一种厌氧氨氧化菌干粉菌剂制备与保藏的方法与流程

本发明公开了一种厌氧氨氧化菌干粉菌剂制备与保藏的方法，属于含氮废水生物处理技术领域，特别涉及到一种在高温烘干环境下为菌种提供保护机制的保护剂。

背景技术：

厌氧氨氧化是以NH₄⁺-N为电子供体、NO₂^--N为电子受体生成N₂的微生物反应。该技术与传统的硝化反硝化脱氮技术相比，不需有机碳源，节省碳源100％、节省63％曝气量、剩余污泥产量减少80％，不需额外投加碱度，，被国内外公认为是一种可持续的污水生物脱氮技术。但因其倍增时间长(约10.5天)，增长缓慢，纯种培养难以进行，导致应用于实际废水处理启动周期过长，世界第一个工业化厌氧氨氧化工艺处理氨氮废水装置用时3.5年之久，因此培养保藏厌氧氨氧化菌，建立菌种储库，为污水处理应用提供足够量的菌种成为工业化规模应用的关键^[1]。[1]褚美红，姬玉欣，叶小青等.厌氧氨氧化菌种的低温保藏条件.杭州师范大学学报(自然科学版).2014(02):164-167.

菌种保藏的方法很多，常见的有液体石蜡法、沙土保藏法、液氮法、冷藏法、冷冻法、冻干法及凝胶包埋法等。其原理主要是根据微生物的生理生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降至最低程度或处于休眠状态，使菌株很少发生突变，以达到保持纯种的目的^[2]。[2]付美红，王耀耀，朱妍妍等.微生物菌种的保藏方法.河北化工.2010(4)：33-34.

当前，厌氧氨氧化菌种保藏的方法集中于冷藏法、冷冻法及冻干法，同时添加低温保护剂(如二甲亚砜、海藻糖、甘油、葡萄糖、聚乙烯醇、海藻酸钠等)、保藏基质(NH₄⁺-N、NO₂^--N等)或缓冲液(钼酸盐、NO₃^--N等)，实验证明对厌氧氨氧化菌种保藏起到一定的积极作用。但冷藏法保藏效果较差，菌体死亡率较高；冷冻法、冻干法设备成本高且操作繁琐，同时不利于大规模的工业化应用。而高温烘干法可节约设备及时间成本，与此同时方便菌种的运输，但目前尚无相关文献报道。

厌氧氨氧化菌对环境条件苛刻的本性决定了需要寻求一种长远高效的保藏方法。在进行干法保藏时，需考虑干燥温度、干燥时间、保护剂、保藏温度及活性恢复措施对厌氧氨氧化菌保藏效果的影响。

技术实现要素：

本发明针对目前厌氧氨氧化保藏技术的不足，提出了一种真空烘干法进行厌氧氨氧化菌干法保藏的优化方法。该方法操作简便，耗时短，能够实现厌氧氨氧化菌短期保藏及工业化应用的目标。

本发明的技术方案：

一种厌氧氨氧化菌干粉菌剂制备与保藏的方法，步骤如下：

(1)将待保藏的厌氧氨氧化菌混培物取出，离心，弃去上清液；再加入0.01M磷酸盐缓冲溶液、涡旋器涡旋混匀，离心去除上清液，重复三次，得到厌氧氨氧化菌沉淀物；

(2)将步骤(1)得到的厌氧氨氧化菌沉淀物与质量分数为1～3％的海藻酸钠溶液按照质量体积比5:8混合，混合过程进行氮气吹扫；

(3)将步骤(2)得到的混合物置于真空干燥箱中，抽真空至压力至25KPa以下，温度为50～70℃，烘干，得到含水率为15～30％的厌氧氨氧化菌干粉菌剂；

(4)干燥结束后，将厌氧氨氧化菌干粉菌剂进行真空封口，置于4℃环境下避光保存备用。

步骤(2)的混合过程避光处理。

本发明的有益效果：

1.海藻酸钠作为烘干保护剂减少了厌氧氨氧化菌在50～70℃环境下的细胞损坏，有效降低了其死亡率，流式细胞仪测试结果显示其存活率在保存初期(10～15天)在95％以上；

2.利用冻干法进行干粉制备时干燥时间较长，一般为24～48h，而此方法在最优温度下干燥时间仅仅为5～7h。

3.在将保存一个月后的干粉投入反应器中进行实验时，在为期30天的连续实验结束时，厌氧氨氧化反应器的比厌氧氨氧化活性(SAA)可从启动时的0％提高到40％，相较于新鲜的菌液而言。这对于30天的启动时间而言，活性恢复效果达到了较好的效果。

附图说明

图1为不同烘干温度下下菌种的烘干时间及存活率，其中海藻酸钠浓度为2％(质量分数)，使用仪器为流式细胞仪。

图2为2％海藻酸钠作为保护剂的连续实验三氮浓度变化图，其中烘干温度为60℃。

图3为2％海藻酸钠作为保护剂的连续实验NO₂^--N_r/NH₄⁺-N_r化学计量比变化图，其中烘干温度为60℃。

图4为2％海藻酸钠作为保护剂的连续实验NO₃^--N_p/NH₄⁺-N_r化学计量比变化图，其中烘干温度为60℃。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的突出特点和显著进步作进一步阐明，仅在于说明本发明而决不局限于以下实例。采用本发明制备厌氧氨氧化菌干粉菌剂并对其保藏效果进行测试。

实施例1：不同烘干温度下菌种的烘干时间及存活率

反应条件：在不同温度下(40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃)制得厌氧氨氧化菌并记录烘干时间，在4℃避光保藏10天后上流式细胞仪检测存活率。

结果如图1所示，随着干燥温度的升高，烘干时间从20h降低到4h；与此同时存活率也呈下降趋势，从99.8％下降到95.5％，但是在60℃时出现极值点。

整体来看，海藻酸钠作为保护剂对于厌氧氨氧化菌在高温环境下烘干起到很好的保护作用。在40℃下烘干存活率最高，但是烘干时间过长。考虑到改变温度对菌种存活率影响不大，为其工业化应用应尽可能缩短烘干时间，故选取60℃作为温度优化条件。

实施例2：干粉复壮活性测试

反应条件：将在60℃条件下制得的干粉真空密封避光保藏一个月后取出，用磷酸盐缓冲溶液洗净海藻酸钠残留后投入到250ml模拟反应器中。反应器采用磁力搅拌器进行搅拌，每天充氮气以除去反应器内进入的氧气以保证厌氧环境，外部用遮光布避光。

进出水三氮浓度变化如图2所示，在反应前3天为菌体水解期，主要特征为部分菌体自溶，导致出水氨氮浓度高于进水氨氮浓度。这是由于在保藏期间有部分菌体死亡，投入水中后释放出部分氨氮。而此时出水亚硝氮和硝氮浓度却接近于0，因此，该阶段的厌氧氨氧化作用十分微弱，而利用亚硝酸和硝酸作为电子受体的反硝化反应将二者消耗殆尽，占主导地位。

在反应的第4-15天为活性迟滞期，主要特征为菌体逐渐停止自溶，氨氮与亚硝氮开始同时消失，厌氧氨氧化反应初显。在该阶段，氨氮去除率从10％上升到45％，亚硝氮去除率呈现出先下降后上升的趋势，而硝氮有所生成。由图3和图4可得，在此阶段NO₂^--N_r/NH₄⁺-N_r和NO₃^--N_p/NH₄⁺-N_r仍偏离理论值1.32 和0.26。在活性迟滞阶段，不适合无机环境的菌体随出水洗出反应器，由菌体自溶增加的氨氮和有机物含量逐步减少，使得反硝化作用减弱。

在启动后期，氨氮去除率和亚硝氮去除率逐步提高，最终二者的去除率接近90％。而由图3和图4可见N_r/NH₄⁺-N_r和NO₃^--N_p/NH₄⁺-N_r分别为(0.96±0.02)和(0.24±0.01)。后者已接近理论值，而前者与理论值1.32仍有一定差距，说明反硝化作用仍然存在，但厌氧氨氧化作用的比例在逐渐增大，占据了主导地位，这也预示着成功对保藏菌种进行了复壮。

另外，本发明对反应器启动前及启动结束时厌氧氨氧化菌干粉的比厌氧氨氧化活性SAA进行了测定。结果显示，在反应器运行一个月后，厌氧氨氧化菌的SAA由0kgN·kgVS^-1·d^-1升至(0.27±0.04)kgN·kgVS^-1·d^-1，而新鲜菌液所测得的SAA为0.68±0.03)kgN·kgVS^-1·d^-1，在启动30天后活性已恢复到原来的40％，说明将海藻酸钠作为保护剂并进行真空烘干4℃恒温保藏是厌氧氨氧化菌干法保藏的一种创新又有效的方法。