一种基于高分子载体的尿激酶制剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种基于高分子载体的尿激酶制剂及其制备方法，属于生物医药领域。

背景技术：

随着我国人口老龄化趋势的加快，脑血管病的防治形势将更加严峻。基于缺血半暗带的理论，缺血性脑卒中急性期最有效的治疗方式依然是溶栓治疗和血管内治疗，其中静脉溶栓仍然是最便捷、可行性最强也是循证医学证据最多的溶栓方式。尿激酶是一种在中国广泛使用的溶栓药物，由于其价格便宜，疗效明确，目前在我国脑梗死溶栓中占有较为广泛的市场。然而，尿激酶静脉溶栓存在血管再通率低和出血并发症高两方面主要问题，一方面由于半衰期仅有10～15分钟，所以在可控剂量内针对近端大血管阻塞后的再通率仅为10～20％；另一方面尿激酶激活血栓局部纤溶酶原的同时，常常作用于机体其他部位的血栓和缺陷血管，造成出血的并发症，一旦出血，死亡率高达70％以上。

目前对尿激酶的制剂化改性主要以提高其溶栓的效应性和靶向性为目的，以体外超声场介导为主，以求在达到相同溶栓效率的情况下，可以通过减少溶栓药物的使用剂量，降低溶栓后出血并发症的风险。最近，Cui等人的研究表明(Cui W,Liu R,Jin H,Lv P,Sun Y,Men X,Yang S,Qu X,Yang Z,Huang Y.pH gradient difference around ischemic brain tissue can serve as a trigger for delivering polyethylene glycol-conjugated urokinase nanogels.J Control Release.2016,225,53-63)，大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)闭塞1h会后相应供血区域的脑组织平均pH值下降至6.73，此时外周静脉血的平均pH值仍为7.27。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于高分子载体的尿激酶制剂及其制备方法，本发明将血栓发生后缺血组织的pH值作为生物靶点，从而提升大血管闭塞后下游小血管形成微循环血栓的溶栓效果。

本发明提供的高分子载体即能在外场超声环境下又能在局部组织内源性pH值改变环境下(中性降至弱酸性)加速释放尿激酶，进而逐次提升对大血管和微血管血栓的溶栓效果，提高了尿激酶制剂溶栓的效应性和安全性。

本发明所提供的基于高分子载体的尿激酶制剂，其包括载体和封装于所述载体内的装载物；

所述载体为聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物中空凝胶颗粒；

所述装载物为聚乙二醇交联尿激酶纳米凝胶。

所述的尿激酶制剂中，所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物可为聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物、聚乙二醇-聚乙丙交酯嵌段共聚物和聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物中至少一种。

所述的尿激酶制剂中，所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物可为两嵌段共聚物或三嵌段共聚物；

所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的分子量为3000～10000，具体可为3000～7000,、3000或7000。

本发明进一步提供了所述基于高分子载体的尿激酶制剂的制备方法，包括步骤如下：

(1)配制尿激酶纳米凝胶的水分散液；

(2)将所述尿激酶纳米凝胶的水分散液加入至所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的溶液中形成乳液Ⅰ；

所述溶液的溶剂为有机溶剂；

所述乳液Ⅰ的连续相为所述有机溶剂；

(3)将所述乳液Ⅰ加入至所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的水溶液中，通过膜乳化得到乳液Ⅱ；

所述乳液Ⅱ的连续相为所述水溶液；

(4)去除所述乳液Ⅱ中的所述有机溶剂即得所述尿激酶制剂。

上述的制备方法中，步骤(1)中，所述尿激酶纳米凝胶可按照现有的方法制备，如根据文献(Tan H.,Jin H,Mei H,Zhu L,Wei W,Wang Q,Liang F,Zhang C,Li J,Qu X,Shangguan D,HuangY,YangZ.PEG-urokinase nanogels with enhanced stability and controllable bioactivity.Soft Matter.2012,8,2644-2650.)报道的方法进行制备。

步骤(1)中，所述尿激酶纳米凝胶的水分散液的溶剂可为缓冲液，如磷酸缓冲液；

所述缓冲液的pH值可为6.5～8.5，具体可为7.0～7.5。

上述的制备方法中，步骤(1)中，所述尿激酶纳米凝胶的水分散液中，所述尿激酶纳米凝胶的质量浓度可为1～100mg/mL，具体可为10mg/mL。

上述的制备方法中，步骤(2)中，在高速搅拌所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的溶液的条件下加入所述所述尿激酶纳米凝胶的水分散液；

上述的制备方法中，步骤(2)中，所述有机溶剂可为二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚、脂肪酸甘油酯和食用油中至少一种，优选二氯甲烷；

所述溶液中所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的质量百分含量可为0.1～10％，具体可可为10％；

所述尿激酶纳米凝胶的水分散液与所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的溶液的体积比可为1：0.5～10，具体可为1：0.5或1：10。

上述的制备方法中，步骤(3)中，将所述乳液Ⅰ倾倒入所述所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的水溶液中即可；

步骤(3)中，所述水溶液中所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的质量百分含量可为0.5～5％；

在膜乳化器中进行膜乳化，如在SPG多孔玻璃膜的FMEM-500M膜乳化器(工作压力可为500～1000kPa)中进行；

所述乳液Ⅰ与所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物的水溶液的体积比为1：0.2～10，具体可为1：0.2或1：10。

上述的制备方法中，步骤(4)中，可在25～40℃的条件下通过蒸发的方式去除所述有机溶剂，所述蒸发具体可为常压蒸发或减压蒸发。

本发明制备方法通过高分子空心微凝胶(聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物中空凝胶)装载pH值响应高分子复合尿激酶水凝胶，使该尿激酶制剂能够在外场超声作用下加速对负载高分子复合尿激酶水凝胶的释放，以提高大血管闭塞的再通率，继而利用梗死组织或者微循环局部形成的弱酸性环境，进一步促进尿激酶作用，以提高微循环血栓的再通率，减少“无复流”现象，缩小梗死体积。

所述高分子空心微凝胶指的是以所述聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物物理凝胶形成的中空颗粒，即本发明以聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物中空凝胶为载体。

本发明提供的基于高分子载体的尿激酶制剂，以聚乙二醇交联尿激酶纳米凝胶为输送对象，通过将聚乙二醇交联尿激酶纳米凝胶封装于聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物中空凝胶制成。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明将超声诱导释放与环境pH响应诱导释放相结合，对应于供血动脉发生堵塞产生的循环障碍和其引起的远端组织能量供应不足和大血管血栓溶解后产生的二次小栓塞导致的微循环障碍，以外场作用的主动介导和内源环境的被动靶向实现对尿激酶局部和层次地促进释放，可在提高提高尿激酶作用精度的同时增强治疗效用，为缺血性脑卒中急性期治疗提供更加安全和高效的方法。

附图说明

图1为实施例1制备的尿激酶制剂的透射电镜图。

图2为实施例3中使用的超声诱导释放实验装置图。

图3为实施例3测定的尿激酶制剂的体外释放动力学曲线。

图4为实施例4测定的尿激酶制剂的体外溶栓动力学曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中采用的尿激酶纳米凝胶通过文献(Tan H.,Jin H,Mei H,Zhu L,Wei W,Wang Q,Liang F,Zhang C,Li J,Qu X,Shangguan D,HuangY,YangZ.PEG-urokinase nanogels with enhanced stability and controllable bioactivity.Soft Matter.2012,8,2644-2650.)报道的方法制备。

实施例1、

(1)尿激酶纳米凝胶水分散液的配制

将冻干后的尿激酶纳米凝胶分散于10mM磷酸缓冲液(pH值为7.0～7.5)，质量体积浓度为10mg/mL，用水浴超声在25℃下分散30min得到尿激酶纳米凝胶水分散液。

(2)聚乙二醇-聚乙丙交酯溶液的配制

按文献方法合成聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物(Lee D.S.,Shim M.S.,Kim S.W.,Lee H.,Park I.,Chang T.Novel thermoreversible gelation of biodegradable PLGA-block-PEO-block-PLGA triblock copolymers in aqueous solution.Macromol.Rapid Commun.2001,22,587-592)，平均分子量7000Da，聚酯与聚乙二醇的摩尔比为2.9。40℃下以10wt％浓度溶解二氯甲烷中，得到聚乙二醇-聚乙丙交酯溶液。

(3)聚乙二醇-聚乙丙交酯水分散液的配制

不高于20℃下，将上述聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物溶解于水中，质量浓度为5％。

(4)尿激酶纳米凝胶乳液的配制

4℃冰-水浴中，将步骤(1)得到的尿激酶纳米凝胶水分散液缓慢加入高速搅拌中的步骤(2)得到的聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物的二氯甲烷溶液(其中，尿激酶纳米凝胶水分散液与聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物的二氯甲烷溶液的体积比为1：10)，细胞粉碎机分散得到尿激酶纳米凝胶乳液(二氯甲烷为连续相)。将上述尿激酶纳米凝胶乳液倾倒入4℃冰-水浴中步骤(3)得到的聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物的水溶液中(其中，尿激酶纳米凝胶乳液与聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物的水溶液的体积比为1：10)，用高剪切机高速分散5min，得到尿激酶纳米凝胶水基乳液。

(5)尿激酶制剂的制备

将步骤(4)得到的尿激酶纳米凝胶水基乳液通过装有1微米孔径的SPG多孔玻璃膜的FMEM-500M膜乳化设备(工作压力为1000kPa)，预设收集装置温度为40℃，所得到样品旋蒸除去有机溶剂，获得粒度约为800nm的尿激酶制剂，其透射电镜图如图1所示，由该图可以看出，(所获尿激酶制剂微球粒径相对较为均一，较大者1um左右，多数分布于800nm，分散性良好)。

实施例2、

(1)聚乙二醇-聚己内酯溶液的配制

按文献方法合成聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇三嵌段共聚物(Gong C.,Shi S.,Dong P.,Kan B.,Gou M.,Wang X.,Li X.,Luo F.,Zhao X.,Wei Y.,Qian Z.Synthesis and characterization of PEG-PCL-PEG thermosensitive hydrogel.Int.J.Pharm.2009,365,89-99)，平均分子量3000Da，聚酯与聚乙二醇比例为2.0。室温下以10wt％浓度溶解二氯甲烷中，得到聚乙二醇-聚己内酯溶液。

(2)聚乙二醇-聚己内酯水分散液的配制

按文献方法(Yang S.,Zhu F.,Wang Q.,Liang F.,Qu X.,Gan Z.,YangZ.Combinatorial targeting polymeric micelles for anti-tumor drug delivery.J.Mater.Chem.B,2015,3,4043-4051)合成聚乙二醇-聚己内酯两嵌段共聚物，平均分子量10000Da，聚酯与聚乙二醇的摩尔比为1.0。室温下，将上述聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物溶解于水中，质量浓度为0.5％。

(3)尿激酶纳米凝胶乳液的配制

按照实施例1中步骤(1)配制尿激酶纳米凝胶分散液，然后缓慢加入高速搅拌中的步骤(1)得到的聚乙二醇-聚己内酯-聚乙二醇三嵌段共聚物的二氯甲烷溶液中(其中，尿激酶纳米凝胶水分散液与聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物的二氯甲烷溶液的体积比为1：0.5)，冰水冷却下用细胞粉碎机分散得到尿激酶纳米凝胶乳液(连续相为二氯甲烷)。将上述尿激酶纳米凝胶乳液倾倒入步骤(2)得到的聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物的水分散液(其中，尿激酶纳米凝胶乳液与聚乙丙交酯-聚乙二醇-聚乙丙交酯三嵌段共聚物的水溶液的体积比为1：0.2)，用高剪切机高速分散5min，得到尿激酶纳米凝胶水基乳液。

(4)尿激酶制剂的制备

将步骤(3)得到的尿激酶纳米凝胶水基乳液通过装有3微米孔径的SPG多孔玻璃膜的FMEM-500M膜乳化设备(工作压力为500kPa)，收集装置预设温度35℃，所得到样品旋蒸除去有机溶剂，冷冻干燥后获得粉末状尿激酶制剂，30℃下在0.05M三羟甲基氨基甲烷缓冲液中分散后，测得粒度为1.2微米。

利用ELISA法测定本实施例制备的尿激酶制剂的生物活性：

加入稀释好后的uPA标准品和上述尿激酶制剂50uL于96孔板中，与50uL的生物素标记的抗体反应，37℃温育1小时，洗板后每孔加入80uL的亲和链酶素-HRP，37℃温育30分钟，洗板后每孔加入底物和终止液各50uL，450nm波长处测定各孔的OD值，由标准品活性计算冻干后尿激酶样品的活性为5万IU/g。

实施例3、尿激酶制剂的体外释放实验

(1)尿激酶制剂释放的超声响应性

37℃下将实施例1制备的尿激酶制剂用10nMPBS缓冲液定容至5mg/mL。上述分散液分别置于6个5mL离心管中并在37℃水浴中恒温孵育。一组三个离心管用经颅多普勒超声仪对其连续超声，超声频率和功率分别为2MHz和530mW/cm²(实验装置如图2所示)。另一组三个离心管不用超声干预。每隔一定时间从溶有载药纳米凝胶的PBS溶液中用1mL的注射器吸取少量样品，用孔径为200nm的针头式过滤器进行过滤，用BCA蛋白试剂盒测定滤液中的尿激酶含量。以上实验结果均重复三次取其平均值，并绘制释放动力学曲线如图3所示，由该图可以看出，在缺乏超声干预下，尿激酶制剂中尿激酶释放较为缓慢，在超声促进下释放速率明显增快，在2小时，前者仅有50％释放，后者则可达到80％以上释放。

(2)尿激酶制剂释放的pH值响应性

以显色底物(pyroGLU-GLY-ARG-pNA.HCl)试剂盒定量测试释放尿激酶浓度。将步骤(1)产生的部分滤液冻干后再定量分散于pH＝7.2的磷酸缓冲液中，BCA法确定其中蛋白浓度。取部分分散液，调节pH值至5，处理4小时。以新配裸尿激酶溶液为参比，分别测试pH＝7和pH＝5的样品生物活性，得到结果为：pH＝7的样品为相同当量裸尿激酶活性的30％，pH＝5的样品为相同当量裸尿激酶活性的80％。

实施例4、尿激酶制剂体外溶栓效果

(1)采用健康志愿者全血制备离体血栓，具体步骤参考文献(金海强，载尿激酶纳米体系联合超声溶栓的体外研究，博士研究生学位论文，北京大学第一医院，2013年5月)。溶栓试验从血液离体到形成血栓后5小时左右开始，将标本平分成3块血栓，称重后(M1)分别放入3支下端封口的医用5mL注射器中，分别加入以下制剂：第一管：实施例2制备的尿激酶制剂(生理盐水，pH＝7.4)；第二管：，实施例2制备的尿激酶制剂(生理盐水，pH＝7.4)；第三管：用1M盐酸将pH调制6的实施例2制备的尿激酶制剂。将三支注射器同时放入37℃水浴缸中孵育，期间对第二、三管以实施例3中步骤(1)中所述超声干预条件进行干预。干预一定时间后取出血栓，再次用滤纸吸干表面的水分，用分析天平再次称重，标记为M2。干预后的失重标记为M3(M3＝M1-M2)，溶栓率＝M3/M1×100％。经3次重复实验后计算溶栓率平均值获得该干预时间下的溶栓率。

(2)设置不同干预时间，重复上述实验，绘制溶栓率对干预时间的曲线，结果见图4，由图4可以看出，在无超声触发下的中性环境下，尿激酶制剂溶栓效率较低，3小时的体外溶栓效率近10％左右，加入超声后的中性溶液中，溶栓效率提高3小时的体外溶栓效率可达20％，加入超声后的弱酸性溶液中，溶栓效率进一步提高，3小时体外溶栓效率接近30％。

以上数据说明，本发明制备的基于高分子载体的尿激酶制剂具有对超声和周围pH值环境的响应性，在外场超声和弱酸性条件下具有较快的释放速度和较高的溶血栓能力，在应用于急性缺血性脑卒中溶栓治疗时有望提高尿激酶作用的特异性，且更加安全，因此具有广阔的发展和应用前景。