一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种强启动子及其在提高纳豆激酶表达的应用，属于微生物基因工程 领域。
【背景技术】
[0002] 屯、脑血管疾病严重的威胁着人类的身体健康，而目前临床注射的抗血栓药物普遍 存在稳定性差、药效短、副作用大和成本高等缺点。自1987年，日本学者Sumi等首次从纳豆 中分离纯化得到具有高效溶血栓功效的纳豆激酶，它便成为了近年溶血栓药物研究新方向 之一。纳豆激酶(Nattokinase，NK)是一种由纳豆菌或纳豆枯草杆菌产生的碱性丝氨酸蛋白 酶，因具有特殊的溶血栓活性，既能预防也能治疗血栓疾病。与其它溶栓药物相比，它具有 安全性能好、无免疫原性、易被人体消化吸收、可静脉注射也可W 口服、半衰期长、生产价格 低廉等优点。但因纳豆激酶野生菌的产酶量低，严重限制了其发展，因此提高纳豆激酶的产 酶量具有很好的研究价值。
[0003] 枯草芽抱杆菌作为传统的工业生产菌，因其遗传和生理生化背景清晰，培养简单 快速，蛋白质分泌能力高、非致病性及良好的发酵生产基础，被广泛应用于工、农、医药等多 领域。本发明中选择使用的宿主菌是胞外蛋白酶活性较低的枯草芽抱杆菌WB800。
[0004] 外源蛋白在枯草芽抱杆菌中的高效表达是实现其在工业应用上的重要途径。目 前，国内外研究学者大多通过菌株筛选、生产工艺条件优化，W及利用基因工程手段构建高 效表达载体等方法来提高纳豆激酶产量。2014年，Suwanmanon等通过单因素和正交实验确 定了枯草芽抱杆菌的最佳发酵培养基和发酵工艺条件，纳豆激酶表达量达到130.96即/mL; 黄磊等通过构建基因工程菌的方法成功实现了纳豆激酶在枯草芽抱杆菌中的表达(60U/ mU;本课题组也已通过信号肤筛选构建了重组纳豆激酶的高效分泌表达质粒，表达量达到 190mg/L。然而目前纳豆激酶的产量仍不足W满足生产需求。
[0005] 基因表达体系是一个复杂的过程，启动子是基因表达调控的重要顺式调控元件， 也是基因工程表达载体的重要元件，选用强启动子可W使克隆基因高水平表达。
[0006] 如何设计得到强启动子是目前亟需解决的问题，无论是在理论研究还是实际生产 中都有十分重要的意义。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述问题，本发明通过对强启动子时43和/或启动子PHpall进行η次重复串 联(η >l)，w期提高启动子活力，实现外源蛋白的高效表达。本发明的目的是提供一种强启 动子W及利用该强启动子在枯草芽抱杆菌WB800中高效表达重组纳豆激酶的方法。鉴于启 动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平有较大的影响，本发明W强启 动子PP43和PHpan基因序列为基础，采用对启动子PP43和/或扣pall进行串联η次串联的方式得 到一类新的启动子，提高RNA聚合酶与启动子结合的频率，进而提高启动子活力。本发明的 新的启动子有效地提高了异源蛋白在枯草芽抱杆菌中的表达量。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种新的强启动子，是将启动子时43和/或启动子扣pall 进行η次串联(η > 1)。
[0009] 本发明中，如无特殊说明，启动子的串联是从左到右依次串联，比如时43-Ρ也all-时43 是指在将扣pall串联到两个PP43的中间。
[0010] 所述启动子的核巧酸序列是SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、沈Q ID N0.7、沈Q ID N0.8、SEQ ID N0.9、SEQ ID NO.IO 中的任意一种。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述启动子是W下任意一种：
[0012] (1)将启动子时43和/或启动子扣pall进行一次串联，形成序列如沈Q ID NO. 1的启动 子时43-P也all、序列如沈Q ID NO. 2的启动子扣pan-时43、序列如沈Q ID NO. 3的启动子P也an-扣pall，或者序列如SEQ ID ^.4所示的启动子时43斗口43;
[OOK] (2)将启动子时43和/或启动子扣pall进行两次串联，形成序列如沈Q ID NO.5的启动 子扣。31广扣。311-时43;序列如56〇10^.6的启动子?。43斗。43斗。43;序列如沈〇10^.7的启动 子扣。311斗也311斗也311;序列如沈〇10側.8的启动子?。43斗也311斗。43;序列如沈〇10側.9的启 动子PHpaII-Pp43-PHpaII;序列如SEQ ID側.10的启动子时43斗。43斗化311;
[0014] (3)将启动子时43和/或启动子扣pall进行Ξ次或者Ξ次W上的串联。
[0015] 本发明的第二个目的是提供含有所述强启动子的质粒载体。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体可W是W下任意一种:pM0911-wapA， pMA0911-yncM(短线后为信号肤）。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为大肠杆菌-枯草芽抱杆菌穿梭载体 pMA0911 -wapA。所述载体 pMA0911 -wapA的信号肤为wapA。
[0018] 本发明的第Ξ个目的是提供含有所述质粒载体的基因工程菌。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是枯草芽抱杆菌重组得到的重组枯 草芽抱杆菌。
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽抱杆菌可W是W下任意一种:枯草芽抱 杆菌 168，WB800，WB800，PWB980。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽抱杆菌为枯草芽抱杆菌蛋白酶缺陷型菌 株WB800。
[0022] 本发明的第四个目的是提供一种所述基因工程菌的构建方法。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述构建方法是:首先将外源基因克隆到PMA0911质 粒上，然后用本发明的强启动子代替PMA0911质粒上原有的启动子，得到含有强启动子和外 源基因的重组表达质粒PMA0911巧MiM，然后将质粒PMA0911巧转化到枯草芽抱杆菌， 筛选即得到基因工程菌。
[0024] 在本发明的一种实施方式中，所述构建方法具体是：（1)目的基因的获取：根据 Genbank所提供的纳豆激酶基因序列（Genbank登录号：S51909.1)设计引物pro-NK-F/pro-NK-R，W纳豆芽抱杆菌（B.natto)的基因组DNA为模板扩增pro-nk基因；（2)穿梭质粒的构 建:将PCR产物pro-nk，经EcoR巧日BamH I双酶切后，连接到用同样限制性内切酶双酶切的 大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pMA0911-wapA，连接获得穿梭质粒pMAOgilPHpaii-pro-NK; (3) 根据启动子P43和扣pall基因序列设计引物，分别W质粒PMA091 IPHpaii-pro-NK W及枯草芽抱 杆菌168基因组为模板进行PCR，得到含有目的启动子的基因片段，再W质粒pMA0911PHpaii-pro-NK为模板，PCR产物为引物进行全质粒PCR，得到重组表达质粒；（4)将重组表达质粒转 入枯草芽抱杆菌WB800中，即得到基因工程菌。
[0025] 本发明的第五个目的是提供一种利用所述强启动子提高外源蛋白表达的方法。
[0026] 所述外源蛋白，在本发明的一种实施方式中，可W是W下任意一种:纳豆激酶、氨 肤酶。
[0027] 所述纳豆激酶，在本发明的一种实施方式中，其基因序列为Genbank登录号： S51909.1所示的序列。
[0028] 所述方法是:首先将外源基因克隆到表达质粒上，然后对启动子时43和/或PHpall进 行串联η次(η含1)串联，形成一新的强启动子，既而得到含有强启动子的重组质粒，将重组 质粒转化到宿主菌中得到重组菌，然后利用重组菌表达外源蛋白。
[0029] 所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中，可W是枯草芽抱杆菌168，WB800，WB800 或PWB980。
[0030] 所述表达质粒，可W是PMA0911，但不仅仅限于PMA0911，经多次实验验证，本发明 的强启动子对于其他枯草穿梭载体同样适用。
[0031] 所述表达，在本发明的一种实施方式中，是:将重组菌于37°C震荡培养8-12h。再将 菌液按1-5%的接种量接种至30mL/250mL的摇瓶表达培养基中发酵表达。
[0032] 所述发酵表达使用的表达培养基，在本发明的一种实施方式中，含有：1-5%膜蛋 白腺、1-5 %酵母提取物、0.1-5%甘油、17mM KH2PO4、72mM K2HPO4，并添加了0.02-0.08 %氯 化巧。
[0033] 本发明的有益效果:采用对启动子时43和/或PHpall串联的方式，得到了一系列可提 高外源蛋白产量的强启动子。本发明的强启动子扣pall可W在枯草芽抱杆菌中高效表达外源 基因。强启动子PHpan-扣pan-时43相对于PHpall启动子，使纳豆激酶酶活提高了 138.4%，相对 于PP43启动子，使纳豆激酶酶活提高了 88 % ; Pp43-Pp43-Pp43相较于PP43，使纳豆激酶酶活提高 了75.9%;?也311斗也311斗也311相较于？怔311，使纳豆激酶酶活提高了92.5%，？化311斗。43爪43-PHpall相对于P43启动子，也使纳豆激酶的酶活分别提高了 49.9 %、64.9 %。本发明的强启动 子，用于提高其他外源蛋白在枯草芽抱杆菌中的表达，比如氨肤酶，也具有较好的效果。
【附图说明】
[0034] 图1:枯草芽抱杆菌WB800中含不同启动子的表达质粒的构建;其中，Promoter X中 的X分别代表扣pall、Pp43等不同启动子。
[0035] 图2:串联启动子的结构示意图；其中，灰色方框表示信号肤(SP)，黑色方框表示纳 豆激酶基因（pro-NK)，白色箭头表示启动子扣pall或PP43。
[0036] 图3 :重组纳豆激酶表达产物的SDS-PAGE电泳图；其中，a)M:蛋白分子量标准；1， WB800/pMA0911P也 an-町 0-NK 的发酵上清；2，WB800/pMA091 lPp43-pr〇-NK 的发酵上清；b)M:蛋 白分子量标准；1，WB800/PMA091 lPP43-PHpan-pr〇-NK的发酵上清；2，WB800/PMA091 IPHpan-Pp43-pr〇-NK的发酵上清；3，WB800/pMA091 IPHpan-PHpan-pro-NK的发酵上清；4，WB800/ PMA091 lPP43-Pp43-pr〇-NK 的发酵上清；c)M:蛋白分子量标准山WB800/PMA091 IPHpan-PHpan-Pp43-pr〇-NK 的发酵上清；2，WB800/pMA091 IPHpan-时 43-PHpan-pro-NK 的发酵上清；3，WB800/ pMA0911 PHpall-PHpall-PHpall-町0-NK的发酵上清；4，WB800/pMA091 lPp43-PHpaII-Pp43-p：r〇-NK的 发酵上清；5，WB800/pMA091 lPP43-Pp43-PHpan-pr〇-NK 的发酵上清；6，WB800/pMA0911 时43-时43-Pp43-pr〇-NK的发酵上清。
[0037] 图4:重组纳豆激酶纤溶活性的比较；其中1~12分别为WB800/PMA0911P也31广口'〇-NK; WB800/pMA091 lPp43-pr〇-NK; WB800/pMA0911PP43-P 也 an-pro-NK; WB800/pMA091 IPHpan-Pp43-pr〇-NK; WB800/pMA091 IPHpan-PHpan-pro-NK; WB800/pMA0911 Pp