鉴别Lyn激酶激活剂的方法

专利名称：：鉴别Lyn激酶激活剂的方法
技术领域：
：本发明涉及鉴别Lyn激酶激活剂的方法和与此相关的试剂盒。
背景技术：
：Lyn激酶是非受体酪氨酸蛋白激酶src家族的成员，该家族主要在B淋巴样细胞和髓系细胞中表达。参见例如BriggsSD，LernerEC，Sm他gallTE:AffinityOfSrcFamilyKinaseSH3DomainsForHIVNef/"附raDoesNotPredictKinaseActivationByNef/"KVo.Biochemistry39:489-495(2000),该文献通过引用结合于此。Lyn参与从缺少固有酪氨酸激酶活性的细胞表面受体开始的信号转导。Lyn激酶活性的激活对于由IL-6刺激的CD45+骨髓瘤细胞的增殖是必需的。参见IshikawaH,TsuyamaN,AbrounS,LiuS,LiFJ,TaniguchiO，KawanoMM:RequirementsofsrcfamilykinaseactivityassociatedwithCD45formyelomacellproliferationbyinterleukin-6.Blood99:2172-2178(2002)，该文献通过引用结合于此。Lyn和Fyn与糖蛋白VI的富脯氨酸结构域的缔合调节细胞内信号转导。参见例如Suzuki-InoueK，TulasneD,ShenY,Bori-SanzT，InoueO,JungSM,MoroiM,AndrewsRK,BemdtMC，WatsonSP:AssociationofFynandLynwiththeproline-richdomainofglycoproteinVIregulatesintracellularsignaling.J.Biol,Chem.277:21561-21566(2002)，该文献通过引用结合于此。Lyn/CD22/SHP-1途径在自身免疫中很重要。参见例如BlasioliJ,GoodnowCC:Lyn/CD22/SHP-1andtheirimportanceinautoimmunity.Curr.Dir.Autoimmun.5:151-160(2002)，该文献通过引用结合于此。已表明，肥胖症、高脂血症和糖尿病在各种病症包括例如动脉粥样硬化性心血管疾病(其目前占西方社会死亡率的相当比例)中起到病因性作用。一种称作"X综合征"或"代谢综合征"的人类病症表现为葡萄糖代谢缺陷(例如胰岛素抵抗)、血压升高(即高血压)和血脂失衡(即血脂障碍)。参见例如Reaven，1993，Aev,Me《44:121-131。目前可商购的用于调节Lyn激酶或控制葡萄糖水平升高的药物都不具有调节血液中脂质、脂蛋白、胰岛素和葡萄糖水平的全面功用。因此，十分需要具有一种或多种这样的功用的化合物。而且，十分需要开发更为安全的有效降低血清胆固醇、增加HDL血清水平、预防冠心病和/或治疗现有的疾病如动脉粥样硬化、肥胖症、糖尿病和受葡萄糖代谢和/或葡萄糖水平升高影响的其它疾病的药物。因此，用于鉴别Lyn激酶激活剂的测定方法是非常需要的。发明概述本发明提供鉴别Lyn激酶激活剂的方法，其包括在Lyn激酶的存在下预温育供试化合物；向所述Lyn激酶和供试化合物添加ATP和底物；温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物；以及测定所述底物的磷酸化水平，借此所述底物的磷酸化水平增加指示所述供试化合物为Lyn激酶激活剂。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约5分钟-约120分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约30分钟-约90分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约45分钟-约75分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约60分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物20-40分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下，在约0'C-约3(TC下预温育所述供试化合物。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下，在约0'C-约l(TC下预温育所述供试化合物。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下，在约4'C下预温育所述供试化合物。在一些实施方案中，所述Lyn激酶的浓度为约10ng/ml-约500ng/ml。在一些实施方案中，所述Lyn激酶的浓度为约25ng/ml-约300ng/ml。在一些实施方案中，ATP的浓度为约5pm-约25^M。在一些实施方案中，ATP的浓度为约10pM。在一些实施方案中，所述ATP是放射标记的。在一些实施方案中，所述底物是包含酪氨酸的蛋白质或肽。在一些实10施方案中，所述底物是包含酪氨酸的合成FRET肽。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约5分钟-约90分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约30分钟-约75分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约45分钟-约60分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约60分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在室温下温育约30-50分钟。在一些实施方案中，所述底物的磷酸化水平包括定量或定性测定所述放射标记的底物。在一些实施方案中，测定所述底物的磷酸化水平包括定量或定性测定所述合成FRET肽底物的荧光。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.05%-约0.25%牛血清白蛋白、约0.5mM-约2.5mM二硫苏糖醇、约0.05%-约0.25%牛血清白蛋白和约0.5mM-约2.5mM二硫苏糖醇、或约0.05%-约0.25%p-巯基乙醇的存在下进行。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.05。/。-约0.25。/。P-巯基乙醇的存在下进行。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.1%(3-巯基乙醇的存在下进行。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约5-约120分钟；在Lyn激酶的存在下，在约Ot:-约3(TC下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.05%-约0.25%(3-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约5分钟-约90分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约30-约90分钟；在Lyn激酶的存在下，在约0"C-约l(TC下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.05%-约0.25%P-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约30分钟-约75分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约45-约75分钟；在Lyn激酶的存在下，在约4'C下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.1%P-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约45分钟-约60分钟。ii在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约60分钟；在Lyn激酶的存在下，在约4t:下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.1%(3-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约60分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物为式II的化合物其中R"是垸基；X是卤素；Y是O、S或NH;Z是O或S;n是0-5的整数，并且m是O或l,其中m+n小于或等于5。在一些实施方案中，所述烷基是甲基并且n是l。在一些实施方案中，所述卤素是氯并且m是1。在一些实施方案中，Y是O。在一些实施方案中，Z是O。在一些实施方案中，W是甲基，Y是O，Z是O，n是l，并且m是O。在一些实施方案中，R在间位。在一些实施方案中，X是氯，Y是O，Z是O，n是O，并且m是l。在一些实施方案中，X在间位。在一些实施方案中，所述供试化合物是或<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>本发明还提供包含Lyn激酶、ATP、底物和用于实施本所述的任一种或多种方法的说明书的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含温育室。本发明还包括包含式I的第一化合物或其药学上可接受的盐；和选自「衣卞ZfT列tf、J一々14现少々卞邻一Ui百'"Ki现兴子丄KI接党的盐的多且台物R3R2RiR4I其中R,、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢、烷氧基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳氧基、苄基、环垸基、卤素、杂芳基、杂环垸基、隱CN、-OH、-N02、-CF3、-C02H、《02垸基或-丽2;Rs是垸基或氢；X是O、S、NH或N-烷基；并且Z是O或S。在一些实施方案中，所述第一化合物为式n的化合物II其中W是垸基；X是卤素；Y是O、S或NH;Z是O或S;n是0-5的整数，并且m是O或l，其中m+n小于或等于5。本发明还提供治疗人类糖尿病的方法，其包括向有此需要的人类给药治疗有效量的本文所述的组合物。附图简要说明图1说明化合物102与二甲双胍的协同作用。
发明内容如本文所用的，术语"约"指它所修饰的值的士10%。例如，"约10"13指9-11。如本文所用的，术语"烷氧基"指-O-烷基，其中烷基如本文定义。烷氧基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。在一些实施方案中，垸氧基的垸基链是1-6个碳原子的长度，本文中称作例如"(d-C6)垸氧基"。如本文所用的，术语"烯基"指其中具有一个或多个双键的单价直链或支链烃链。烯基的双键可以不连接或连接另一不饱和基团。适合的烯基包括但不限于(C2-C6)烯基，例如乙烯基、烯丙基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基、2-乙基己烯基、2-丙基-2-丁烯基、4-(2-甲基-3-丁烯)戊烯基。烯基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。如本文所用的，术语"垸基"指饱和的、单价直链或支链烃链。垸基的例子包括但不限于(Q-C6)烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-l-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-l-丁基、3-甲基-l-丁基、2-甲基-3-丁基、2，2-二甲基-1-丙基、2-甲基-l-戊基、3-甲基-l-戊基、4-甲基-l-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2，2-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-l-丁基、2-乙基-l-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基和己基，以及更长的烷基如庚基和辛基。烷基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。如本文所用的，术语"炔基"指其中具有一个或多个三键的单价直链或支链烃链。炔基的三键可以不连接或连接另一不饱和基团。适合的炔基包括但不限于(C2-C6)炔基，例如乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、甲基丙炔基、4-甲基-l-丁炔基、4-丙基-2-戊炔基、和4-丁基-2-己炔基。炔基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。如本文所用的，术语"芳基"指包含碳和氢原子的单环或多环芳香性基团。适合的芳基的例子包括但不限于苯基、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、奧基(azulenyl)和萘基，以及苯并稠合碳环基团，如5,6，7，8-四氢萘基。芳基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。在一些实施方案中，所述芳基是单环，其中所述环包含6个碳原子，本文中称作"(C6)芳基"。如本文所用的，术语"芳氧基"指-O-芳基，其中芳基如本文定义。芳氧基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。在一些实施方案中，芳氧基的芳环是单环，其中所述环包含6个碳原子，本文中称作"(C6)芳氧基"。如本文所用的，术语"苄基"指-CH2-苯基。如本文所用的，术语"羰基"是式-C(O)-的二价基团。如本文所用的，短语"本发明的化合物"整体上指式I和II的化合物及它们药学上可接受的盐。本发明的化合物在本文中通过它们的化学结构和/或化学名来鉴别。当用化学结构和化学名二者来指示化合物，并且化学结构和化学名相冲突时，化学结构起到鉴别化合物的决定性作用。本发明的化合物可以包含一个或多个手性中心和/或双键，因此作为立体异构体存在，例如双键异构体(即几何异构体)、对映异构体或非对映异构体。根据本发明，本文所描绘的化学结构以及因此本发明的化合物，包括所有相应化合物的对映异构体和立体异构体，即，既包括立体异构体纯的形式(例如几何异构体纯、对映异构体纯或非对映异构体纯)，又包括对映异构体和几何异构体混合物。可以通过公知方法，例如手性相气相色谱、手性相高效液相色谱、将化合物结晶为手性盐络合物或使化合物在手性溶剂中结晶，将对映异构体和几何异构体混合物拆分成它们的对映异构体或立体异构体组分。对映异构体和立体异构体也可以通过公知的不对称合成方法，由立体异构体纯或对映异构体纯的中间体、试剂和催化剂来获得。当用于本文所述的鉴别方法中时，本发明的化合物在本文中称作供试化合物(它们也可以在这些方法中用做阳性对照。)如本文所用的，术语"环烷基"指包含碳和氢原子并且不含有碳-碳重键的单环或多环饱和环。环垸基的例子包括但不限于(C3-C7)环垸基(例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基)和饱和的环萜和二环萜。环烷基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。在一些实施方案中，所述环烷基是单环或二环。如本文所用的，术语"糖尿病"和短语"n型糖尿病"可互换使用，包括但不限于非胰岛素依赖型糖尿病、尿崩症，并与胰岛素抵抗(即身体缺少适当地应答胰岛素的能力)有关，而且通常伴有相关并发症，包括例如肥胖症和高胆固醇。素"指氟、氯、溴或碘。相应地，术语"齒代(halo)"和"卤代(Hal)"包括氟代、氯代、溴代和碘代。如本文所用的，术语"杂芳基"指单环或多环芳香性环，所述环包含碳原子、氢原子和一个或多个杂原子(例如1-3个独立地选自氮、氧和硫的杂原子)。杂芳基的例证性例子包括但不限于吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基(pyrazyl)、三嗪基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、(1,2，3)-和(1，2，4)-三唑基、吡嗪基、嘧啶基、四唑基、呋喃基、噻吩基(thienyl)、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、噻吩基(phienyl)、异噁唑基和噁唑基。杂芳基可以是未取代的或者被1或2个适合的取代基取代。在一些实施方案中，杂芳基是单环，其中所述环包含2-5个碳原子和l-3个杂原子，在本文中称作"(QrC5)杂芳基"。如本文所用的，术语"杂环垸基"指单环或多环，所述环包含碳和氢原子和至少1个、或1-3个选自氮、氧和硫的杂原子，并且不含有不饱和。杂环烷基的例子包括但不限于吡咯烷基、吡咯垸基(pyrrolidine^哌啶基、哌啶子基、哌嗪基、哌嗪基(piperazino)、吗啉基、吗啉代、硫代吗啉基、硫代吗啉代(thiomorpholino)和吡喃基。杂环垸基可以是未取代的或者被l或2个适合的取代基取代。在一些实施方案中，所述杂环烷基是单环或二环，其中所述环包含3-6个碳原子和l-3个杂原子，在本文中称作"(C,-C6)杂环烷基"。如本文所用的，术语"杂环基"或"杂环"指杂环烷基或杂芳基。如本文所用的，术语"烃基"指选自任选地被1或2个适合的取代基取代的(CrQ)烷基、(C2-Cs)烯基和(C2-C8)炔基。在一些实施方案中，烃基的烃链是l-6个碳原子的长度，本文中称作"(Q-C6)烃基"。如本文所用的，术语"苯基"指-C6H5。苯基可以是未取代的或者被l或2个适合的取代基取代。如本文所用的，短语"前驱糖尿病"指糖尿病症状，其中患者表现为葡萄糖水平升高，但与II型糖尿病相关的病症本身的完全发作还未表现出来。如本文所用的，短语"适合的取代基"指不会使本发明的化合物或用于制备它们的中间体的的合成或药用功用无效的基团。适合的取代基的例子包括但不限于(C广C8)烷基；(d-Cs)烯基；(d-Cs)炔基；(C6)芳基；(CrC5)杂芳基；(C3-C7)环烷基；(C广C8)烷氧基；(<36)芳氧基；-CN;-OH;氧代；卤代、-N02、C02H;-NH2;"NH((d-Q)垸基)；-]^(((:1-€:8)垸基)2;-NH((C6)芳基)；画N((C6)芳基)2;-CHO;-CO((d-Cs)垸基)；-CO((C6)芳基)；-C02((CrC8)烷基)；和-C02((C6)芳基)。本领域的技术人员可以根据本发明化合物的稳定性以及药用和合成活性，容易地选择适合的取代基。如本文所用的并且除非另有说明，短语本发明组合物的"治疗有效量"是通过本发明化合物的治疗效力来测量的，其中病症的至少一种有害作用被改善或缓解。在一个实施方案中，短语本发明组合物的"治疗有效量"是通过本发明化合物改变Lyn激酶的表达和/或活性(包括但不限于上调和下调该蛋白质)的治疗效力来测量的。令人惊奇的是，本发明人发现治疗有效量的本发明化合物上调Lyn激酶的表达和/或活性。当用于本文所述的方法中时，所述化合物或其药学上可接受的盐以分离的形式、纯化的形式、或作为化合物的混合物使用。如本文所用的，"分离的"指将所述化合物通过常规技术从天然来源(例如植物或细胞，优选细菌培养物)或合成的有机化学反应混合物中分离。如本文所用的，"纯化的"指当被分离时，分离物包含占所述分离物重量至少90%、至少95%、至少98°/。或至少99%的化合物。如本文所用的，短语"药学上可接受的盐"包括但不限于可在用于本发明的方法中的化合物中存在的酸性或碱性基团的盐。包括在本发明的方法中的碱性化合物能够与多种无机酸和有机酸形成很多种盐。可以用于制备所述碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸，是形成无毒的酸加成盐，即包含药理学上可接受的阴离子的盐的酸，所述盐包括但不限于硫酸盐、拧檬酸盐、马来酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐(glucaronate)、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(即1,1'-亚甲基-二(2-羟基-3-萘甲酸盐))。包括在本发明方法中的包含氨基部分的化合物，可以与多种氨基酸(除上述的酸之外)形成药学上可接受的盐。包括在本发明方法中的酸性化合物能够与多种药理学上可接受的阳离子形成碱盐。这样的盐的例子包括碱金属或碱土金属盐，具体是钙、镁、钠、锂、锌、钾和铁盐。本发明提供鉴别Lyn激酶激活剂的方法，其包括在Lyn激酶的存在下预温育供试化合物；向所述Lyn激酶和供试化合物添加ATP和底物；温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物；以及测定所述底物的磷酸化水平，借此所述底物的磷酸化水平增加指示所述供试化合物为Lyn激酶激活剂。所述供试化合物可以是本领域的技术人员期望的任意化合物，包括本文所述的任意化合物。所述供试化合物的浓度可以是期望的任意浓度，一般包括要被试验的浓度范围。所述Lyn激酶可以从例如Invitrogen或Millipore商购获得，或者可以由本领域的技术人员从期望的细胞中分离。在一些实施方案中，所述Lyn激酶的浓度为约10ng/ml-约500ng/ml。在一些实施方案中，所述Lyn激酶的浓度为约25ng/ml-约300ng/ml。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约5分钟-约120分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约30分钟-约卯分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约45分钟-约75分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约60分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物20-40分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下，在约0匸-约3(TC下预温育所述供试化合物。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下，在约0X:-约l(TC下预温育所述供试化合物。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下，在约4'C下预温育所述供试化合物。未标记或放射标记形式的ATP可以从多个制造商处商购获得。在一些实施方案中，ATP的浓度为约5^M-约25iJVt。在一些实施方案中，ATP的浓度为约10pM。在一些实施方案中，所述底物是包含酪氨酸的蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述底物是包含酪氨酸的合成FRET肽。大量的包含酪氨酸的FRET肽可商购获得。蛋白质或肽的一个例子是聚(Glu,Tyr)，并且可以约0.05mg/ml-约0.25mg/ml的浓度使用。在一些实施方案中，所述底物的浓度为约0.1mg/ml。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约5分钟-约90分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约30分钟-约75分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约45分钟-约60分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约60分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在室温下温育约30-50分钟。在一些实施方案中，所述底物的磷酸化水平包括定量或定性测定所述放射标记的底物。因此，在不实际测量磷酸化的量的情况下，也可以观察所述底物磷酸化的增加。或者，也可以通过本领域的技术人员己知的标准技术来测定磷酸化的量。在一些实施方案中，测定所述底物的磷酸化水平包括定量或定性测定所述合成FRET肽底物的荧光。FRET肽发射的荧光的测量是技术人员公知的。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.05%-约0.25%牛血清白蛋白、约0.5mM-约2.5mM二硫苏糖醇、约0.05%-约0.25%牛血清白蛋白和约0.5mM-约2.5mM二硫苏糖醇、或约0.05%-约0.25%p-巯基乙醇的存在下进行。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.05%-约0.25%(3-巯基乙醇的存在下进行。在一些实施方案中，所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.1。/。P-巯基乙醇的存在下进行。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约5-约120分钟；在Lyn激酶的存在下，在约O'C-约3(TC下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.05%-约0.25%p-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约5分钟-约90分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约30-约卯分钟；在Lyn激酶的存在下，在约O'C-约l(TC下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.05%-约0.25%(3-巯基乙醇的在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约30分钟-约75分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约45-约75分钟；在Lyn激酶的存在下，在约4"C下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.1%P-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约45分钟-约60分钟。在一些实施方案中，在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约60分钟；在Lyn激酶的存在下，在约4"C下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.1%P-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约60分钟。在一些实施方案中，所述供试化合物为式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>其中W是垸基；X是卤素；Y是O、S或NH;Z是O或S;n是0-5的整数，并且m是O或l，其中m+n小于或等于5。在一些实施方案中，所述垸基是甲基并且n是1。在一些实施方案中，所述卤素是氯并且m是1。在一些实施方案中，Y是O。在一些实施方案中，Z是O。在一些实施方案中，R'是甲基，Y是O，Z是O，n是l，并且m是O。在一些实施方案中，W在间位。在一些实施方案中，X是氯，Y是O，Z是O，n是O，并且m是l。在一些实施方案中，X在间位。在一些实施方案中，所述供试化合物是ci<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>本发明还提供包含Lyn激酶、ATP、底物和用于实施本文所述的任一种或多种方法的说明书的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含温育室。温育室，例如微量滴定板、微量离心管等，是本领域的技术人员公知的。本发明还包括包含式I的第一化合物或其药学上可接受的盐；和选自表I中所列化合物的一种或多种第二化合物或其药学上可接受的盐的组合物R3R2RiR4I其中Ri、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢、垸氧基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳氧基、苄基、环垸基、卤素、杂芳基、杂环垸基、-CN、-OH、-N02、-CF3、-C02H、《02烷基或-丽2;Rs是烷基或氢；X是O、S、NH或N-烷基；并且Z是O或S。在一些实施方案中，Rs是垸基，例如甲基。在一些实施方案中，Rs是H。在一些实施方案中，X是O。在一些实施方案中，z是o。在一些实施方案中，R2-R6中至少一个是烷基，例如甲基。在一些实施方案中，R2-R6中至少一个是卤素，例如氯。在一些实施方案中，R2-R6中至少一个是-CN。在一些实施方案中，RrR6中至少一个是-OH。在一些实施方案中，R2-R6中至少一个是-N02。在一些实施方案中，R2-R^中至少一个是-CF3。在一些实施方案中，R2-R6中至少一个是-C02H。在一些实施方案中，R2-R6中至少一个是-NH2。在一些实施方案中，R2-R6中至少一个是-垸氧基。在一些实施方案中，R2是烷基，例如甲基，并且^和R3-R8各自是氢，x和z是o。在一些实施方案中，R2是卤素，例如氯，并且I^和R3-R8各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，R3是垸基，例如甲基，并且&、R2和R4-Rg各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，R3是卤素，例如氯，并且R,、R2和R4-R8各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，R4是垸基，例如甲基，并且RrR3和Rs-R8各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，R4是卤素，例如氯，并且RrR3和Rs-R8各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，Rs是-CF3，并且RrR4和R6-Rs各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，Rs是-NH2，并且RrR4和R6-R8各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，R6是-CF3，并且R广R5和R7-Rs各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，R6是-NH2，并且Ri-Rs和RrR8各自是氢，X和Z是O。在一些实施方案中，所述第一化合物为式n的化合物II其中R1是烷基；X是卤素；Y是O、S或NH;Z是O或S;并且n是0-5的整数，并且m是O或l，其中m+n小于或等于5。用于本文所述的组合物和方法的化合物的例示性实例包括但不限于:105<formula>formulaseeoriginaldocumentpage24</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>所述化合物可以通过本领域普通技术人员已知的有机化学技术，例如美国专利3922345所述来合成，该专利以其全部通过引用结合于此。本发明还提供治疗人类糖尿病的方法，其包括向有此需要的人类给药治疗有效量的本文所述的组合物。在本发明的一些实施方案中，本发明的化合物可以与至少一种其他治疗药一起用于联合治疗。本发明的化合物和所述治疗药可以相加作用或协同作用。在一个实施方案中，包含本发明化合物的组合物在给药另一治疗药的同时进行给药，所述治疗药可以与所述本发明化合物一样是同一组合物的部分，或者是另一组合物的部分。在另一个实施方案中，包含本发明化合物的组合物在给药另一治疗药之前或之后进行给药。在一个实施方案中，例如为了使与特定药物相关的毒性最小化，联合治疗包括在给药包含本发明化合物的组合物和包含另一治疗药的组合物之间交替进行。给药各药物或治疗药的持续时间可以是例如l个月、3个月、6个月或1年。在一些实施方案中，当本发明的组合物与另一可能会产生有害副作用(包括但不限于毒性)的治疗药同时给药时，所述治疗药可以有利地以低于引起所述副作用的阈值的量给药。在一个实施方案中，"治疗(treatment)"或"治疗(treating)"指改善糖尿病或其至少一种可见症状。在另一个实施方案中，"治疗(treatment)"或"治疗(treating)"指改善至少一种可测量的身体参数，但不一定为患者所察觉。在又一实施方案中，"治疗(treatment)"或"治疗(treating)"指从身体上(例如可见症状的稳定)、生理上(例如身体参数的稳定)或这两方面抑制糖尿病的进展。在又一实施方案中，"治疗(treatment)"或"治疗(treating)"指延缓糖尿病的发作。在一些实施方案中，本发明的组合物作为对抗糖尿病的预防性措施给药于患者、优选人类。如本文所用的，"预防(prevention)"或"预防(preventing)"指降低罹患糖尿病的风险。在一个实施方案中，本发明的组合物作为预防性措施给药于对糖尿病具有遗传倾向的患者、优选人类。在另一个实施方案中，本发明的组合物作为预防性措施给药于对糖尿病具有非遗传倾向的个体。如本文所用的，"治疗或预防糖尿病"包括治疗或预防与II型糖尿病有关的并发症，包括但不限于视网膜病变(即失明)；导致足溃疡、坏疽和截肢术的神经病变(即神经损害)；导致透析的肾损害；和心血管疾病。在一些实施方案中，所述II型糖尿病与Lyn激酶活性和/或表达异常/改变有关。因此，包含本发明化合物的组合物可用于治疗或预防II型糖尿病或由II型糖尿病引起的并发症以及与代谢综合征有关的病症和风险因素。II型糖尿病并发症包括但不限于糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变、勃起功能障碍和肾疾病，本发明的化合物可用于治疗或预防这些并发症。本发明提供治疗和预防的方法，其通过向患者给药治疗有效量的包含本发明化合物的组合物。所述患者是哺乳动物，包括但不限于动物(如牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠等)，更优选人类。本发明的包含一种或多种本发明化合物的组合物可以口服给药。本发明的化合物也可以经其它的任何方便的途径给药，例如通过输液或推注、经上皮层或粘膜层(例如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等)吸收，并且可以与另一种生物活性剂一起给药。给药可以是全身的或局部的。各种递药系统是已知的，例如脂质体包囊、微粒、微胶囊、胶囊等，并且可以用于给药本发明的化合物。在一些实施方案中，向患者给药多于一种本发明的化合物。给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、大脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入、或局部(特别是向耳、鼻、眼或皮肤)。给药方式由医师自由决定，并且部分取决于医学病症的部位。大多数情况下，给药会引起本发明的化合物释放进入血流中。在一些实施方案中，向需要治疗的区域局部给药一种或多种本发明的化合物可能是期望的。这可以通过以下方法实现例如但不限于，通过在手术过程中局部输注、局部施用(例如手术后与创伤辅料结合)、通过注射、通过导管、通过栓剂、通过植入物，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜例如硅橡胶膜、或纤维。在一个实施方案中，可以通过直接在动脉粥样硬化斑块组织的部位(或以前的部位)注射来给药。也可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或雾化器和含有雾化剂的制剂，或者通过在碳氟化合物或合成肺表面活性物质中灌流。在一些实施方案中，本发明的化合物可以与常规的粘合剂和媒介物(vehicle)如甘油三酯一起配制成栓剂。在另一个实施方案中，本发明的化合物可以在囊泡、特别是脂质体中递送(参见Langer，1990,Sc/e"ce249:1527-1533;Treat等，于LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer中，Lopez-Berestein禾口Fidler(著者)，Liss，NewYork,pp.353-365(1989);Lopez-Berestein,同上pp.317-327;—般参见同上)。在又一实施方案中，本发明的化合物可以在控释系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer,上述；Sefton，1987,CACCnY.14:201;Buchwald等，1980，Swgeo;88:507Saudek等，1989,W五"g/.■/Me《321:574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer禾口Wise(著者)，CRCPres.,BocaRaton,Fla.(1974);ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball(著者)，Wiley,NewYork(1984);Ranger和Peppas,1983,Afacromo/.5"c/.iev.Miacromo/.CTzem.23:61;还参见Levy等，1985,Sc/e"ce228:190;During等，1989,A^wra/.25:351;Howard等，1989,J"wwrg.71:105)。在又一实施方案中，控释系统可以置于本发明化合物的靶点(如肝)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson，于MedicalApplicationsofControlledRelease中,上述,vol.2,pp,115-138(1984))。也可以使用Langer,1990,5We"ce249:1527-1533)的综述中讨论的其它控释系统。本发明的组合物包含治疗有效量的、适当地以纯的形式的本发明化合物、任选地多于一种本发明化合物，和适当量的药学上可接受的媒介物，以向患者提供用于恰当给药的形式。在一些实施方案中，短语"药学上可接受的"指经联邦或州政府的管理机构批准或者列于美国药典或其它一般公认的药典中，供用于动物、更具体地用于人类。术语"媒介物"指与本发明的化合物一起给药的稀释剂、辅剂、赋形剂或载体。所述药用媒介物可以是液体，例如水和油，包括来源于石油、动物、植物或合成的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。所述药用媒介物可以是盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、脲等。此外，可以使用辅剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。当给药于患者时，本发明的化合物和药学上可接受的媒介物优选是无菌的。当本发明的化合物经静脉内给药时，水是适合的媒介物。也可以使用盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液作为液体媒介物，特别是用于可注射溶液。适合的药用媒介物还包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，本发明的化合物还可以包含少量润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂。本发明的组合物可以采取溶液剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、小丸、胶囊剂、包含液体的胶囊剂、散剂、缓释制剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、混悬剂、或任何其它适于使用的形式。在一个实施方案中，所述药学上可接受的媒介物是胶囊(参见例如美国专利5698155)。适合的药用媒介物的其它例子在Remington'sPharmaceuticalSciences,A.R.Gennaro(著者)MackPublishingCo中有描述。在一个实施方案中，根据常规方法将本发明的化合物配制成适于向人类静脉给药的药物组合物。一般地，用于静脉给药的本发明的化合物是无菌等渗缓冲水溶液形式的溶液剂。必要时，所述组合物还可以包含增溶剂。用于静脉给药的组合物可以任选地包含局麻药例如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，所述成分单独或在单位剂型中混合在一起提供，例如，作为在密封容器(如指示活性成分量的安瓿或Sachette)中的冻干粉或无水浓缩剂。当通过输液给药本发明的化合物时，可以将它例如用包含无菌药用级水或盐水的输液瓶进行分配。当通过注射给药本发明的化合物时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在给药前混合所述成分。本发明的组合物可以口服给药。供口服递送的组合物可以是例如片剂、锭剂、水性或油性混悬剂、颗粒剂、散剂、乳剂、胶囊、糖浆或酏剂的形式。口服给药的组合物可以包含一种或多种任选地药剂，例如甜味剂，如果糖、阿司帕坦或糖精；调味剂，如薄荷油、冬青油或樱桃油；着色剂；和防腐剂，以提供药学上可口的制剂。而且，当以片剂或丸剂形式时，所述组合物可以包衣，以延缓在胃肠道中的崩解和吸收，由此在延长的时间段内提供持久作用。包围渗透活性驱动化合物()的选择性渗透膜也适用于本发明的口服给药的化合物。在这些近期的平台中，来自包围胶囊的环境中的液体被所述驱动化合物吸收，所述化合物膨胀使药剂或药剂组合物通过孔隙离开原位。这些递送平台可以提供基本上为零级的释放曲线，与速释制剂的峰形曲线相反。也可以使用时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。口服组合物可以包含标准媒介物，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些媒介物适当地是药用级的。本发明化合物有效治疗本文所述的特定障碍或病症的量取决于所述障碍或病症的性质，并且可以通过标准临床技术确定。此外，可以任选地使用体外或体内测定，以帮助鉴定最佳剂量范围。要用于组合物中的准确剂量还会取决于给药途径和疾病或病症的严重性，并且应根据医师的判断和每个患者的情况来决定。然而，适合的口服给药的剂量范围一般是每千克体重约0.001毫克-200毫克本发明化合物。在一些实施方案中，所述口服剂量是每千克体重0.01毫克-70毫克、或每千克体重0.1毫克-50毫克、或每千克体重0.5毫克-20毫克、或每千克体重1毫克-10毫克。在一些实施方案中，所述口服剂量是每千克体重5毫克本发明化合物。本文所述的剂量指总给药量；即，如果给药多于一种本发明的化合物，所述剂量相当于给药的这些本发明化合物的总量。口服组合物优选包含10%-95%活性成分(以重量计)。适合的静脉(i.v.)给药的剂量范围是每千克体重O.Ol毫克-100毫克、每千克体重0.1毫克-35毫克和每千克体重1毫克-10毫克。适合的鼻内给药的剂量范围一般是约0.01pg/kg体重-1mg/kg体重。栓剂一般包含每千克体重0.01毫克-50毫克本发明化合物，并包含0.5%-10%活性成分(以重量计)。皮内、肌内、腹膜内、皮下、硬膜外、舌下、大脑内、阴道内、透皮给药或吸入给药的推荐剂量是每千克体重0.001毫克-200毫克。本发明化合物局部给药的适合剂量是0.001毫克-1毫克，取决于施用所述化合物的面积。可以由得自体外或动物模型试验系统的剂量反应曲线推知有效剂量。所述动物模型和系统是本领域公知的。下表描述了II型糖尿病的药物靶点，和针对所述靶点的代表性药物(批准使用的)、开发阶段的药物、或临床前化合物，它们中的任一种或多种可与任一种或多种本发明的化合物联用。表I药物或化合物名称CAS号机理859721-77-0ll-P-羟基类固醇脱氢酶I型抑制剂LG-101506331248-11-4ABCA1表达增强剂类视黄醇RXR调节剂232252-56-1A2B腺苷桔抗剂阿卡波糖056180-94-0a-糖苷酶抑制剂A-769662844499-71-4AMP激活的蛋白激酶(AMPK)激活剂NVP-DPP-728,西他列汀(sitagliptin)207556-62-5DPP-IV抑制剂MB-05032261365-11-1果糖-l,6-二磷酸酶抑制剂30<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>811811-95-7三酰基甘油脂酶抑制剂二甲双胍001115-70-4未知DecbSM148565-56-4未知丽C-57-0511未知本发明还涉及本文所述的组合物用于治疗糖尿病的用途。本发明还涉及本文所述的化合物和/或组合物在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。为了可以更有效地理解本文所公开的发明，提供以下实施例。应理解为，这些实施例仅是为了说明，而不应解释为以任何方式限制本发明。实施例实施例l:Lyn激酶选择性进行激酶筛选，其中筛选化合物102(10pM)对49种激酶的抑制或激活作用。任何被激活或抑制达至少20°/。的激酶都被认为是显著效果。49种筛选的激酶中，Lyn激酶被激活达5P/。。在重复实验中，Lyn激酶活性增加57%。其它的受试激酶中，胰岛素样生长因子受体活性被抑制达20.1%，p70S6K被抑制达24.3%。_激酶化合物102的活性(%激酶活性)AMPK-0.95Abl-4.04Aktl1.51Akt2-6,83AurA-12.21BTK10CDK2/细胞周期蛋白A-3.93CHK10.87CHK2-6.17<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例2:Lyn激酶激活最优化和ATP动力学鉴别Lyn激酶激活后，重复研究，以使化合物102介导的Lyn激酶激活的条件最优化。进行以下研究1)最优化预温育条件，以使化合物102介导的Lyn激活最大化；和2)进行试验，以测定介导化合物102激活Lyn的酶动力学。着佳游7#蕴,条伴在实验中，激酶Lyn(h)用DMSO、或1、3、10、30和100pM化合物102在冰上预温育30分钟。然后，将激酶稀释至提供线性动力学的浓度，并于室温下，在标准放射测定中在10)aMATP下测定激酶。在该实验中，Lyn激酶(h)的活性随化合物102的浓度以剂量依赖性的方式增加。在IOOpM的化合物102下，Lyn激酶(h)的活性比在DMSO对照中测得的活性大3倍多。化合物102激活Lyn激酶的EC50为650nM。,动力翔究使用以上确定的预温育和实验条件设计动力学研究。在该研究中，化合物102的浓度保持恒定在100pM，ATP浓度由0nM逐步增加到800)iM。使用非线性回归分析和以下方程计算ATP的动力学参数Y=Vmax(x)/(Km+x)。Vmax=酶的活性，Km=1/2最大活性所需的ATP浓度。在这些条件下，化合物102使Lyn激酶Vmax增加了3倍，但未改变ATP的Km。因此，表现为化合物102以非ATP依赖性的方式增加Lyn激酶。实施例3:Lyn激活的筛选现在，使用在实施例2中所述的最优化测定中确定的条件，建立Lyn激酶激活高通量筛选。使用该测定来鉴别新的Lyn激酶激活剂。在此列出这些条件1)在Lyn激酶存在下，在4°C预温育供试化合物30分钟；2)通过加入ATP和底物来启动测定；3)在室温下温育约40分钟；和4)测量所述底物的磷酸化水平。实施例4:体内激酶激活使用8周龄的CD1雄性小鼠进行这些研究。以自由饮食饲养小鼠，并保持12小时明/暗循环。小鼠禁食18小时，测量基线血糖。基线葡萄糖水平60分钟后，向小鼠给药安慰剂、30或100mg/kg化合物。给药75分钟后，剖出肝。使用珠磨式组织研磨器(bead-beater)和1.0mm玻璃珠在0.75ml溶胞缓冲液(50mMTris-HCl，1%NP-40,0.25%脱氧胆酸钠，150mMNaCl，1mMEDTA,ImMPMSF,1吗/ml抑肽酶，1jig/ml亮肽酶素，1mMNa3V04,1mMNaF,10。/。甘油，pH7.4沖将肝匀浆。将组织匀浆离心，上清液进行磷-IRS-l水平的试验(见下)。使用单克隆磷酸酪氨酸抗体和琼脂糖蛋白A将磷酸酪氨酸标记的蛋白质免疫沉淀。使用PAGE电泳系统(Invitrogen;NuPage系统)分离免疫沉淀的蛋白质。将蛋白质转移至PVDF膜。使用pan-IRS-1兔多克隆抗体、二抗-HRP化学发光(Upstate)，在PVDF膜上检测磷酸化的IRS-1。实施例5:Lyn激酶激活测定最优化进行以下实施例，以进一步优化检测化合物102介导的Lyn激酶激活的测定条件。下述测定利用Z'-LYTETMKinaseAssayKit-TyrPeptide(Invitrogen,Carlsbad,CA)。最初开发这些测定系统用于检测各种酪氨酸激35200880012768.3酶抑制剂。添加到该系统的修改优化了检测Lyn激酶激活剂的条件。具体地，本文描述了最佳的Lyn激酶蛋白浓度、缓冲液组分和检测化合物102介导的Lyn激酶激活的测定条件。所用的测定系统是非放射测定，其使用Z'-LYTEKinaseAssayKit-TyrPeptide-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)用于检测Lyn激酶活性。如下所述地改变缓冲液组分。在这些研究中使用的Lyn激酶蛋白是未磷酸化形式的蛋白质。该未磷酸化的Lyn蛋白的浓度范围是25ng/mL-300ng/mL。预温育步骤的长度为30分钟-60分钟。Invitrogen反应缓冲液用于所有研究。向该反应缓冲液中进行如下添加并分别试验，且与单独的反应缓冲液比较。修改l:具有0.1。/。BSA的反应缓冲液；修改2:具有lmM二硫苏糖醇的反应缓冲液；修改3:具有0，01%BSA、1mM二硫苏糖醇的反应缓冲液；和修改4:具有0.1%J3-巯基乙醇的反应缓冲液。表II描述了不同缓冲组分条件下的不同激活水平。表II:化合物102介导的Lyn激酶激活缓冲液DMSO(对照)；%底物磷酸化化合物102(30|iM);°/。底物磷酸化激活倍数反应缓冲液10.416.21.6修改130.833.61.1修改267.180.91.2修改351.783.41.6修改413.733.32.4缓冲液修改4产生了最佳的Lyn激酶激活条件。向反应缓冲液添加0.1%|3-巯基乙醇(修改4)产生低的基线水平(13.7%底物磷酸化)，添加化合物102产生2.4倍Lyn激酶激活。修改4缓冲液比修改1、2和3产生明显更好的激活。这些研究描述了用于检测化合物102介导的Lyn激酶激活的最佳的、—致的条件。这些最佳条件如下1)使用Z'-LYTETMKinaseAssayKit-TyrPeptide-2(Invitrogen，Carlsbad,CA);2)使用浓度范围为25ng/mL-300ng/mL的未磷酸化的Lyn激酶蛋白；3)补充了0.1%P-巯基乙醇的来自Irwitrogen的标准反应缓冲液；和4)在不存在ATP的情况下，预温育步骤的长度为30-60分钟。实施例6:联合疗法根据初步的数据，化合物102可与现有II型糖尿病药联合用于治疗。单独地和以无效剂量联合治疗动物。单独时，药物在口服葡萄糖糖耐量试验中未影响血糖水平。联合时，药物显著降低血糖水平。此外，在db/db小鼠中进行的研究包括化合物102与磺酰脲(格列本脲)联合以及化合物102与罗格列酮联合。CD1雄性小鼠禁食18小时。禁食后，用指定剂量的药物(见下表)治疗动物。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>化合物与二甲双胍的协同作用示于图1。除了本文所述的那些，通过上述描述，本发明的各种修改对本领域的技术人员来说是明显的。这些修改也落入所附的权利要求的范围内。本申请引用的各参考文献(包括但不限于期刊论文、美国和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布等)以其全部通过引用结合于此。2007年2月20日提交的美国申请号60/890632以其全部通过引用结合于此。权利要求1.鉴别Lyn激酶激活剂的方法，其包括在Lyn激酶的存在下预温育供试化合物；向所述Lyn激酶和供试化合物添加ATP和底物；温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物；以及测定所述底物的磷酸化水平，借此所述底物的磷酸化水平增加指示所述供试化合物为Lyn激酶激活剂。2.权利要求1的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约5分钟-约120分钟。3.权利要求1的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约30分钟-约90分钟。4.权利要求1的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约45分钟-约75分钟。5.权利要求1的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约60分钟。6.权利要求1-5中任一项的方法，r-约3(TC下预温育所述供试化合物。7.权利要求1-5中任一项的方法，'C-约l(TC下预温育所述供试化合物。8.权利要求1-5中任一项的方法，°C下预温育所述供试化合物。其中在Lyn激酶的存在下，在约0其中在Lyn激酶的存在下，在约0其中在Lyn激酶的存在下，在约49.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述Lyn激酶的浓度为约10ng/ml-约500ng/ml。10.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述Lyn激酶的浓度为约25ng/ml-约300ng/ml。11.权利要求1-10中任一项的方法，其中ATP的浓度为约5,-约25pM。12.权利要求1-10中任一项的方法，其中ATP的浓度为约10nM。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述ATP是放射标记的。14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述底物是包含酪氨酸的蛋白质或肽。15.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述底物是包含酪氨酸的合成FRET肽。16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约5分钟-约90分钟。17.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约30分钟-约75分钟。18.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约45分钟-约60分钟。19.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物在约室温下温育约60分钟。20.权利要求1-19中任一项的方法，其中测定所述底物的磷酸化水平包括定量或定性测定所述放射标记的底物。21.权利要求1-19中任一项的方法，其中测定所述底物的磷酸化水平包括定量或定性测定所述合成FRET肽底物的荧光。22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.05%-约0.25%牛血清白蛋白、约0.5mM-约2.5mM二硫苏糖醇、约0.05%-约0.25。/。牛血清白蛋白和约0.5mM-约2.5mM二硫苏糖醇、或约0.05°/。-约0.25%(3-巯基乙醇的存在下进行。23.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.05%-约0.25%P-巯基乙醇的存在下进行。24.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物的温育在约0.1%(3-巯基乙醇的存在下进行。25.权利要求1的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约5分钟-约120分钟；在Lyn激酶的存在下，在约0"C-约3(TC下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.05%-约0.25%(3-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约5分钟-约90分钟。26.权利要求l的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约30分钟-约90分钟；在Lyn激酶的存在下，在约0'C-约10'C下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.05%-约0.25%P-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约30分钟-约75分钟。27.权利要求l的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约45分钟-约75分钟；在Lyn激酶的存在下，在约4'C下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.1%P-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约45分钟-约60分钟。28.权利要求l的方法，其中在Lyn激酶的存在下预温育所述供试化合物约60分钟；在Lyn激酶的存在下，在约4。C下预温育所述供试化合物；并且在约室温下，在约0.1%|3-巯基乙醇的存在下温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物约60分钟。29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述供试化合物是式II的化合物II其中R1是垸基；X是卤素；Y是O、S或NH;Z是O或S;n是0-5的整数，并且m是O或l，其中m+n小于或等于5。30.权利要求29的方法，其中所述烷基是甲基并且n是l。31.权利要求29的方法，其中所述卤素是氯并且m是l。32.权利要求29的方法，其中Y是O。33.权利要求29的方法，其中Z是O。34.权利要求29的方法，其中R'是甲基，Y是O，Z是O，n是l，并且m是0。35.权利要求34的方法，其中R'在间位。36.权利要求29的方法，其中X是氯，Y是O，Z是O，n是0，并且m是1。37.权利要求36的方法，其中X在间位。38.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述供试化合物是39.试剂盒，其包含Lyn激酶、ATP、底物和用于实施权利要求1-28中任一项的方法的说明书。40.权利要求39的试剂盒，其还包含温育室。41.组合物，其包含式II的第一化合物或其药学上可接受的盐；和选自表I中所列化合物的一种或多种第二化合物或其药学上可接受的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R,、R2、R3、R4、R5、R6和R7各自独立地是氢、垸氧基、烷基、烯基、炔基、芳基、芳氧基、苄基、环垸基、卤素、杂芳基、杂环烷基、-CN、-OH、-N02、-CF3、-C02H、-(:02烷基或-,2;Rs是垸基或氢；X是O、S、NH或N-烷基；并且Z是O或S。42.权利要求41的组合物，其中所述第一化合物为式II的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中Ri是院基5X是卤素；Y是O、S或NH;Z是O或S;并且n是0-5的整数，并且m是0或l，其中m+n小于或等于5。43.治疗人类糖尿病的方法，其包括向有此需要的人类给药治疗有效量的权利要求41或权利要求42的组合物。全文摘要本发明涉及如下鉴别Lyn激酶激活剂的方法在Lyn激酶的存在下预温育供试化合物；向所述Lyn激酶和供试化合物添加ATP和底物；温育所述供试化合物、Lyn激酶、ATP和底物；以及测定所述底物的磷酸化水平，借此所述底物的磷酸化水平增加指示所述供试化合物为Lyn激酶激活剂。文档编号C12Q1/42GK101686686SQ200880012768公开日2010年3月31日申请日期2008年2月20日优先权日2007年2月20日发明者A·雷奥姆,M·萨波里托申请人:梅里奥尔医药I公司