专利名称：纳豆激酶在制备脑保护剂类药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及纳豆激酶的一种制药新用途，具体的说是涉及到纳豆激酶在制备脑保护剂类药物中的用途，该类脑保护剂类药物可用于缺血性脑卒中、脑水肿等疾病以及各种原因导致的神经系统损伤的治疗，属于制药领域。
背景技术：
脑血管疾病是我国的第三位致死因素，其中缺血性脑卒中占56.6％～80.0％，其致残率占第一位，因而在发病早期控制脑损伤的程度具有重大的经济和社会效益。近年来，国内外对急性缺血性卒中注重于早期溶栓及神经保护治疗。关于脑缺血损伤机制的大量研究表明，神经保护治疗的关键在于阻断和减轻脑缺血级联反应，神经保护剂的干预可阻断缺血瀑布反应的不同环节，保护仍有活力的神经元，延长脑细胞缺血耐受时间和治疗窗，逆转半暗带，减小梗死体积。因此，对于神经保护剂的研究是当前缺血性卒中治疗的一个热点。钱海蓉，王鲁宁.缺血性脑卒中的神经保护剂研究进展.中国药物应用与监测，2006，130～34
神经系统包括中枢神经系统(大脑、脊髓)及外周神经系统(周围神经组织)。神经系统损伤可由多种因素引起(1)物理损伤，直接造成损伤部位的神经组织损害，如外伤造成的脑神经组织损伤或脊髓损伤；(2)部分神经系统的临时或永久性缺血或缺氧，如中风或脑栓塞造成的脑神经组织损伤；(3)接触神经毒素，如用于治疗癌症的化学制剂或用于治疗AIDS的双脱氧胞甘；(4)慢性代谢疾病，如糖尿病或肾功能障碍引起的外周神经损伤；(5)神经退行性疾病，包括帕金森病、Alzheimer疾病等。受损的神经组织可累及一种或多种类型的神经细胞。神经损伤后的保护与修复一直是神经科学家们面临的严峻挑战之一。经过多年的努力，许多研究已经证实，神经系统具有可塑性，不仅表现为对外界各种刺激具有强烈的代偿与适应能力，更重要的是在结构与功能上具有损伤后修复或重建的能力。这个过程的实现既需要启动神经细胞自身某些基因调控程序，又需要相当复杂的局部环境与条件。近年来，随着神经生长因子的发现及神经组织干细胞移植的应用，在一定程度上给治疗神经损伤带来了希望。
神经生长因子及神经营养蛋白在神经细胞和胶质细胞发育成熟中起重要作用，并对神经细胞和胶质细胞的损伤有一定的保护作用。利用基因转染技术把神经营养因子相关基因导入哺乳动物细胞株，然后移植到脑内，或利用逆转录病毒基因载体直接感染脑内神经细胞和胶质细胞，使这些经过基因修饰的细胞在局部表达相关蛋白，从而达到治疗中枢神经系统损伤的目的。神经多潜能干细胞体外分离培养的成功为神经系统损伤后的结构重建提供了可能性，移植的干细胞可在宿主体内分化成为相应的神经细胞和胶质细胞以实现损伤修复。尽管从理论上讲这些方法有助于帮助损伤的神经细胞再生和修复，但距实际应用还有很大差距。因为人们发现，由于受损神经细胞的修复和再生是一个非常复杂的过程，单独使用这些方法很难修复损伤后的神经组织。目前除了转基因技术仍存在安全问题外，损伤造成的受损神经细胞及受损伤局部组织缺氧缺血，使损伤的神经细胞及移植后的神经组织很难存活。
脑保护剂又称神经保护剂，总体来讲，关于神经保护剂的概念尚没有达成共识。就急性缺血性脑卒中而言，这类药物的目的是能够有效限制因缺血所造成的脑组织损害程度和范围。在动物试验上，神经保护剂用于减小梗死的体积，并通过对脑组织的病理学检查、梗死周边区多种理化检测手段以及测量梗死体积判断得到证实。
神经保护剂的种类很多，包括钙通道拮抗剂(尼莫地平，氟桂利嗪)、自由基清除剂——抗氧化剂(Ebselen，Tirilazad，Edaravone)、BABA激动剂(clomethiazole，地西泮)、谷氨酸拮抗剂(AMPA拮抗剂，竞争性NMDA拮抗剂)、生长因子(成纤维生长因子)、白细胞黏附抑制剂(抗ICAM抗体，Hu23F2G)、一氧化氮抑制剂(Lubeluzole)、阿片样物质拮抗剂(纳络酮，纳美芬)、磷脂酰胆碱前体(胞二磷胆碱)、5-羟色胺激动剂、钠通道阻滞剂(磷苯妥因)、钾通道开放剂(BMS-204352)、作用机制不明或多重作用的药物(脑活素，脑复康，Lubeluzole)等等。
虽然国内神经保护剂使用很广泛，但是神经保护剂多是在动物实验有效，在临床上没有见到相应的功效。目前尚没有一种脑保护剂得到国际注册批准，并且全球公认有效。
纳豆激酶(Nattokinase)，是从日本传统食品纳豆中提取的一种丝氨酸蛋白酶，这种纤维蛋白溶酶由275个氨基酸组成，无毒副作用。纳豆激酶可以从天然或人工改造的微生物细胞培养获得，也可以人工表达。纳豆激酶可以通过固态发酵法或液态发酵法CN200510020836.9生产，通过层析法刘柳，郭勇.层析法分离纳豆激酶的研究.现代食品科技，2007，(01)、反胶团法CN200410037391.0、磁性微球分离纯化法200510075057.9以及金属螯合双水相亲和分配陆瑾，赵珺，林东强，姚善泾.金属螯合双水相亲和分配技术分离纳豆激酶的研究[J].高校化学工程学报，2004，(04)等方法得到。
科学研究表明，纳豆激酶能够有效的清除人体血液内的血栓，而且对高血压、衰老、中风、肌肉痉挛和心脑血管疾病也有很好的疗效。国内外很多学者对纳豆食品和含纳豆激酶的保健食品进行深入开发，将其作为一种可以治疗和预防心脑血栓、冠心病、心绞痛、脑中风、老年痴呆以及各种常见多发病的功能食品向世界各地开拓市场张锋，金杰，解成骏.纳豆激酶最新研究进展，中国调味品，2008，129～34。WO2007002572公开了一种用含有纳豆激酶的组合物降低病人全血粘度的方法；JP2004115434公开了纳豆激酶在抗糖尿病，降低血糖和血液总胆固醇和甘油三酯等方面的用途；US20040043015公开了一种以纳豆激酶为活性成分的血小板聚集抑制剂；JP2003357848公开了一种以纳豆激酶为活性成分的肿瘤细胞远距离转移抑制剂；WO2006025276公开了含有纳豆激酶的药物能够治疗/预防眼睛疾病或者作为手术辅助用药。
纳豆激酶是一种蛋白质，其含有特定的功能序列或结构区，在保留这些功能结构或序列的情况下，对纳豆激酶进行改造获得的修饰物或衍生物也具有同纳豆激酶相同的作用。迄今为止，尚未见纳豆激酶本身、其衍生物或修饰物，以及含有纳豆激酶全部或部分氨基酸序列的生物活性物质作为脑保护剂或神经保护剂的记载或报道，亦未见其作为脑保护剂或神经保护剂用于缺血性脑卒中、脑水肿以及各种原因导致的神经系统损伤的治疗。
发明内容
本发明提供了纳豆激酶的制药新用途，具体的是纳豆激酶在制备脑保护剂类药物中的用途。
其中，所述的脑保护剂类药物可以治疗各种原因造成的神经系统损伤。造成神经系统损伤的原因包括物理损伤、缺血或缺氧、接触神经毒素、慢性代谢疾病、神经退行性疾病及衰老、脑神经细胞功能障碍等。
或者，所述的脑保护剂类药物用于治疗缺血性脑卒中。
或者，所述的脑保护剂类药物用于治疗脑水肿。
其中，所述的纳豆激酶可以是纳豆激酶本身，还包括其衍生物或修饰物，以及含有纳豆激酶全部或部分氨基酸序列的生物活性物质。
所述的纳豆激酶是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NOM204092的枯草芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus subtillis Diao1502)所产生的，保藏日为2004年12月6日，首次公开于专利申请号为200510020836.9的专利申请文件中，
公开日期为2006年11月8日。
其中，所述的纳豆激酶的HPLC图谱如图1所示，由1个特征峰组成， 其中色谱条件为 色谱柱Waters Protein-PakTM 607.8×300mm 流动相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5) 流速1ml/min 检测波长220nm 纳豆激酶的绝对保留时间在7～9min之间出峰。
所述的纳豆激酶在SDS-PAGE凝胶上28KD到14.4KD间出现多条条带。
其中，所述的纳豆激酶可以从天然或人工改造的微生物细胞培养获得，也可以人工表达。
本发明还提供了一种脑保护剂类药物组合物，它是以纳豆激酶，或纳豆激酶衍生物或修饰物，或含有纳豆激酶全部或部分氨基酸序列的生物活性物质为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。
所述的药物组合物可以是注射剂，用于静脉内、腹腔内、肌肉内或皮下注射。制备注射液的例子包括将有效剂量的纳豆激酶或纳豆激酶衍生物或修饰物，或含有纳豆激酶全部或部分氨基酸序列的生物活性物质和所需量的液体基质混合制作而成，该基质的例子包括水或生理盐水，其中还可添加其它有益成分或辅料。
药物组合物可以是口服片剂、胶囊、软胶囊、微胶囊、脂质体、颗粒剂、滴丸、口服液等剂型，包括将有效剂量的纳豆激酶或纳豆激酶衍生物或修饰物，或含有纳豆激酶全部或部分氨基酸序列的生物活性物质干粉和所需量的药用辅料混合制作而成。
另外还可以用可控制释放混合剂的方式使用。“可控制释放混合剂”是指任何一种复合物，这种复合物可以用来缓慢释放包含其中的纳豆激酶成分。这种复合物含有生物有效成分可以是固状的、渗透性的、半固状的、胶性的或液状的。
本发明纳豆激酶作为神经保护剂的新用途，为各种原因导致的神经系统损伤、缺血性脑卒中、脑水肿患者的治疗提供了一种新的用药选择，纳豆激酶成本低、用量小、药效确切。
以下通过实施例形式的具体实施方式
进一步说明本发明的有益效果，但不应理解为是对本发明的限制，凡是基于本发明的技术基本思想所做的其它多种形式的修改、替换或变更所实现的技术方案均属于本发明的范围。
图1按国际专利申请号为PCT/CN2006/000892公开的方法制备的纳豆激酶的HPLC谱图，横坐标为相对保留时间，纵坐标为吸收值。
具体实施例方式 以下试验中使用的纳豆激酶，由成都地奥制药集团所属的地奥九泓制药厂提供的，是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCCNOM204092的枯草芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus subtillis Diao 1502)，按国际专利申请号为PCT/CN2006/000892公开的方法制备的纳豆激酶，其HPLC谱图见图1所示。
实施例1 纳豆激酶对光化学法致大鼠局灶性脑缺血的治疗作用 1.1试验材料 纳豆激酶(缩写为DANK)，白色冻干絮状粉末，由成都地奥制药集团提供，批号20071225，每1.5g DANK相当于200mg纯品，精密称量后以注射用生理盐水溶解并稀释至所需浓度。
依达拉奉注射液，无色澄明液体，南京先声东元制药有限公司生产，批号80-071009，原液使用。
Wistar大鼠，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号SCXK(沪)2003-0003。动物饲养于正压净化通风动物房内，室温23±2℃，湿度40～70％，人工照明模拟昼夜变化，自由进食与饮水。
实验用光敏感染料玫瑰红(Rose Bengal sodium)，SIGMA-ALDRICH，Inc.，St.Louis，USA。
红四氮唑(TTC)，中国医药集团上海化学试剂公司，批号F20061031。称取1.200g红四氮唑和0.456g K2HPO3加入双蒸水定溶至100ml避光保存。
1.2试验仪器 LGS100-2医用冷光源，上海医用光学仪器厂一分厂生产。
307-6台式牙钻车，上海齿科医械厂生产。
SXP-1B手术显微镜，上海医用光学仪器厂生产。
1.3试验方法 Wistar大鼠共设5组，阴性对照组(生理盐水5ml/kg)，DANK低、中、高三个剂量组(2、10、50mg/kg)，阳性对照组依达拉奉(10mg/kg)。DANK口服给药，其余各组均为静脉注射给药，于造模成功后30分钟第一次给药，共连续给药3天，给药体积均为5ml/kg。
将大鼠以12％的水合氯醛腹腔注射麻醉(350～400mg/kg)后，侧卧位固定于手术台上。沿右外耳道与右眼外眦连线的中点垂直于连线切开皮肤约2cm然后在手术显微镜下分离颞肌至其与颧弓的交界处，在颧弓与颞鳞骨结合处的前端2mm处用牙科钻作一直径为5mm的骨窗，切开硬脑膜即可清晰看到大脑中动脉(MCA)近侧段跨越嗅束。选择MCA起始部或嗅束内侧2mm到大脑下静脉之间的部位为光照部位，首先将由光导纤维射出的光束(光投射孔径3mm)垂直放MCA表面，经舌下静脉注射3％的玫瑰红(30mg/kg体重)，持续照射30min(光照强度为12V，100W冷光灯)，在显微镜下证实MCA已消失，方可认为闭塞模型已形成。造模成功后30分钟第一次给药，共连续给药3天 第3次给药24h后用单盲法进行行为学评分，评分方法为(1)提鼠尾离开地面约1尺，观察前肢情况。正常大鼠两前肢对称地伸向地面。如果有左肩内旋，左前肢内收现象发生者，评分为4分，否则为0分。(2)将动物置平滑地板上分别推左(或右)肩向对侧移动，检查抵抗推动的阻力。正常大鼠双侧阻力明显且对称。如果推右肩向左侧移动时，发现阻力下降者，根据下降程度的不同，评分为1～3分。(3)将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。正常大鼠两前肢张力明显且对称。而发生左前肢张力下降者，根据下降程度的轻重评为0～3分。根据以上标准打分，满分10分。评分完毕，断头取脑。将大脑平均冠状分为5片，放于TTC溶液中，37℃温育10～15min染色。梗死区不着色，正常脑组织染成红色。用生理盐水冲洗后数码照相，图像输入电脑，然后分别称量全脑重量和坏死部分重量，计算坏死区重量占全脑重量的百分率。所有的数据的统计学分析用t检验。
1.4试验结果 试验结果见表1。可以看到，阳性药依达拉奉和受试药物DANK都可以显著改善光化学法致大鼠局灶性脑缺血模型的行为学评分，降低脑坏死百分率。受试药物DANK对脑缺血的改善作用与给药剂量呈正比。其中DANK在10和50mg/kg剂量时均能显著降低局部性脑缺血大鼠脑坏死百分率，改善行为学缺陷评分，与阴性对照组相比差异有非常显著性差异(P＜0.01)，其10mg/kg的效果与依达拉奉相当。DANK在2mg/kg剂量时也有轻微改善大鼠的行为学缺陷评分，降低脑坏死百分率，但与阴性组比较无显著性差异(P＞0.05)。
表1 DANK对光化学法致大鼠局灶性脑缺血的治疗作用
与阴性组相比较*P＜0.05，**P＜0.01 1.5结论 本实验中，受试药物纳豆激酶体现出改善光化学法致大鼠局灶性脑缺血模型行为学评分，降低脑坏死百分率的作用，说明纳豆激酶对局灶性缺血脑损伤及其引起的活动功能障碍具有明显的治疗作用，可以作为神经保护剂用于治疗缺血性脑损伤及其引起的神经功能损伤。
实施例2 DANK对PC12细胞缺血性损伤的保护作用 2.1试验材料 细胞株PC12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆株，由上海中科院细胞库提供。
2.2试验模型采用连二亚硫酸钠和低糖培养基造成PC12细胞缺氧性损伤。
2.3指标检测MTT法，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定各组OD值，比较细胞活力。
2.4组别与结果 2.4.1细胞形态学观察 PC12细胞是一种常用的神经细胞株，细胞形状呈梭形、三角形，突触相互交织成网状，折光度强。经缺氧处理后，细胞的突起减少或消失，细胞肿胀变圆，折光率下降，部分细胞裂解成碎片。给予DANK能明显对抗缺氧引起的细胞形态学变化，较多细胞保留突起，破碎细胞减少。
2.4.2对缺氧缺糖PC12细胞活力的影响 表2 DANK对缺氧缺糖PC12细胞活力影响
注与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01 与正常对照组细胞相比，模型组OD值显著降低，表明细胞活力下降；DANK 0.01、0.02、0.03IU/ml三个剂量组OD值明显高于模型组，表明在该剂量范围内DANK对缺氧缺糖的PC12细胞具有保护作用； 2.5结论DANK对缺氧缺糖所致的神经细胞损伤具有保护作用。
实施例3 纳豆激酶注射液的制备 取纯化好的纳豆激酶溶液(5mg/ml)100ml，加入4％的蔗糖、4％葡萄糖以及5％的甘露醇。溶解后，过滤除菌，按照每瓶2ml分装，无菌冷冻干燥及封装。使用时以生理盐水为溶剂。
实施例4 纳豆激酶片剂的制备 片剂处方 按处方量称取纳豆激酶、淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠加入沉淀法二氧化硅、硬脂酸镁，混合均匀，压片。每片最后平均质量是1.0g±0.05g。
对上述处方的样品进行口感、崩解时限、溶出度、脆碎度测定。
实施例5 纳豆激酶硬胶囊的制备 取纳豆激酶冻干品100g(40000IU/g)，与400g淀粉混合均匀，分别装入肠溶胶囊25000粒，每粒200mg，测酶活力，每粒含纳豆激酶1600IU。
综上所述，纳豆激酶对局灶性缺血脑损伤及其引起的活动功能障碍具有明显的治疗作用，对缺氧缺糖所致的神经细胞损伤具有保护作用，可以作为神经保护剂用于治疗缺血性脑损伤及其引起的神经功能损伤，尤其采用专利国际专利申请号为PCT/CN2006/000892所公开的方法制备的纳豆激酶，具有显著的药效。
权利要求
1、纳豆激酶在制备脑保护剂类药物中的用途。
2、根据权利要求1所述的用途，其特征是所述的脑保护剂类药物用于治疗各种原因造成的神经系统损伤。
3、根据权利要求1或2所述的用途，其特征是所述的脑保护剂类药物用于治疗缺血性脑卒中。
4、根据权利要求1或2所述的用途，其特征是所述的脑保护剂类药物用于治疗脑水肿。
5、根据权利要求1所述的用途，其特征是所述的纳豆激酶是纳豆激酶，或纳豆激酶衍生物或修饰物，以及含有纳豆激酶全部或部分氨基酸序列的生物活性物质。
6、根据权利要求1-5任意一项所述的用途，其特征是所述的纳豆激酶是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NOM204092的枯草芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus subtillis Diao 1502)产生的。
7、根据权利要求6所述的用途，其特征是所述的纳豆激酶的HPLC图谱如图1所示，由1个特征峰组成，
其中色谱条件为
色谱柱Waters Protein-PakTM 607.8×300mm
流动相0.2mol/L NaH2PO4-CH3OH(95∶5)
流速1ml/min
检测波长220nm
纳豆激酶的绝对保留时间在7～9min之间出峰。
8、根据权利要求7所述的用途，其特征是所述的纳豆激酶在SDS-PAGE凝胶上28KD到14.4KD间出现多条条带。
9、一种脑保护剂类药物组合物，它是以权利要求1-8任意一项所述的纳豆激酶，或纳豆激酶衍生物或修饰物，或含有纳豆激酶全部或部分氨基酸序列的生物活性物质为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药物制剂。
10、根据权利要求9所述的脑保护剂类药物组合物，其特征是所述的纳豆激酶是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NOM204092的枯草芽孢杆菌DIAO 1502(Bacillus subtillis Diao 1502)产生的。
11、根据权利要求9或10所述的药物组合物，其特征是所述的药物制剂为口服制剂或注射用制剂，口服制剂为片剂、胶囊、软胶囊、微胶囊、脂质体、颗粒剂、滴丸、口服液以及缓控释制剂，注射用制剂为注射液、粉针剂。
全文摘要
本发明提供了纳豆激酶的新用途，具体地，是在制备脑保护剂类药物中的用途。本发明还提供了一种脑保护剂类药物组合物。本发明纳豆激酶用作脑保护剂，药效明确。
文档编号A61P25/00GK101601859SQ20091014668
公开日2009年12月16日 申请日期2009年6月11日 优先权日2008年6月12日
发明者军 陈, 琪 魏, 飞 蒋, 鹏 代, 何俊蓉, 驿 周, 彭文璟 申请人:成都地奥九泓制药厂