一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于有机物提取技术领域，涉及一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂超声提取方法。
【背景技术】
[0002]厌氧氨氧化细菌可以将亚硝酸盐和氨氮转化为氮气从而缩短氨氮转化的过程，具有高效低耗的优点，因而基于此类微生物发展的厌氧氨氧化工艺成为当前颇具前景的污水脱氮工艺。为了更好地将厌氧氨氧化工艺应用于规模化生产中，对厌氧氨氧化菌的生物学研究，尤其是基于细胞内化学物质的研究就是非常必要的。
[0003]在研究中，学者们在厌氧氨氧化菌胞内的最大细胞器——厌氧氨氧化体的膜上发现了一类特殊的磷脂结构，其功能在于可以提高质膜的致密性，可保护细胞不受厌氧氨氧化菌代谢过程中产生的有毒中间产物对细胞的毒害，保证代谢的正常进行。这类特殊的磷脂结构上包含有顺式联接的环丁烷，其分子空间结构类似于“楼梯状”，因此，该磷脂被命名为梯烷脂。广义的梯烷脂是指含有“梯烷结构”的磷脂，根据梯烷磷脂是否含有极性头部，可以将梯烷脂分为完整梯烷脂和核心梯烷脂，其中由核心梯烷脂和极性头部组成的被称为完整梯烷脂，而核心梯烷脂是完整梯烷脂头部水解的产物；极性头部可分为磷酸胆碱(PC)、磷酸乙醇胺(PE)、磷酸甘油(PG)，其中以磷酸胆碱作为极性头部的完整梯烷脂比例最高，可用于代表完整梯烷脂。
[0004]已有的研究表明完整梯烷脂仅存在于厌氧氨氧化菌中，因此，对完整梯烷脂进行研究和提取就具有极高的生态和生理学意义。近年来，随着高效液相色谱一电喷雾电离一质谱联用技术的发展，兴起了以微生物细胞膜脂分析的研究，使基于完整梯烷脂分析的研究成为可能并得以发展。与生物学技术相比，该方法具有无需培养、快速和普适性等特点，亦可以提供较详细的有关自厌氧氨氧化菌细胞丰度和代谢过程的信息。
[0005]由于完整梯烷脂是一种特殊的磷脂，目前对该物质的提取多是采用改良的磷脂提取方法，提取方法的基础来源于外国学者Bligh，E.G.和Dyer, ff.J.于1959年报道的文献(A rapid method for total lipid extract1n and purificat1n“一种总脂质快速提取和纯化方法Can.J.B1chem.Phys1l《加拿大生物化学与生理学杂》1959.37:911-917)。而该类方法操作复杂、周期长，提取出的完整梯烷脂纯度较低，这不利于推广和使用。
[0006]目前，将完整梯烷脂视作常规磷脂进行提取，可采用的提取方法主要分为两类，一类是物理萃取法，如利用超临界流体技术等，但此类方法成本过高；另一类是化学萃取法，如有机溶剂萃取、柱层析、酶解等方法，对于不同样品方法不同，提取效率也不同，因此萃取的稳定性不能保证。
[0007]如能研发一种操作便捷、提取物纯度高的方法对于完整梯烷脂和厌氧氨氧化工艺的研究是十分必要的。
【发明内容】
[0008]针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种操作便捷、提取质量尚、成本低廉的厌氧氣氧化菌中完整梯烧脂超声提取方法。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法，包括以下步骤:
1)取样:取5-10g污泥作为样品，所述污泥为含有厌氧氨氧化细菌的含水污泥；
2)冷冻干燥:采用真空冷冻干燥技术去除步骤I)的样品中所含游离水分，即将样品置于真空度0.08?0.09Mpa、温度为-40°C的环境下16_24h ;将冷冻干燥后的样品置于_20°C下备用；
为保证样品一致性和后续提取过程中的提取液中各组分的体积比不受影响，污泥样品必须经过冷冻干燥处理，以充分去除污泥样品中的水分。
[0010]3)加入提取液:将步骤2)制备的样品置于50ml玻璃离心管中，并加入15_20ml提取液，所述的提取液是体积比为2:1:0.8的甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的混合溶液；
4)超声提取:在步骤3)中的玻璃离心管外设置冰浴，运用超声波破碎仪进行超声破碎处理；所述的超声破碎处理采用间歇运行模式，即超声开启3-6s，关闭4-6s，其中，超声总时间为15-20min ；
5)调整提取液组分比例:向步骤4)的玻璃离心管中补充二氯甲烷和磷酸盐缓冲液，使提取液中甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为1:1:0.9 ;
6)离心分液:将步骤5)的玻璃离心管在5000rpm下离心1min;将离心后的上清液转移至分液漏斗中静置分液，收集下层的有机相液体；
7)氮吹浓缩:将步骤6)收集的下层的有机相液体置于氮吹仪中，在35°C下进行浓缩，浓缩至完全干燥成固相，形成底层沉淀；将底层沉淀溶解在ImL的有机溶剂中，该有机溶剂是体积比4:1的正己烷和异丙醇；再用孔径为0.45 μm的有机滤膜过滤得到完整梯烷脂母液，置于-80°C存放。
[0011]其中，步骤4)中的超声波破碎仪的运行参数设置为:超声波频率20KHz，超声能量400-450W，变幅杆直径选配5-8mm，功率密度1200-2000W/cm2;为充分利用样品，可将玻璃离心管中的下层污泥样品按步骤3) -6)重复操作4-5次。
[0012]与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果:
1、由完整梯烷脂所组成的厌氧氨氧化体膜具有较高的密度即致密性，且自然界中含有厌氧氨氧化菌的样品又具有较大的异质性，这极大地影响了提取梯烷脂的提取效率。只有充分地分散样品，才有利于有机溶液的萃取。超声波辅助提取是一个较好的选择，超声波的空化效应和高频振荡产生的瞬间高压分散样品和破碎细胞壁，利于细胞内容物的释放且在破碎过程中无化学反应发生，因此本方法所提取的物质生物活性相对稳定，实现了对完整梯烧脂的尚质量提取。
[0013]超声波辅助提取方法与超临界流体技术和单一的有机溶剂萃取方法相比，具有低成本，提取效率尚的有点。
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例的母离子扫描液相色谱图(基于母离子m/zl84)；
图2为本发明实施例峰A的相对丰度质谱分析图； 图3为本发明实施例峰B的相对丰度质谱分析图；
图4为本发明实施例峰C的相对丰度质谱分析图；
图5为本发明实施例峰D的相对丰度质谱分析图。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0016]—种厌氧氨氧化菌中完整梯烷脂的超声提取方法，包括以下步骤:
1)取样:取5-10g污泥作为样品，所述污泥为含有厌氧氨氧化细菌的含水污泥；
2)冷冻干燥:采用真空冷冻干燥技术去除步骤I)的样品中所含游离水分，即将样品置于真空度0.08?0.09Mpa、温度为-40°C的环境下16_24h ;将冷冻干燥后的样品置于_20°C下备用；
为保证样品一致性和后续提取过程中的提取液中各组分的体积比不受影响，污泥样品必须经过冷冻干燥处理，以充分去除污泥样品中的水分。
[0017]3)加入提取液:将步骤2)制备的样品置于50ml玻璃离心管中，并加入15_20ml提取液，所述的提取液是体积比为2:1:0.8的甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的混合溶液；
4)超声提取:在步骤3)中的玻璃离心管外设置冰浴，运用超声波破碎仪进行超声破碎处理；所述的超声破碎处理采用间歇运行模式，即超声开启3-6s，关闭4-6s，其中，超声总时间为15-20min ；
5)调整提取液组分比例:向步骤4)的玻璃离心管中补充二氯甲烷和磷酸盐缓冲液，使提取液中甲醇、二氯甲烷和磷酸盐缓冲液的体积比为1:1:0.9 ;
6)离心分液:将步骤5)的玻璃离心管在5000rpm下离心1min;将离心后的上清液转移至分液漏斗中静置分液，收集下层的有机相液体；
7)氮吹浓缩:将步骤6)收集的下层的有机相液体置于氮吹仪中，在35°C下进行浓缩，浓缩至完全干燥成固相，形成底层沉淀；将底层沉淀溶解在ImL的有机溶剂中，该有机溶剂是体积比4:1的正己烷和异丙醇；再用孔径为0.45 μm的有机滤膜过滤得到完整梯烷脂母液，置于-80°C存放。
[0018]在利用氮吹仪进行浓缩时，氮气流量可以依据实际情况调整，流量大则干燥快，流量小则干燥慢，不会对干燥后的底层沉淀成分造成影响。
[0019]其中，步骤4)中的超声波破碎仪的运行参数设置为:超声波频率20KHz，超声能量400-450W，变幅杆直径选配5-8mm，功率密度1200-200