专利名称：具有提高的活性的β-葡糖苷酶变体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及分解木质纤维素生物质的酶的表达和优化。更具体地，本发明涉及包 含至少一个氨基酸修饰的β-葡糖苷酶变体，这些修饰的氨基酸根据里氏木霉菌β-葡糖 苷酶的SEQ ID No. 2的编号位于第225、238、240和241位。本发明还涉及这些具有改善的 效能的变体在纤维素分解方法和生物燃料(例如乙醇、丁醇、异丙醇)的制备方法中的用 途。
背景技术：
乙醇是一种清洁燃料，并且起始原料来源广泛，因此从纤维素制备乙醇的可能性 已经得到了极大的关注。该方法的天然纤维素起始原料用术语“生物质”表示。许多类型的生物质，包括木 材、农业废弃物、草本作物和固体废物，被认为可以用作制备生物燃料的起始原料。这些原 料主要由纤维素、半纤维素和木质纤维素组成。纤维素是由葡萄糖分子组成的聚合物，其中葡萄糖分子通过β 1-4键连接，该连 接对于酸、酶或微生物的分解或解聚作用具有很强的抗性。一旦纤维素转变成葡萄糖，所述 葡萄糖就易于通过酵母发酵形成生物燃料，例如乙醇。这些将纤维素转变成糖的传统研究方法都是基于酸水解作用。这些方法可在浓酸 或稀酸存在的情况下进行。但是，这些方法存在一些缺点，例如在使用浓酸时，酸的回收率 差，在使用稀酸时，葡萄糖产率低，这些都使酸水解方法不能实现商业化。为了克服酸水解方法的缺点，最近提出了使用纤维素型酶进行酶水解的纤维素转 化方法。但是酶水解木质纤维素生物质(例如纤维素)的方法也有工业生产成本过高的缺 点。因此，有必要使用分泌更加有效的纤维素酶的微生物株。在此方面，许多微生物含有水解纤维素的酶，例如真菌木霉菌(Trichoderma)、 曲霉菌(Aspergillus)、腐质霉菌(Humicola)或镰孢菌(Fusarium)，以及细菌，例如热 单孢菌(Thermomonospora)、芽孢杆菌(Bacillus)、纤维单胞菌(Cellulomonas)和链霉菌 (Streptomyce)。这些微生物中的酶在用于将纤维素转变成葡萄糖时具有三种活性类型，因 此可被分成三组内切葡聚糖酶，随机地作用于纤维素纤维的内部；外切葡聚糖酶，作用于 纤维素的末端，释放出纤维二糖；β-葡糖苷酶，将此纤维二糖水解成葡萄糖。这些葡 糖苷酶是纤维素转化方法的限速步骤。这是因为该方法的主要困难在于纤维二糖转化成葡 萄糖，因为在制备生物燃料时，在方法结束时任何未水解的纤维二糖代表收率的损失。由于一些产生纤维素酶的微生物，包括木霉菌，产生的β -葡糖苷酶极少，因此在 酶水解方法中纤维二糖的蓄积是一个主要的问题。具体而言，工业木霉菌株产生的所有蛋 白质中，β-葡糖苷酶类型要少于1%。因此，较低的β-葡糖苷酶量导致将纤维二糖水解 成葡萄糖的容量较低，从而导致了所述纤维二糖在系统中的蓄积。而且，高浓度的纤维二糖 抑制了其它以纤维二糖作为最终反应产物的纤维素酶，特别是外切葡聚糖酶的活性。已经提出了几种提高微生物中的β -葡糖苷酶活性，从而提高纤维二糖到葡萄糖的转化率的方法。第一种方法包括加入外源性产生的β -葡糖苷酶到微生物分泌的混合物中，以促 进水解。然而，该方法由于成本昂贵而没有商业可行性。第二种方法，如WO 92/010581中描述，采用基因工程方法将新的β-葡糖苷酶基 因的拷贝插入到微生物的基因组中，如此所述微生物产生大量的酶。第三种方法，如WO 99/46362中描述，包括使用包含启动子、成熟的β -葡糖苷酶 基因和木聚糖酶分泌信号序列的基因构建物对微生物进行遗传修饰。木聚糖酶分泌信号序 列的存在使得可能显著提高微生物产生的β-葡糖苷酶的量。然而，为了使木质纤维素生物质的水解有效和有经济价值，该酶混合物必须由一 种并且是唯一的菌株产生，并且必须包括平衡比例的各种酶活性(尤其是，但不仅仅是，外 切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡糖苷酶)。举例来说，在里氏木霉菌的天然混 合物中，一般存在70-80%的外切葡聚糖酶、15-20%的内切葡聚糖酶、数个百分比的半纤维 素酶和约0.5%的β-葡糖苷酶。该混合物完全适合水解大多数的预处理的底物(例如，在 酸性条件下蒸汽爆破(steam-explode)处理的麦秆)，并且收率可以接受。总之，如果通过 富集酶的量以增加β -葡糖苷酶的活性，其必须不能损害其它酶的活性。因此，不显著改变混合物中所有酶的比例而获得高β-葡糖苷酶活性的可能性， 对于将木质纤维素生物质转变成生物燃料的方法具有重要意义。
发明内容
基于这种想法，申请人公司做出了巨大的努力，通过大量的研究发现了分离的或 者纯化的多肽，该多肽具有比野生型BGLl蛋白质(SEQ ID No. 2)的β _葡糖苷酶活性提高 的β-葡糖苷酶活性，包含相比SEQ ID No. 2的氨基酸序列有至少一个氨基酸被修饰的氨 基酸序列，所述修饰的氨基酸选自氨基酸序列SEQ ID Νο.2的第225、238、240和241位， 所述的氨基酸序列与SEQ ID No. 2有至少75%的序列同一性，优选与SEQ ID No. 2有至少 80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 的序列同一性。此外，根据本发明的多肽具有对葡萄糖产生的抑制作用较不敏感的优点，因此，在 高葡萄糖浓度的存在下维持了较好的葡糖苷酶活性。在一个实施方式中，上述多肽的特征在于与在缺乏葡萄糖时测定的野生型BGLl 蛋白(SEQ ID No. 2)的葡糖苷酶活性相比，在葡萄糖存在时测定的葡糖苷酶活性 得到了提高。本领域技术人员可以，例如，使用底物ρηρ-吡喃葡萄糖苷通过酶活性测试确定本 发明多肽的酶活性的增加(换言之，确定多肽的酶活性的提高)。葡糖苷酶作用后获得 的对硝基苯酚的量可以例如通过在414nm下读取吸光度而确定。本领域技术人员用来确定本发明的多肽相比于野生型BGLl蛋白质是否具有提高 的酶活性的方案的实例如下-形成表达本发明多肽的大肠杆菌储存培养物，在37°C下过夜。-在20°C下用的储存培养物接种LB培养基Mh;-在13000rpm下离心2分钟；-将细胞沉淀物用IOOmMpH 5的琥珀酸缓冲液重悬浮(OD6tltl终值为100)；
-用含有15mMpnp-吡喃葡萄糖苷的IOOmM pH 5的琥珀酸缓冲液100 μ 1在50°C 下孵育50 μ 1细胞1. 5小时，随后在冰上孵育5分钟；-加入0. 2Μ 的 Na2CO3 溶液 150 μ 1 ；-在13 OOOrpm下离心2分钟；-在414nm下读取150μ 1上清液的吸光度。此外，本领域技术人员可使用上述方案，用含有15mM的pnp-吡喃葡萄糖苷和60g/ 1葡萄糖的IOOmM pH 5的琥珀酸缓冲液100 μ 1在50°C下孵育50 μ 1细胞1. 5小时，以确 定本发明的多肽相比于野生型BGLl蛋白质是否对葡萄糖产生的抑制作用更不敏感。本发明上下文中，“修饰的”氨基酸表示“取代的”、“插入的”或“缺失的”氨基酸。根据一个实施方式，“修饰的”氨基酸为相比于SEQ ID No. 2的氨基酸序列“取代 的”氨基酸。根据一个实施方式，“修饰的”氨基酸为相比于SEQ ID No. 2氨基酸序列“插入的”
氨基酸。根据一个实施方式，“修饰的”氨基酸为相比于SEQ ID No. 2氨基酸序列“缺失的”
氨基酸。根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与氨基酸序列SEQ ID Νο.2相比，氨基 酸序列有至少2个氨基酸是经修饰的，所述经修饰的氨基酸选自序列SEQ ID Νο.2的第 225,238,240 和 241 位。根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与氨基酸序列SEQ ID Νο.2相比，氨基 酸序列的至少3个氨基酸是经修饰的，所述经修饰的氨基酸选自序列SEQ ID No. 2的第 225,238,240 和 241 位。根据一个实施例，上述多肽的特征在于与氨基酸序列SEQ ID No. 2相比，氨基酸 序列的至少4个氨基酸是经修饰的，所述经修饰的氨基酸为氨基酸序列SEQ ID No. 2的第 225,238,240和241位的氨基酸。根据一个实施方式，上述多肽的特征在于与氨基酸序列SEQ ID No. 2相比，氨基 酸序列的至少1个、至少2个、至少3个或至少4个氨基酸是经修饰的，所述修饰选自Q225H、 V238I.T240G 和 T241S。根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与序列SEQ ID No. 2相比，1个氨基酸是 经修饰的，所述修饰为Q225H。根据一个实施方式，上述多肽的特征在于，与序列SEQ ID No. 2相比，3个氨基酸是 经修饰的,所述修饰为V238I、T240G和T241S。根据一个实施方式，上述多肽的特征在于与序列SEQ ID Νο.2相比，4个氨基酸 是经修饰的，所述修饰为Q225H、V238I、T240G和T241S。根据一个实施方式，上述多肽也包含至少1个另外的经修饰的氨基酸，所述氨基 酸选自氨基酸序列 SEQ ID No. 2 的位置 97、99、100、118、119、121、123、126、127、128、130、 132、134、135、140、147、151、153、163、168、173、174、177、179、182、187、193、206、207、212、 217 和 621。根据一个实施方式，上述多肽的特征在于所述另外的经修饰的氨基酸包含一个 或者多个修饰，所述修饰选自由 V97I、Y99F、S100G、V118T、N119E、I121M、E123Q、Q126E,
6F127Y、I128L、E130A、V132A、A134G、S135C、S135V、I140L、P147A、T151I、Q153H、V163T、 T168A、G173A、G173S、Q174E、N177E、I179L、V182A、V182N、T187C、L193V、N206D、P207V、 L212M、T217L、L621F 和 L621T 组成的组。根据一个实施例方式，上述多肽选自-选自SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、 SEQ ID No. 14的氨基酸序列；或-氨基酸序列SEQID No. X，其具有i)相对于SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14的长度，至少70 %同一性，优选75 %、 80%、85%、90%、95%、98%或99%的相同残基百分比；ii)相对于 SEQ ID No. X 的长度，至少 70% 同一性，优选 75%、80%、85%、90 %、 95%、98%或99%的相同残基百分比。本发明的氨基酸序列的变体可通过多种常规方法制备，例如用本文中出现的全部 或部分核苷酸或肽序列进行随机诱变、定点诱变、基因合成或改组。这些变体包括，例如，酶 的氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。本发明涉及从本文中出现的序列 获得的任何变体，只要所述氨基酸序列的变体与Bgl-I相比保持提高的β -葡糖苷酶功能 (定义如上)。在一个实施方案中，本发明涉及由于实用原因以下称为SEQ ID No. X的氨基酸序 列，当其与SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14排比时，包括a)相对于SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14的长度，至少70 %同一性，优选75 %、 80%、85%、90%、95%、98%或99%的相同残基百分比；和b)相对于 SEQ ID No. X 的长度，至少 70 % 同一性，优选 75 %、80 %、85 %、90 %、 95%、98%或99%的相同残基百分比。根据本发明，相对于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的长度的相同残基百分比对 应于在SEQ ID No.X和SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14之间相同的残基数目除以SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14中的残基数目。当使用GenomeQuest数据库时，所述相对于SEQ ID No.4、6、8、10、12或14的长度的相同残基百分比对应于查询(Query)同一性百分比(％ id Query)，其中查询对应于序列SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14。根据本发明，相对于SEQ ID No. X的长度的相同残基百分比对应于在SEQ ID No.X 和SEQ ID No. 4、6、8、10、12或14之间相同的残基数目除以SEQ ID No. X中的残基数目。当 使用GenomeQuest数据库时，所述相对于SEQ ID No. X的长度的相同残基百分比对应于目 标(Subject)同一性百分比(% id Subject)，其中目标对应于SEQ ID No.X。本发明的主题也在于编码至少一种上述的多肽的纯化的或分离的核酸。下表1包 括对Bgl-I基因和基因A和C、以及本发明的多肽的核酸和多肽序列的鉴定。表 权利要求
1.一种与野生型BGLl蛋白(SEQ ID No. 2)的β-葡糖苷酶活性相比具有提高的β-葡 糖苷酶活性的分离的或纯化的多肽，其特征在于它含有一种氨基酸序列，其中至少一个氨 基酸与氨基酸序列SEQ ID No. 2相比是经修饰的，所述经修饰的氨基酸选自氨基酸序列SEQ ID No. 2的第225位、第238位、第240位和第241位。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于与所述氨基酸序列SEQID No. 2相比，所述 氨基酸序列的至少一个氨基酸是经修饰的，所述修饰选自Q225H、V238I、T240G和T241S。
3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于所述多肽还包含至少一个另外的经修 饰的氨基酸，所述修饰的氨基酸选自氨基酸序列SEQ ID No.2的位置97、99、100、118、119、 121、123、126、127、128、130、132、134、135、140、147、151、153、163、168、173、174、177、179、 182、187、193、206、207、212、217 和 621。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的多肽，其特征在于所述多肽还包含至少一个另外 的经修饰的氨基酸，所述修饰选自:V97I、Y99F、S100G、V118T、N119E、I121M、E123Q、Q126E、 F127Y、I128L、E130A、V132A、A134G、S135C、S135V、I140L、P147A、T151I、Q153H、V163T、 T168A、G173A、G173S、Q174E、N177E、I179L、V182A、V182N、T187C、L193V、N206D、P207V、 L212M、T217L、L621F 和 L621T。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的或纯化的多肽，其特征在于所述多肽选自选自 SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14的氨基酸序列；或-氨基酸序列SEQ ID No. X，其具有i)相对于SEQ ID No. 4、6、8、10、12 或 14 的长度，至少 70%，优选 75%、80%、85%、 90%、95%、98%或99%的相同残基百分比；ii)相对于SEQ ID No. X 的长度，至少 70%，优选 75%、80%、85%、90%、95%、98%或 99%的相同残基百分比。
6.一种纯化的或分离的核酸，其特征在于其编码权利要求1-5中任一项所述的至少一 种多肽。
7.一种载体，其特征在于其包含权利要求6所述的核酸。
8.一种分离的宿主细胞，其特征在于它包含权利要求1-5中任一项所述的至少一种多 肽，或包含权利要求6所述的至少一种核酸，或包含权利要求7所述的至少一种载体。
9.根据权利要求8所述的分离的宿主细胞、其特征在于其选自木霉菌属、曲霉菌属、 脉孢菌属、腐质霉菌属、青霉菌属、镰孢菌属、热单孢菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、埃希氏 菌属、梭菌属、纤维单胞菌属、链霉菌属、亚罗酵母属、毕赤酵母和酵母属。
10.根据权利要求8或9所述的分离宿主细胞，其特征在于其选自里氏木霉菌，绿色 木霉菌，康氏木霉菌，黑曲霉菌，构巢曲霉菌，文氏曲霉菌，米曲霉菌，海枣曲霉菌，粗糙脉孢 霉菌，灰色腐殖霉菌，嗜松青霉菌，草酸青霉菌，大肠杆菌，丙酮丁醇杆菌，解糖梭菌，拜氏梭 菌，丁酸梭菌及其混合物。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽用于β-寡糖的水解的用途。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽用于将纤维二糖水解成葡萄糖的用途。
13.根据权利要求1-5中任一项所述的多肽用于制备生物燃料的用途。
14.一种对木质纤维素生物质起作用的酶组合物，所述酶组合物是由丝状真菌产生的， 而且包含权利要求1-5中任一项所述的至少一种多肽。
15.一种从生物质制备生物燃料的方法，其特征在于它包括以下步骤 -将待水解的生物质悬浮于水相中；-加入权利要求14所述的对木质纤维素生物质起作用的酶组合物，以开始水解； -测定释放的糖；-分离糖溶液与未水解的固体部分； -发酵糖溶液； -从发酵液中分离生物燃料。
16.一种从生物质制备生物燃料的方法，其特征在于它包括以下步骤 -将待水解的生物质悬浮于水相中；-同时加入权利要求14所述的对木质纤维素生物质起作用的酶组合物和发酵生物体； -从发酵液中分离生物燃料。
全文摘要
本发明涉及与木质纤维素生物质分解有关的酶的表达和优化。更具体地，本发明涉及包含至少一个氨基酸修饰的β-葡糖苷酶变体，这些修饰的氨基酸根据里氏木霉菌β-葡糖苷酶的SEQ ID No.2的编号位于第225、238、240和241位，本发明还涉及具有改善的效能的这些变体在纤维素分解方法和生物燃料的制备方法中的用途。
文档编号C12N15/81GK102149819SQ200980136701
公开日2011年8月10日 申请日期2009年9月10日 优先权日2008年9月12日
发明者于格·马蒂, 安东尼·马尔若, 尼古拉斯·洛普·费雷拉, 洛朗·富拉热 申请人:Ifp新能源公司, 普罗托斯公司