本发明涉及固定酶载体技术领域，特别涉及一种固定酶的纤维素-SiO2复合载体的制备方法及纤维素-SiO2复合载体在固定酶方面的应用。
背景技术：
酶属于生物催化剂，与普通的化学反应催化剂相比，酶可在常温、常压等较为温和的条件下进行高选择性的催化反应。但由于酶一般是水溶性蛋白质,故往往存在如下缺点:①不稳定，易失活；②难以回收与反复使用；③不能实现连续操作。
固定化酶技术可改善上述缺点。固定化酶技术中，最为关键的是载体材料的选择或处理。目前典型的载体材料有天然高分子材料、合成高分子材料、无机材料等。其中，基于天然生物质材料的固定化酶载体由于具备无毒性，传质性能好、原料易得，价格低廉等优点，受到广泛关注。而纤维素作为世界上产量最大的生物质材料，用作固定化酶载体具有独特的优势。近年出现了将纤维素的羟基改造为醛基制备双醛纤维素，籍此直接与蛋白质的氨基产生共价键交联，从而实现酶的固定化的方法。这种方法避免了传统方法中添加醛类，如甲醛与戊二醛等易造成污染的弊端。
但纤维素作为一种天然高分子材料，用作固定化酶载体依然存在一些不足，主要体现在以下两方面：①亲水性过强，使用时易吸附其它杂质而受到污染；②有机物的刚性不强，耐用性有待改善。
技术实现要素：
为此，需要提供一种固化酶载体制备方法，该方法所制备的纤维素-SiO2复合载体具有疏水性，不易吸附污染物，同时本身具有刚性，耐用性，可应用于各种酶的固定。
本发明提供一种用于固定酶的纤维素-SiO2复合载体的制备方法，包括以下步骤：
S1：将双醛纤维素-SiO2粉末加入离子溶液，搅拌至粉末完全溶解后将溶液进行离心脱泡，制成第一混合溶液；
S2：将所述第一混合溶液冷却至温度为20～40℃,冷却时间为60～120分钟，制成第二混合溶液；
S3：将S2步骤制备的第二混合溶液制成厚度0.2～1.0mm的液膜或直径0.4～1.2mm的微球；
S4：将S3步骤制得的液膜或微球，置于体积百分比浓度为15％的乙醇-水溶液中凝固；
S5：去离子水清洗S4步骤中凝固成型的液膜或微球。
进一步地，所述S1步骤中，所述离子溶液为1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐或1-乙基-3-甲基咪唑溴盐中的任一种。
进一步地，所述S1步骤中，所述双醛纤维素-SiO2粉末与离子液体的重量比为1:10～30。
进一步地，所述S1步骤中，控制溶液温度保持在60～120℃，搅拌时间控制在2～6小时，离心脱泡时间为10分钟，离心速度为8000～12000r/min。
进一步地，所述S4步骤中，体积百分比浓度为15％的乙醇-水溶液每隔30分钟更换1次，更换总次数为2～5次。
进一步地，步骤S1中的双醛纤维素-SiO2粉末通过以下方法制备而得：
A1：在乙醇-水溶液中依次投入双醛纤维素和SiO2-NH2，混合均匀，得到第三混合溶液；
A2：所述第三混合溶液搅拌并加热至63～67℃，并在63～67℃下反应17～19小时,得到第一悬浊液；
A3：所述第一悬浊液进行抽滤、洗涤、真空干燥、研磨，得到所述双醛纤维素-SiO2粉末。
进一步地，步骤A1中双醛纤维素和SiO2-NH2的重量比是20.0～60.0；
进一步地，步骤A1中的SiO2-NH2通过以下方法制备而得：
B1：正硅酸乙酯或正硅酸丁酯加入乙醇水溶液，混合均匀,得到第四混合溶液；
B2：所述第四混合溶液加入冰乙酸后升温至70～80℃，反应10～20分钟,得到第五混合溶液；
B3：所述第五混合溶液逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出现凝胶；
B4：将B3步骤制备的凝胶真空干燥，得到SiO2-NH2。
进一步地，步骤A1中的双醛纤维素通过以下方法制备而得：
C1：微晶纤维素或浆粕加入盐酸溶液中，搅拌均匀，反应12小时后离心取沉淀物质；
C2：将C1步骤制备的沉淀物质用去离子水洗涤、浸泡,得到第二悬浊液；
C3：所述第二悬浊液中加入高碘酸钠，直至沉淀物质分散均匀，得到第三悬浊液，过程中控制悬浊液pH值保持在3～5，温度保持在35～50℃，本步骤在避光条件下进行。
C4：所述第三悬浊液中加入叔丁醇，离心分离得到所述双醛纤维素。
同时，发明人提供了一种纤维素-SiO2复合载体在固定酶方面的应用。纤维素-SiO2复合载体中，双醛纤维素为固定酶载体的主体，侧链带有大量醛基，可与酶蛋白产生交联，形成稳定的共价键，起到稳定的固定酶的作用；而SiO2粒子，可同时起到两方面作用：一方面，SiO2粒子对纤维素进行无机杂化，可使载体带有部分无机材料的性质，有效改善纤维素材料的耐候性、耐用性与稳定性；另一方面，SiO2粒子具有一定的疏水性，可避免载体使用时吸附污染物，即具有一定的自清洁效果。
复合载体用于固化酶后，可保留游离酶大部分的酶活，相比其他固化酶载体物质具有明显的优势。同时，固化在复合载体上的酶可以进行回收和反复使用，并实现连续操作。固化在该载体上的酶对温度的敏感性相比游离酶大大下降，具有稳定不易失活的特性。
区别于现有技术，上述技术方案具有如下优点：本发明所提供的纤维素-SiO2复合载体，引入SiO2-NH2，使之与双醛纤维素的部分醛基发生共价交联，使无机物SiO2与有机物纤维素杂化，可同时起到增强纤维素凝胶载体机械强度与疏水性的作用。纤维素-SiO2复合载体疏水性的改善，可避免固定酶载体使用时吸附污染物，具有一定的自清洁效果。同时复合载体用于固化酶后，可保留游离酶大部分的酶活，固化在复合载体上的酶可以进行回收和反复使用，对温度的敏感性相比游离酶大大下降，具有稳定不易失活的特性。
具体实施方式
本实施方式中所述微晶纤维素是一种纯化的、部分解聚的纤维素，白色、无臭、无味，由多孔微粒组成的结晶粉末，其主要成分为以β-1,4-葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质。
本实施方式中所述浆粕为青山纸业股份有限公司提供。浆粕中α-纤维素含量大于91％，动力粘度为9.0mPa·S，白度大于85％ISO，铁离子含量小于15mg/kg，聚戊糖含量小于3.0％，灰分含量小于0.15％，树脂含量小于0.3％。
本实施方式中所述离子液体1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑溴盐为中科院兰州化学物理研究所提供。离子液体纯度均大于98.5％，水分含量小于1.0％，咪唑与酸根离子含量小于0.5％。
实施例1一种纤维素-SiO2复合载体的制备方法
(1)称取6g微晶纤维素溶于100mL浓度为5mol/L的盐酸溶液中，搅拌，水解反应12小时后离心后取沉淀。沉淀物质用去离子水洗涤、浸泡，使沉淀悬浮于去离子水中；在搅拌下向溶液中加入高碘酸钠，直至沉淀物质分散均匀。反应在避光环境中进行，过程中溶液pH值保持为4，温度为35℃。反应后溶液中加入叔丁醇，离心分离得双醛纤维素。
(2)将10mL四乙基硅氧烷加入50mL乙醇-水溶液(体积百分比为50％)中，混合均匀，再加入0.1mL冰乙酸，升温至75℃，10分钟后，逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出现凝胶。将凝胶真空干燥，得到SiO2-NH2。
(3)步骤(1)中所得双醛纤维素取6g，步骤(2)中所得SiO2-NH2取0.1g，加入50mL乙醇-水溶液(体积百分比为50％)中，混合，在75℃下反应8小时，抽滤，洗涤，真空干燥，研磨，得到粉末状的双醛纤维素－SiO2。
(4)取1g步骤(3)中所得的粉末状双醛纤维素－SiO2溶解在20g的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体中，溶液过程液体温度控制在60℃，并搅拌120分钟，使粉末完全溶解，得到含有纤维素－SiO2的离子溶液，离子溶液用高速离心机在8000r/min转速下离心脱泡10min后，在自来水中冷却60分钟至20℃，使溶液粘度增加。将冷却后的溶液倒在刮膜机的刮膜面板上，启动刮刀，将溶液推平，从而制成厚度为0.2mm的液膜，将液膜置于体积百分比浓度为15％的乙醇-水溶液中进行凝固，凝固期间换液2次，每次换液间隔为30分钟。经去离子水清洗后得到双醛纤维素－SiO2复合凝胶薄膜。
实施例2葡萄糖氧化酶的固化试验。
实施例1所得的双醛纤维素－SiO2复合凝胶薄膜进行葡萄糖氧化酶的固化，固化步骤如下：配制浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶-磷酸盐溶液(pH＝6.5)，将双醛纤维素－SiO2复合凝胶薄膜浸入溶液，置于摇床中33℃振荡反应4小时后，取出凝胶薄膜，用磷酸盐缓冲液和去离子水各洗涤3次，得到固定化于载体上的葡萄糖氧化酶。
将该固化的葡萄糖氧化酶进行系列测试，结果如下：固定化于载体上的固化葡萄糖氧化酶可保留游离葡萄糖氧化酶的活性达72.3％；重复使用5次后的葡萄糖氧化酶的酶活回收率为78.0％；在40℃的水浴下恒温60分钟后的葡萄糖氧化酶酶活相比在30℃的水浴下恒温60分钟后的葡萄糖氧化酶酶活仅下降6.1％，而游离葡萄糖氧化酶在同等条件下酶活下降达75.3％。
同时，该固化的葡萄糖氧化酶在磷酸盐缓冲溶液中静置15天未观察到长菌现象。
实施例3一种纤维素-SiO2复合载体的制备方法
(1)称取4g浆粕溶于100mL浓度为5mol/L的盐酸溶液中，搅拌，水解反应12小时后离心后取沉淀。沉淀物质用去离子水洗涤、浸泡，使沉淀悬浮于去离子水中；在搅拌下向溶液中加入高碘酸钠，直至沉淀物质分散均匀。反应在避光环境中进行，过程中溶液pH值保持为3，温度为50℃。反应后溶液中加入叔丁醇，离心分离得双醛纤维素。
(2)将20mL正硅酸丁酯加入60mL乙醇-水溶液(体积百分比为50％)中，混合均匀，再加入0.5mL冰乙酸，升温至85℃，15分钟后，逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出现凝胶。将凝胶真空干燥，得SiO2-NH2。
(3)步骤(1)中所得双醛纤维素取4g，步骤(2)中所得SiO2-NH2取0.1g，加入50mL乙醇-水溶液(体积百分比为50％)中，混合，在65℃下反应24小时，抽滤，洗涤，真空干燥，研磨，得到粉末状的双醛纤维素－SiO2。
(4)取3g步骤(3)中所得的粉末状双醛纤维素－SiO2溶解在30g1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐离子液体中，控温在120℃，搅拌40分钟使粉末完全溶解，得到含有双醛纤维素－SiO2的离子溶液，趁热用高速离心机在10000r/min转速下离心脱泡10分钟，在空气中自然冷却100分钟至30℃，使溶液粘度增加。将溶液用直径1.2毫米的挤出口挤出颗粒状液滴，置于乙醇-水溶液(体积百分比为15％)中进行凝固，凝固期间换液3次，每次间隔为30分钟。经去离子水清洗后得到双醛纤维素－SiO2复合凝胶微球。
实施例4纤维素酶的固化试验。
实施例3所得的双醛纤维素－SiO2复合凝胶薄膜进行纤维素酶的固化，固化步骤如下：配制浓度为1.5mg/mL的纤维素酶-磷酸盐溶液(pH＝7.2)，将双醛纤维素－SiO2复合凝胶微球浸入溶液中，置于摇床中振荡，于40℃下反应6小时后取出凝胶微球，最后凝胶微球用磷酸盐缓冲液和去离子水各洗涤3次，得到固定化于微球载体上的纤维素酶。
将该固化的纤维素酶进行系列测试，结果如下：固定化于载体上的固化纤维素酶可保留游离纤维素酶的活性达81.5％；重复使用5次后纤维素酶的酶活回收率为76.7％；在70℃的水浴90分钟后纤维素酶的酶活相比在60℃水浴90分钟后纤维素酶的酶活，仅下降3.4％，而游离纤维素酶的酶活在同等条件下下降达36.9％。
同时，该固化的纤维素酶在磷酸盐缓冲溶液中静置15天未观察到长菌现象。
实施例5一种纤维素-SiO2复合载体的制备方法
(1)称取3g微晶纤维素溶于100mL浓度为5mol/L的盐酸溶液中，均匀搅拌，水解反应12小时后离心后取沉淀。沉淀物质用去离子水洗涤、浸泡，使沉淀悬浮于去离子水中；在搅拌下向溶液中加入高碘酸钠，直至沉淀物质分散均匀。反应在避光环境中进行，过程中溶液pH值保持为5，温度为45℃。反应后溶液中加入叔丁醇，离心分离得双醛纤维素。
(2)将15mL正硅酸丁酯加入40mL乙醇-水溶液(体积百分比为50％)中，混合均匀，再加入0.3mL冰乙酸，升温至80℃，20分钟后，逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出现凝胶。将凝胶真空干燥，得SiO2-NH2。
(3)步骤(1)中所得双醛纤维素取2g，步骤(2)中所得SiO2-NH2取0.1g，加入50mL乙醇-水溶液(体积百分比为50％)中，混合，在70℃下反应16小时，抽滤，洗涤，真空干燥，研磨，得到粉末状的双醛纤维素－SiO2。
(4)取1g步骤(3)中所得的粉末状双醛纤维素－SiO2溶解在30g 1-乙基-3-甲基咪唑溴盐离子液体中，控温在90℃，搅拌80分钟使粉末完全溶解，得到含有双醛纤维素－SiO2的离子溶液，趁热将溶液用高速离心机在12000r/min转速下离心脱泡10min后，将溶液在空气中自然冷却60分钟至40℃，使溶液粘度增加。将溶液用直径0.4毫米的挤出口挤出颗粒状液滴，置于乙醇-水溶液(体积百分比为15％)中进行凝固，凝固期间换液5次，每次间隔为30分钟。经去离子水清洗后得到双醛纤维素－SiO2复合凝胶微球。
实施例6β-半乳糖苷酶的固化试验。
实施例5所得的双醛纤维素－SiO2复合凝胶薄膜进行纤维素酶的固化，固化步骤如下：配制浓度为2.5mg/mL的β-半乳糖苷酶-磷酸盐溶液(pH＝7)，将双醛纤维素－SiO2复合凝胶微球浸入溶液中，置于摇床中振荡，于20℃下反应3小时，用磷酸盐缓冲液和去离子水各洗涤3次，得到固定化于微球载体上的β-半乳糖苷酶。
将该固化的β-半乳糖苷酶进行系列测试，结果如下：固定化于载体上的β-半乳糖苷酶可保留游离β-半乳糖苷酶的活性达74.8％；重复使用5次后β-半乳糖苷酶的酶活回收率为71.2％；在45℃的水浴60分钟后β-半乳糖苷酶的酶活相比在30℃水浴60分钟后β-半乳糖苷酶的酶活下降12.5％，而游离β-半乳糖苷酶在同等条件下酶活下降达42.9％。
同时，固定化于载体上的β-半乳糖苷酶在磷酸盐缓冲溶液中静置15天未观察到长菌现象。
通过以上试验，表明本发明产品一种用于固定酶的纤维素-SiO2复合载体在固化酶后，可保留游离酶70％以上的酶活，相比其他固化酶载体物质具有明显的优势。同时，固化在本复合载体上的酶在重复使用5次后的酶活依然有使用前70％以上，证明固化在本复合载体上的酶可以进行回收和反复使用，并实现连续操作。而实施例中水浴试验说明固化在该载体上的酶对温度的敏感性相比游离酶大大下降，固化在该载体上的酶具有稳定不易失活的特性。最后，固化于该载体上的酶在磷酸盐缓冲溶液中静置15天未观察到长菌现象，说明该载体具有一定的自清洁效果。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。