的条件为46°C、30min;所述脱水具体为将载玻片分别浸入60%、80%、100%乙醇中3min，梯度乙醇脱水时间长短会影响菌体的形态和收缩性，进而影响探针的穿透力和杂交效率，经试验得出乙醇脱水3min为最适的脱水时间条件；所述乙醇为冰乙醇；所述脱水、干燥中干燥的条件为46°C。[0020]优选地，所述荧光原位杂交中采用探针及针对检测微生物为：[0021][0022]优选地，所述荧光原位杂交中采用杂交液的FA浓度为5-50%(v/v);每lmL所述杂交液中还包含180yL5MNaCl溶液、20yL1MTris/HCl、10yL1%SDS，余量为水。FA的浓度根据检测微生物种类不同可进行调整，具体地，检测微生物种类与FA浓度对应如下：细菌，5%;古细菌，35%;八叠球菌，35%;甲烷丝状菌，20%;烷微菌属，20%;甲烷杆菌，22%;甲烷球菌，20%;甲烷球菌，35%。[0023]优选地，所述荧光原位杂交的条件为46°C、2h;杂交时间和杂交温度都会影响探针的特异性，一定范围内提高杂交温度可增加探针的特异性，杂交时间长于2h会增加非特异性着色，杂交时间短于2h会导致探针结合不完全，经试验得出，46°C、2h条件下杂交最充分，信号强度也较亮。[0024]优选地，所述检测方法还包括在所述荧光原位杂交后对载玻片清洗、干燥后镜检的步骤。[0025]优选地，所述荧光原位杂交后清洗载玻片的具体为先用缓冲液清洗，再用超纯水清洗；[0026]其中，所述荧光原位杂交后清洗载玻片所用缓冲液中NaCl的浓度与所述杂交液中FA的浓度保持对应;每50mL所述缓冲液中含有0.28-6.34mL5MNaCl、lmLIMTris/HCl、0.5mL1%SDS，余量为水；[0027]所述清洗的条件为遮光、48°C、20min，该洗脱条件可保证明显的FISH信号，若降低洗脱的严谨性会使结果受到非特异性杂交信号的影响，若洗脱的严谨性过高，可导致杂交信号无法检出。[0028]优选地，所述清洗后还包括对载玻片进行干燥、镜检;所述镜检时需滴抗荧光猝灭封片剂(市售产品即可)至载玻片孔与孔的间隙处;盖上盖玻片后需用指甲油进行固定;如果不能马上镜检，那么可将固定后的载玻片置于4°C保存。[0029]在本发明技术方案的实施过程中，尽管离心去残渣属于生物
技术领域：
常用手段，但是现有发酵液的离心只能起到固液分离的作用，菌体和发酵残余物均受到离心产生的重力场作用，加快沉降，因此不能通过离心将菌体与杂质分离。本申请采用了碘海醇溶液进行隔离分层，碘海醇溶液与菌体密度接近，使菌体在重力场中的沉降效率很低，从而通过密度梯度离心达到高度富集菌体的目的，同时碘海醇无细胞毒性并易溶于缓冲液，可保证发酵液中菌体功能完好无损，且分离后碘海醇易与菌体分开。更为关键的是，通过该操作可以改善传统荧光原位杂交镜检的效果，菌体计数更加准确，荧光显微镜下观察有清晰明亮的图像。[0030]密度梯度离心法分离发酵液中菌体目前很少见于报道，Caracciolo等于2005年报道过碘海醇密度离心法分离土壤和含水的复杂样品中的菌体用于分子检测的方法(BarraCaraccioloA，GrenniP，CupoC，RossettiS.Insituanalysisofnativemicrobialcommunitiesincomplexsampleswithhighparticulateloads.FEMSmicrobiologyletters.2005;253:55-8)，之后Banks等将碘海醇密度离心法应用到甲烷发酵中厌氧菌FISH检测前期样品处理（BanksCJ,ZhangY,JiangY,HeavenS.Traceelementrequirementsforstablefoodwastedigestionatelevatedammoniaconcentrations·Bioresourcetechnology·2012;104:127-35)，但均并未公开具体的样品处理方法，本申请在此前提下，针对性地优化了碘海醇密度离心法分离当前第1页1 2