专利名称：：一种纳豆激酶固体发酵方法
技术领域：
：本发明涉及发酵领域，具体涉及纳豆激酶固体发酵方法的改进。
背景技术：
：脑血管栓塞性疾病是危害人类健康的主要疾病之一。目前临床上使用的大多数溶栓药物，如链激酶(SK)、尿激酶(UK)、重组组织纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶原(pro-UK)等，但它们均在不同程度上存在一定的缺陷，如毒性强、副作用大，在体内半衰期短等，另外它们都是纤溶酶原激活剂型，即需通过激活耙酶纤维蛋白溶酶原(Plasminogen)，使之转变为纤维蛋白溶酶，再与纤维蛋白结合,发挥溶栓作用，而其自身不能直接作用于纤维蛋白。纳豆激酶(Nattokinase,NK)则不然，它来源于食品，无毒副作用，而且对纤维蛋白尤其是交联形式的纤维蛋白十分敏感，可直接将其水解成小肽和氨基酸。研究表明纳豆激酶不仅可以抑制血栓的形成，还可迅速降解纤维蛋白，增加纤维蛋白降解产物(FDP)的量，缩短血浆中的优球蛋白的溶解时间(ELT)，提高优球蛋白的纤溶活性(EFA),并能降低纤溶酶原激活因子抑制剂的活性，从而激活静脉内皮细胞，引起t-PA的继发性增加，同时激活尿激酶原(pro-UK)转变为尿激酶，使内源性纤溶酶量和活性间接增强，具有双重功能。由于纳豆激酶具有目前正在使用的一些溶栓剂所无法比拟的优点，因此，提高纳豆激酶的生产效率和单位产物的酶活具有十分重要的意义。目前，纳豆激酶的生产方法主要是发酵，其中，固体发酵占有十分重要的比例。如中国申请号为00107589.6，名称为"纳豆激酶的生产方法及其用途"的申请中，^Hf了固体发酵方法，其最终产品的得率仅为22.9U/G;中国专利申请号为01131720.5,名称为"纳豆激酶的生产方法"，提供了一种用特制浸泡液浸泡优质黄豆后进行固体发酵的方法，并在发酵过程中采用高低温培养的方法，所得最终产品的得率为690U/G,但其操作过程繁瑣，成本较高。
发明内容本发明的目的是提供一种能提高发酵微生物菌数、单位产物酶活力高、发酵时间短、操作简便的纳豆激酶固体发酵方法。本发明的技术方案为一种纳豆激酶固体发酵方法，包括以下步骤(1)灭菌选取大豆洗净，并浸泡到大豆吸足7jof分，然后将大豆沥干，在121。C下灭菌30min;(2)接种待步骤(1)所得灭菌大豆冷却至4(TC以下，在无菌条件下接种，接种所用菌种为枯草芽孢杆菌；(3)发酵在一定温度和湿度下培养12~24小时，直至每克大豆上活菌数为35~45亿个；(4)干燥干燥发酵后的大豆；采用蒸汽控制所述发酵的温度和湿度，发酵温度控制为42~45°C,发酵湿度控制为100%。较佳地，步骤(3)中每克大豆上的活菌数为38~42亿个。所述干燥温度《55。C，干燥时间为24-30小时。众所周知，传统的固体发酵法产纳豆激酶，采用电控制发酵的温度和湿度，其缺陷在于，无法准确的控制湿度，容易导致培养基干燥，使发酵细菌因干燥而死亡和/或不处于最佳发酵状态，从而降低了发酵的活菌数和细菌的发酵效率，最终使得总发酵效率降低。本发明的意义在于采用蒸汽控制发酵的温度和湿度代替传统的电控制，保证了发酵过程中湿度控制在100%,从而提高了处于发酵状态的活菌数，进而提高了单位发酵酶活，提高了纳豆激酶大规模产业化生产的效率。4下面将通过具体实施例和比较实验对本发明方案做详细的叙述。实施例1选取3000g大豆，清洗干净，室温下浸泡至大豆吸足水份，表面无皱折，沥干水份，装入在高压灭菌锅中，在12rC下灭菌30min;待所得灭菌大豆冷却至4(TC以下，在无菌条件下接种枯草芽孢杆菌，繁殖一段时间后，检测每克大豆上活菌数达到35~45亿个。开始发酵，用蒸汽控制发酵罐内的温度和湿度在如表1中所示的数值，发酵时间，也如表中所示。发酵完成后，在《55。C，干燥间24~30小时。取部分样品测定酶活和活菌数。结果如表1所示。对比实-验选取3000g大豆，清洗干净，室温下浸泡至大豆吸足水份，表面无铍折，沥干水份，装入在高压灭菌锅中，在12rC下灭菌30min;待所得灭菌大豆冷却至4(TC以下，在无菌条件下接种枯草芽孢杆菌，繁殖一段时间后，；险测每克大豆上活菌数达到35~45亿个。开始发酵，用电控制发酵罐内的温度和湿度在如表1中所示的数值，发酵时间，也如表中所示。发酵完成后，在《55X:，干燥间24~30小时。取部分样品测定酶活和活菌数。结果如表1所示。表1电控制发酵温度和湿度与蒸汽控制的单位产物酶活和活菌数比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。权利要求1、一种纳豆激酶固体发酵方法，包括以下步骤(1)灭菌选取大豆洗净，并浸泡到大豆吸足水份，然后将大豆沥干，在121℃下灭菌30min；(2)接种待步骤(1)所得灭菌大豆冷却至40℃以下，在无菌条件下接种，接种所用菌种为枯草芽孢杆菌；(3)发酵在一定温度和湿度下培养12～24小时，直至每克大豆上活菌数为35～45亿个；(4)干燥干燥发酵后的大豆；其特征在于，采用蒸汽控制所述发酵的温度和湿度，发酵温度控制为42～45℃，发酵湿度控制为100％。2、如权利要求1所述的纳豆激酶固体发酵方法，其特征在于步骤(3)中每克大豆上的活菌数为38~42亿个。3、如权利要求1所述的纳豆激酶固体发酵方法，其特征在于，所述干燥温度《55。C，千燥时间为24-30小时。全文摘要本发明提供了一种纳豆激酶固体发酵方法，包括灭菌-接种-发酵-干燥等步骤，在发酵过程中采用蒸汽控制所述发酵的温度和湿度，发酵温度为42～45℃，湿度为100％，提高了处于发酵状态的活菌数，进而提高了单位发酵酶活，提高了纳豆激酶大规模产业化生产的效率。文档编号A61P7/02GK101597600SQ20091004089公开日2009年12月9日申请日期2009年7月7日优先权日2009年7月7日发明者程京燕,苏保荣申请人:程京燕