专利名称：一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种制备尿激酶精品的方法。
背景技术：
尿激酶是人血液中的尿激酶原在部分降解后从尿液中排出的一种丝氨酸蛋白酶， 为血纤蛋白溶酶原激活剂，可将纤溶酶原转化为纤溶酶，临床上主要用于治疗急性心肌梗塞、急性脑血栓形成、脑血管栓塞、血栓性闭塞性疾病、肺栓塞以及视网膜中央静脉血栓形成等疾病。
《中国药典》2005版和2010版，明确规定“本品在生产过程中需经60°C加热10小时，以使病毒灭活”；且质量标准要求尿激酶的细菌内毒素小于1. OEU/万单位。
目前，国内不少专家针对尿激酶的制备工艺进行了深入的试验研究，如一种特异性纯化高分子尿激酶层析介质及制备方法和应用(杨华英等专利号CN101693748A)、一种尿激酶制备方法(张志武等专利号CN101701215A)等，都结合使用离子交换层析法、凝胶分子筛法、免疫亲和层析、对氨基苯甲脒-Sepharose亲和层析技术，纯化精制得到尿激酶。使产品的比活、高分子尿激酶相对含量以及尿激酶生物活性的回收率不断提高。
但是针对尿激酶产品中病毒及热原的去除研究，发表的文献较少。
细菌内毒素属于热原的一种，而热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。 致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱， 霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。当含有热原的物质进入人体以后，人体会产生发冷、 寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40°C以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。因此去热原是本品生产工序中不可缺少的一步。发明内容
本发明的目的是提供了一种能够去除病毒及热原的尿激酶制备方法。
本发明的技术方案是将尿激酶粗品经DEAE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品，包括如下步骤
(I)粗品提取取尿激酶粗品，加磷酸盐缓冲液进行溶解，尿激酶粗品与磷酸缓冲液的比例为lg 10 14ml ;搅拌；过滤，将滤饼再加磷酸缓冲液进行溶解，滤饼与磷酸缓冲液按的比例为Ig 2 5ml ;搅拌，过滤；合并两次的滤液，调节滤液pH至7. O 8. O;
(2)超滤将粗提液用超滤膜超滤至原体积的1/5至1/20 ;加水至原体积后，继续超滤至原体积的1/5至1/15 ;加O. 025mol/L PB S平衡液至原体积后，继续超滤至原体积的 1/2 至 1/5 ；
(3)DEAE-纤维 素层析取经0.025mol/L PB S平衡液平衡的DEAE-纤维素，加入超滤液中，搅拌，过滤；在滤液中加入上一次量1/2的0.025mol/L PB S平衡液平衡的DEAE-纤维素，搅拌，过滤；合并二次滤液；(4) CMC层析调节滤液pH至3. 0 5. 0，调整电导率至15 20 ii S/cH。CMC柱先用0. 05 0. 2mol/L醋酸缓冲液平衡，再将滤液上CMC柱，用0. 05% 0. 2%氨水溶液洗脱，得洗脱液。将洗脱液在60°C水浴灭菌10小时；(5)亲和层析将 Tryp sin-1nhibitor-Sepharose 装柱，用含 lmol/L NaCl的0. 01mol/L PBS平衡液洗涤平衡；将已灭菌的洗脱液进行上柱；用含lmol/L NaCl的
0.OlmoI/LPBS平衡液洗涤I 3个床体积，再用含0. 5mol/L NaCl的0. OlmoI/LPBS平衡液洗涤0.1 I个床体积；最后用0. Olmol/LPBS洗脱液洗脱，收集洗脱液。(6)沉淀、干燥调节洗脱液pH至6.0 7.0，用こ醇进行沉淀，洗脱液与こ醇的体积比为1: 3 8;再用こ醇洗涤沉淀，重复2 4次；干燥，得干燥品。(7)去热原1:将干燥品加水，按Ig 60 75ml的比例进行溶解，在搅拌下加入等体积-20 0°C的こ醇，再按溶液总体积Iml : 5 IOg的比例加入醋酸铵，然后缓慢加入0.1 0. 3mol/L磷酸钠溶液，其用量与干燥品的比例为1ml 10 14g，搅拌，最后加入0.1 0. 5mol/L醋酸钙溶液，其用量与干燥品重量的比例为1ml 10 14g ;调节pH至8. 5，搅拌，离心，取上清液。(8)去热原I1:上清液调pH至6. 0 7. 0，在搅拌时，加入こ醇进行沉淀，上清液与加入こ醇的体积比为1 4 6，离心。再用こ醇洗涤沉淀物，离心，反复2 4次；然后沉淀物干燥，得尿激酶精品。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进ー步说明。实施例 所述的利用尿激酶粗品经DEAE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品，包括如下步骤1. DEAE-纤维素层析1.1粗品提取取粗品420g，溶解于12倍量lmol/L磷酸缓冲液中，搅拌提取2小时后，过滤得滤液。滤饼再次溶解于4倍量lmol/L磷酸缓冲液中，搅拌，过滤得滤液。合并二次滤液，用5mol/LHCl 调 pH 至 7. 5。1. 2 超滤将已调pH至7. 5的粗提液用Cut-off 10000MW的超滤膜超滤至原体积的1/12吋，加水至原体积，继续超滤至原体积的1/10，然后加0. 025mol/LPBS平衡液至原体积，继续超滤至原体积的1/3。1. 3DEAE-纤维素层析1. 3.1取经0. 025mol/LPB S平衡液平衡的DEAE-纤维素，按超滤液30个OD (280nm)加ー克的比例加入超滤液中，搅拌，过滤得滤液。1. 3. 2 用 0. 025mol/LPBS 平衡液洗涤 DEAE-纤维素。1. 3. 3在滤液中加入1. 3.1中一半量的DEAE-纤维素，搅拌，过滤得滤液。1. 3. 4合并二次滤液。
2. CMC 层析2.1将滤液调节pH至4. 2，并加氯化钠调整滤液使电导在17处。2. 2滤液上经0. lmol/L醋酸缓冲液平衡过夜的CMC柱，流速控制在125ml/min ;用
0.1 %氨水溶液洗脱,得洗脱液。2. 3将洗脱液在60°C水浴灭菌10小吋。3.亲和层析3.1 将 Trypsin-1nhibitor-Sepharose 装柱，用 25 倍床体积的含 lmol/LNaCl 的
0.Olmol/LPBS平衡液洗涤平衡12小吋。3. 2将已灭菌的洗脱液上柱，流速控制在42ml/min。3. 3上柱结束后，用含lmol/LNaCl的0. Olmol/LPBS平衡液洗涤2个床体积，再用含0. 5mol/L NaCl的0. Olmol/LPBS平衡液洗涤I个床体积。3. 4 洗脱用0. Olmol/LPBS洗脱液洗脱，流速控制在40ml/min，收集流出液。3. 5 沉淀 用NaOH溶液调节pH至6. 51，再用こ醇进行沉淀，加入的こ醇与洗脱液的体积比为5 1，搅拌，静置沉淀12小吋。3. 6 干燥沉淀结束后，离心，用こ醇洗涤沉淀，重复二次；将沉淀物干燥，干燥后得干燥品
11.5g。4.去热原4.1将上述干燥品加入788ml水搅拌溶解；在搅拌下加入等体积こ醇，然后再加入醋酸铵，醋酸铵的用量与溶液总体积的比例为8g 1ml，溶液澄清；4. 2再缓慢加入0. 2mol/L磷酸钠溶液189ml，搅拌15分钟后，加入0. 3mol/L醋酸钙溶液189ml ；4. 3然后，用5mol/L NaOH调节pH至8. 5，搅拌I小时，离心，弃去沉淀物；4. 4最后用5mol/L HCl调节上清液pH至6. 68，在搅拌下，加入9860mlこ醇，沉淀析出，置冰箱静置12小时；4. 5沉淀结束后，离心，用こ醇洗涤沉淀，反复2次；4. 6最后,将沉淀物干燥,得干燥品29. 6g,即为成品。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述掲示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
权利要求
1.一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法，其特征在于将尿激酶粗品经 DEAE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品。
2.根据权利要求1所述的提取尿激酶精品的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤:(1)粗品提取取尿激酶粗品溶解于磷酸缓冲液中，搅拌，过滤，调节PH；(2)超滤将粗提液超滤；加水，超滤；加PBS平衡液，超滤；(3)DEAE-纤维素层析用PBS平衡液平衡DEAE-纤维素，加入超滤液中，搅拌，过滤；在滤液中加PBS平衡液平衡的DEAE-纤维素，搅拌，过滤；(4)CMC层析调节滤液pH和电导率，再将滤液上CMC柱，用氨水溶液洗脱，得洗脱液， 灭菌；(5)亲和层析将树脂装柱，用含NaCl的PBS平衡液洗涤平衡，将已灭菌的洗脱液上柱，洗涤；用PBS洗脱液洗脱，收集流出液；(6)沉淀、干燥调节流出液pH，加入乙醇沉淀，离心，沉淀物用乙醇洗涤，干燥，得干燥品O(7)去热原1:将干燥品用水溶解，依次加入乙醇、醋酸铵、磷酸钠溶液、醋酸钙溶液，搅拌，调节 pH，搅拌，离心，取上清液；I1:调节上清液PH，搅拌，加入乙醇进行沉淀，离心，并用乙醇洗涤沉淀，干燥，得去除热原及病毒的尿激酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(I)中，将尿激酶粗品用磷酸缓冲液溶解；尿激酶粗品与磷酸缓冲液的比例为lg 10 14ml ;调节pH至7. O 8. O。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中，将粗提液用超滤膜超滤至原体积的1/5至1/20 ;加水至原体积后,再超滤至原体积的1/5至1/15 ;加O. 025mol/L PBS 平衡液至原体积后，继续超滤至原体积的1/2至1/5。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中，DEAE-纤维素用0.025mol/L PBS平衡液平衡。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(4)中，调节滤液pH至3.O 5.0， 调整电导率至15 20 μ S/cm ；CMC柱用O. 05 O. 2mol/L醋酸缓冲液平衡；氨水溶液体积浓度为O. 05% O. 2% ;将洗脱液在60°C水浴灭菌10小时。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(5)中，树脂柱用含lmol/LNaCl的O.01mol/L PBS平衡液平衡；将洗脱液上柱，上柱结束后，先用含lmol/L NaCl的O. Olmol/ LPBS平衡液洗涤柱子，再用含O. 5mol/L NaCl的O. Olmol/LPBS平衡液洗涤；最后用0.Olmol/LPBS洗脱液洗脱，收集洗脱液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(6)中，调节pH至6.O 7.0，加入乙醇的体积是洗脱液体积的3 8倍。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(7)的I中，用水量与干燥品的比例为60 70ml Ig ;醇的温度_20 0°C ;醋酸铵的用量与溶液总体积的比例为5 IOg Iml ;磷酸钠溶液的浓度0.1 0. 3mol/L，磷酸钠溶液的用量与干燥品的比例为 10 14ml Ig ;醋酸钙溶液的浓度0.1 0. 5mol/L，醋酸钙溶液的用量与干燥品的比例为10 14ml Ig ;调节 pH 为 8. 5。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在干步骤(7)的II中，上清液调pH至6.0 ,7. O。
全文摘要
本发明公开了一种能够去除热原及病毒的尿激酶的制备方法。本发明的技术方法是将尿激酶粗品经DE AE-纤维素层析、CMC层析、亲和层析、去热原后得到尿激酶精品。该技术的优点在于在生产过程中采用60℃水浴灭菌处理使病毒失活以及用磷酸三钠和醋酸钙吸附去除产品中的热原，保证产品的质量。该方法得到的尿激酶无病毒无热原，且精品的比活能够达到13万单位/mg以上。
文档编号C12N9/72GK103060294SQ20121059801
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者吕金花, 刘翠珍, 葛翠凤, 朱琳 申请人:青岛九龙生物医药有限公司