靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体及其制备方法与流程

本发明属于生物医用高分子材料与纳米生物技术领域，具体涉及靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体及其制备方法。

背景技术：

恶性肿瘤在世界范围内已经成为人类面临的主要杀手之一，每年导致全球大约13％的死亡率。据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)统计，在世界范围内，每年有近100万人被诊断出癌症，在近十年有超过8000万人死于癌症。虽然化疗在近些年的抗癌治疗中取得了良好的效果，但是由于它治疗的过程中不具有肿瘤靶向性，导致严重的副反应，给患者带来极大地痛苦。此外，由于许多化疗药物还存在溶解度低，稳定性差，生物利用度低，容易引发多药耐性等问题，严重限制了抗肿瘤药物在临床上的应用。所以，研究抗癌药物合适的给药载体是十分必要的。

随着近年材料化学的进步与发展，越来越多的人聚焦于纳米递药系统，包括纳米载体，纳米粒，脂质体，聚合物-药物共聚体，碳纳米管，介孔硅载药体系等。在这其中，聚合物载体作为一种具有广阔应用前景的新型纳米给药系统，引起了人们的广泛关注。

壳寡糖(CSO)，一种低分子量的壳聚糖，在保留了壳聚糖的诸多理化性质的条件下水溶性获得了极大的提高，它是自然界中存在的唯一一种带有氨基的碱性多糖，具有良好的生物相容性，生物可降解性和低毒性，因此可对其进行疏水改性，来负载疏水性的药物。

许多研究表明透明质酸(HA)在肿瘤发生、发展过程中起着重要作用，其特异性受体CD44在许多肿瘤细胞中过表达，而正常细胞表面的CD44受体则处于一种非活跃的沉默状态，而透明质酸与CD44之间的相互作用可介导药物进入细胞，可作为透明质酸作为靶向配体治疗恶性肿瘤的基础。目前针对透明质酸对药物的靶向递送多集中于利用透明质酸中的羧基对载体进行化学修饰或直接对透明质酸进行两亲性修饰，但有文献报道，过多利用透明质酸中的羧基对其进行改性可能会影响透明质酸对CD44受体的靶向结合能力，并且通过化学方法进行透明质酸修饰制备靶向载体，存在工艺复杂，过程繁琐，批次重现差等问题。因此，采用静电吸附作用结合透明质酸作为靶向配体，可有效减少对透明质酸结构的影响，增加载体对CD44受体的靶向性，同时无需化学合成，节省时间和成本。

传统肿瘤治疗方法中常常会存在短时间内频繁用药，出现血药浓度高，毒副作用大，治疗效果不明显等问题，刺激响应型纳米载体由于可提高药物的生物利用度，选择性的将药物浓集于肿瘤组织，经肿瘤部位刺激(如温度、PH、光、磁场、超声强度、电子脉冲等)而迅速释药，因此智能型药物递释系统的设计已逐渐成为药剂学领域的研究热点之一。基于肿瘤细胞与正常细胞之间还原型谷胱甘肽(GSH)浓度的显著性差异设计的还原敏感性递药系统可以实现药物高效安全递送。

两亲性聚合物除了可以装载药物，还可以装载磁性或者荧光纳米粒子作为造影剂用做磁共振成像(MIR)或荧光成像，对药物在肿瘤组织或者细胞中的分布进行监测。磁性纳米粒子是一种智能型的纳米磁性材料，它既具有纳米材料所特有的性质如粒径小，比表面积大，又具有磁响应性及超顺磁性，可以在恒定磁场下聚集和定位。Fe₃O₄具有优异的超顺磁性能，可以用于体内磁共振成像和实现药物的磁靶向递送，已经被美国FDA批准应用于临床。

目前利用两亲性聚合物形成胶束递送药物已有众多报道，通过将超顺磁性纳米粒掺杂于两亲性聚合物中构建磁性纳米载体用于磁靶向或磁共振成像的案例也有相关报道，但是尚未发现将还原响应特性、磁靶向、配体靶向多重特性集一身的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体的相关报道。本发明首次基于壳寡糖设计合成还原响应型两亲性聚合物包裹超顺磁性Fe₃O₄，同时利用静电吸附作用附着透明质酸作靶向配体，构建靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体，该载体具良好的生物相容性，是疏水性抗肿瘤药物的理想载体。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体及其制备方法。

本发明所述的是靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体，它具典型的核壳结构。以超顺磁性Fe₃O₄纳米粒为内核，包裹在具还原响应性的两亲性聚合物内部；所述的具还原响应性的两亲性聚合物是由疏水基团与亲水性聚合物通过含还原敏感键的Linker连接而成；所述两亲性聚合物构成所述纳米载体的壳结构，壳表面通过静电吸附作用附着靶向配体。

所述的具还原响应性的两亲性聚合物是由疏水基团与亲水性聚合物通过含还原敏感键的Linker连接而成；进一步地，所述的亲水性聚合物为壳寡糖，其分子量为1000～10000Da；进一步地，所述壳寡糖分子量为5000Da。

所述的具还原响应性的两亲性聚合物是由疏水基团与壳寡糖通过含还原敏感键的Linker连接而成；进一步地，所述含还原敏感键的Linker为二硫代二丙酸，Linker中所含还原敏感键为二硫键；所述疏水基团选自胆固醇、维生素E、C₈～C₁₆脂肪醇；

所述的具还原响应性的两亲性聚合物合成过程中，键合有含还原敏感键Linker的疏水基团与壳寡糖中氨基摩尔投料比为5％～100％。

所述靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体，靶向配体为透明质酸，并且通过静电吸附作用与聚合物壳结构相连，透明质酸分子量为3500～250000Da；进一步地，透明质酸分子量为14600Da；

所述的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体具超顺磁性，为球形结构，粒径大小为50～250nm，磁性纳米粒子具有超顺磁性，粒径为5～18nm。

当壳寡糖分子量取5000Da，键合有含还原敏感键Linker的疏水基团为十六醇时，随着投料比的改变，纳米粒的平均粒径(d_n)和临界胶束浓度(CMC)，多分散系数(PDI)也发生改变。结果见表1。

表1

从表中可以看出，键合有含还原敏感键Linker的十六醇投料比越大，载体临界胶束浓度越小，粒径越小，当投料比为30％时载体粒径分布相对比较均一，PDI较小，透射电镜下外观呈球形，如图7，因此本发明中键合有含还原敏感键Linker的十六醇投料比优选为30％。

透明质酸的投量会严重影响载药体系的粒径和稳定性，参照Int.J.Biol.Macromol.2015，72：1391-1401，通过考察HA加入量对载体溶液在450nm处的吸光度的影响，可以反映所形成的纳米粒的多少与粒径的大小。如图1可以看出当HA与还原响应性两亲性聚合物投料比在1/20～8/20时，所形成的纳米粒在48h内比较稳定，并且随着HA投量的增加，溶液在450nm处的吸光度逐渐增大，这表明所形成的纳米粒数目逐渐增多，载体粒径逐渐变大，当将所得纳米粒溶液过0.22μm微孔滤膜后，投料比为4/20～8/20的纳米粒溶液，纳米粒大部分被截留，因此在本发明中HA的投料比优选为3/20。

该纳米载体具有超顺磁性和肿瘤细胞多重靶向性，可同时用于体内的磁共振成像和靶向递送疏水性抗肿瘤药物。

本发明所构建的靶向配体修饰的还原响应性磁性纳米载体，具有以下优点：

1)具多重肿瘤靶向能力，提高抗肿瘤效率，降低对正常组织器官的毒副作用。

2)通过静电吸附附着靶向配体，无需化学反应，节约时间和成本，增强载体肿瘤靶向性。

3)能快速响应肿瘤高GSH微环境，使药物在肿瘤细胞内快速释放，增强肿瘤抑制作用。

本发明的另一目的旨在提供一种制备前述纳米载体的方法，包括以下步骤：

1.疏水性超顺磁性Fe₃O₄纳米粒子的合成：参照文献J.Am.Chem.Soc.2004，126：273-279所述的高温热解法合成5～18nm、高度单分散、粒径均一、具超顺磁性的Fe₃O₄纳米粒子，其形貌如图2，磁滞回线如图3。

2.键合有含还原敏感键Linker的疏水基团的合成：将3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和二环己基碳二亚胺(DCC，1.618g，7.84mmol)溶于20ml无水有机溶剂中，氩气保护下冰浴搅拌30min，将疏水基团(7.13mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP，87mg，0.713mmol)加入其中，继续在冰浴下搅拌反应1h，之后将其转移到室温条件下继续搅拌反应，反应完全后加入等体积的乙酸乙酯终止反应，过滤除去二环己脲，滤液加入少量水后用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，于混合溶剂中重结晶，即得键合有含还原敏感键Linker的疏水基团。

合成路线详解如下：

3.键合有含还原敏感键Linker的疏水基团改性壳寡糖：取壳寡糖1g溶于2ml超纯水中后，加入20ml二甲基亚砜对其进行稀释，65℃下预热30min，按照壳寡糖氨基含量的0.05～1倍摩尔当量称取2)中合成的键合有还原敏感键Linker的疏水基团，加入相当于键合有还原敏感键Linker的疏水基团1.5倍摩尔当量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶于适量的二甲基亚砜中，65℃下活化30min，将其逐滴加入已预热好的壳寡糖溶液中，65℃下反应24h，反应结束后将溶液逐滴加入到10倍体积的丙酮中，11000r/min离心3min，收集沉淀，用少量水复溶后，逐滴加入丙酮中，离心收集沉淀，重复上述操作三次，最后将所得红棕色沉淀溶于适量水中，装入透析袋中(MWCO 1000Da)透析24h，冷冻干燥，得具还原响应性的两亲性聚合物。该两亲性材料具良好的水溶性，在水溶液中可自组装形成纳米载体。

合成路线详解如下：

4.还原响应性两亲性聚合物对Fe₃O₄纳米粒子的装载：将Fe₃O₄纳米粒溶解于氯仿或二氯甲烷或正己烷中，20mg两亲性聚合物溶解于10ml超纯水中，通过超声乳化-溶剂挥发法将Fe₃O₄纳米粒包封于载体内部；Fe₃O₄纳米粒与两亲性聚合物的重量比为5％～50％，在有机溶剂挥发的过程中，Fe₃O₄纳米粒子自发被负载于两亲性聚合物内部。

5.靶向配体修饰还原响应型磁性载药纳米载体：将0.1～2mg/ml的透明质酸溶液逐滴缓慢滴加于还原响应型磁性载药纳米载体中(其中含两亲性材料的浓度为0.5～2mg/ml)，室温搅拌10min，将载体溶液依次通过0.45μm，0.22μm滤膜，通过冷冻干燥即得靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体。

本发明所发明纳米载体可用于疏水性抗肿瘤药物的运载，故本发明还提供一种负载疏水性抗肿瘤药物的方法，其制备过程包括以下步骤：

1.还原响应性两亲性聚合物对Fe₃O₄纳米粒子和药物的装载：该过程通过一步法将Fe₃O₄纳米粒子和药物同时装载或分两步将二者中一种先装载后再将另外一种装载。采用一步法时装载方法选用超声乳化-溶剂挥发法或透析法，溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、正己烷、二甲亚砜、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、水；采用两步法时，装载Fe₃O₄选用超声乳化-溶剂挥发法，装载药物选择透析法或超声乳化-溶剂挥发法，溶剂选自四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、正己烷、二甲亚砜、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、水。

2.靶向配体修饰还原响应性磁性载药纳米复合物：将0.1～2mg/ml的透明质酸溶液逐滴缓慢滴加于1所得溶液(其中含两亲性材料的浓度为0.5～2mg/ml)，室温搅拌10min，将载体溶液依次通过0.45μm，0.22μm滤膜，通过冷冻干燥即得靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载药复合物。

与现有技术相比，本发明所述的技术方案具以下优点：

1)可同时负载Fe₃O₄纳米粒子和疏水性抗肿瘤药物，结合靶向配体主动靶向作用，超顺磁性磁纳米的磁靶向作用和载体肿瘤微环境还原响应特性，使该载体更具肿瘤细胞靶向性，到达肿瘤细胞内部后，能快速响应肿瘤细胞高GSH，迅速将抗肿瘤药物释放，具较强的抗肿瘤效率，能有效降低毒副作用。

2)该纳米载体具超顺磁性，可同时用于体内磁共振成像和药物的靶向递送。

3)靶向配体通过静电吸附作用附着于载体表面，制备方法简单，操作简便。

4)所用材料具有良好的生物相容性。

附图说明

图1：透明质酸的加入量对纳米载体在450nm处的吸光度的影响；

图2：实施例1中通过高温热解法合成的高度单分散、粒径较均一约为8nm的Fe₃O₄的TEM图；

图3：实施例1中通过高温热解法合成的Fe₃O₄在300K下的磁滞回线；

图4：实施例2中Hex-SS-COOH的¹H-NMR图谱；

图5：实施例2中壳寡糖(CSO)的¹H-NMR图谱；

图6：实施例2中CSO-SS-Hex的¹H-NMR图谱；

图7：实施例2中还原响应性两亲性材料的TEM图；

图8：实施例2中还原响应性两亲性材料的粒径分布图；

图9：实施例2中还原响应性两亲性材料在10mM GSH条件下粒径的动态变化图；

图10：实施例5中透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载体(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)的TEM图；

图11：实施例5中透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载体(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)的动态光散射柱状分布图；

图12：实施例5中透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载体(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)在300K下的磁滞回线；

图13：实施例5中透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载体磁响应性，a为加磁铁吸附前载体溶液的状态，b为加磁铁吸附1h后载体溶液的状态，c为将b轻摇后载体溶液的状态；

图14：实施例5中透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载体(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)的细胞毒性；

图15：实施例5中A549细胞对透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载体(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)摄取的定量分析；

图16：实施例5中A549细胞对未经透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载体(CSO-SS-Hex/Fe₃O₄)摄取的定量分析；

图17：实施例8中透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载药复合物(HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄/PTX)在不同环境下的药物释放曲线图。

具体实施方式

以下具体实施例是对本发明的进一步说明，但下述仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

1.疏水性超顺磁性Fe₃O₄纳米粒的合成

实施例1：

参照文献J.Am.Chem.Soc.2004，126，273-279，称取乙酰丙酮铁(0.7063g，2mmol)，1，2-十二烷二醇(2.0234g，10mmol)，油酸(l.6948g，6mmol)，油胺(1.605g，6mmol)，二苯醚(20mL)在氩气流110℃下搅拌1h以除去水和氧气，将温度上升至200℃(每分钟升高8℃)，在此温度下反应2h，停止通氮气，温度加热到265℃，回流反应30min，等反应液冷却至室温后，将反应液倒入40ml乙醇中沉淀，11000r/min*30min，用无水乙醇洗涤三次之后，将其分散到25ml的氯仿中保存。

通过透射电镜(TEM)对其进行形貌观察，结果如图2，粒子形态近球形，粒径在10nm以下。

通过振动样品磁强计(VSM)对它的磁性能进行表征，结果如图3，磁滞回线表明，合成的磁纳米粒饱和磁化强度为39.58emu/g，几乎没有剩磁和矫顽力，验证了合成的Fe₃O₄纳米粒具有很好的超顺磁性行为。

2.还原响应性两亲性聚合物的制备

实施例2：键合有含还原敏感键Linker的十六醇改性壳寡糖的制备(CSO-SS-Hex)

1)键合有含还原敏感键Linker的疏水基团的合成：

将3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和DCC(1.618g，7.84mmol)溶于20ml无水DMF中，氩气保护下冰浴搅拌30min，将十六醇(1.729g，7.13mmol)和DMAP(87mg，0.713mmol)加入其中，继续在冰浴下搅拌反应1h，之后将其转移到室温条件下搅拌反应2h，加入等体积的乙酸乙酯终止反应，过滤除去二环己脲，滤液加入少量水后乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，于20ml甲醇/乙酸乙酯＝1/1的混合溶剂中重结晶即得产物Hex-SS-COOH。其¹H-NMR谱图如图4。

2)疏水改性壳寡糖的合成：

取分子量为5000Da的壳寡糖1g溶于2ml超纯水中后，加入20ml DMSO对其进行稀释，65℃下预热半小时，按照壳寡糖氨基含量的0.3倍当量称取上述合成的含还原敏感连接臂的疏水基团，加入1.5倍当量的EDCI，NHS，溶于适量的DMSO中，65℃下活化30min，将其逐滴加入已预热好的壳寡糖溶液中，65℃下反应24h，反应结束后将溶液逐滴加入到10倍体积的丙酮中，11000r/min离心3min，收集沉淀，用少量水复溶后，逐滴加入丙酮中，离心收集沉淀，重复上述操作三次，最后将所得红棕色沉淀溶于适量水中，装入透析袋中(MWCO 1000Da)透析24h，冷冻干燥，得CSO-SS-Hex。

Hex-SS-COOH ¹H-NMR图谱如图4，图谱中δ＝1.25的峰归属22个亚甲基H信号，δ＝0.874的峰归属为端甲基H信号，壳寡糖(CSO)¹H-NMR图谱如图5，图谱中δ＝1.99的峰归属为-NHCOCH₃的H的特征峰，CSO-SS-Hex ¹H-NMR谱图如图6，图谱中同时出现了上述两种物质的特征峰，说明Hex-SS-COOH成功键合到了壳寡糖的骨架上。

通过透射电镜对其形貌进行考察，结果如图7，载体外观呈球形，形态完整，具核壳结构。

通过马尔文粒度仪对其粒径分布进行考察，结果如图8，粒径比透射电镜所测稍大，可能与透射电镜测定是在粒子干燥情况下测定有关。

本发明采用将一定量的CSO-SS-Hex加入到10mM还原性谷胱甘肽溶液中，模拟载体在肿瘤组织中还原响应特点，间隔一段时间对其粒径分布进行考察，结果如图9，随时间推移，载体粒径分布逐渐变大，出现大于1000nm的粒子，表明该载体能快速响应高谷胱甘肽环境。

实施例3：键合有含还原敏感键Linker的胆固醇改性壳寡糖的制备(CSO-SS-Chol)

1)键合有含还原敏感键Linker的疏水基团的合成：

将3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和DCC(1.618g，7.84mmol)溶于20ml无水THF中，氩气保护下冰浴搅拌30min，将胆固醇(2.756g，7.13mmol)和DMAP(87mg，0.713mmol)加入其中，继续在冰浴下搅拌反应1h，之后将其转移到室温条件下搅拌反应12h，过滤除去二环己脲，减压浓缩，于20ml乙酸乙酯/正己烷＝1/1的混合溶剂中重结晶即得产物Chol-SS-COOH。

2)疏水改性壳寡糖的合成：

取分子量为5000Da的壳寡糖1g溶于2ml超纯水中后，加入20ml DMSO对其进行稀释，65℃下预热半小时，按照壳寡糖氨基含量的0.3倍当量称取上述合成的含还原敏感连接臂的疏水基团，加入1.5倍当量的EDCI，NHS，溶于适量的DMSO中，65℃下活化30min，将其逐滴加入已预热好的壳寡糖溶液中，65℃下反应24h，反应结束后将溶液逐滴加入到10倍体积的丙酮中，11000r/min离心3min，收集沉淀，用少量水复溶后，逐滴加入丙酮中，离心收集沉淀，重复上述操作三次，最后将所得红棕色沉淀溶于适量水中，装入透析袋中(MWCO 1000Da)透析24h，冷冻干燥，得CSO-SS-Chol。

实施例4：键合有含还原敏感键Linker的维生素E改性壳寡糖的制备(CSO-SS-VE)

1)键合有含还原敏感键Linker的疏水基团的合成：

将3，3’-二硫代二丙酸(1.50g，7.13mmol)和DCC(1.618g，7.84mmol)溶于20ml无水CH₂Cl₂中，氩气保护下冰浴搅拌30min，将维生素E(3.071g，7.13mmol)和DMAP(87mg，0.713mmol)加入其中，继续在冰浴下搅拌反应1h，之后将其转移到室温条件下搅拌反应12h，过滤除去二环己脲，减压浓缩，于20ml乙酸乙酯/正己烷＝1/1的混合溶剂中重结晶即得产物VE-SS-COOH。

2)疏水改性壳寡糖的合成：

取分子量为5000Da的壳寡糖1g溶于2ml超纯水中后，加入20ml DMSO对其进行稀释，65℃下预热半小时，按照壳寡糖氨基含量的0.3倍当量称取上述合成的含还原敏感连接臂的疏水基团，加入1.5倍当量的EDCI，NHS，溶于适量的DMSO中，65℃下活化30min，将其逐滴加入已预热好的壳寡糖溶液中，65℃下反应24h，反应结束后将溶液逐滴加入到10倍体积的丙酮中，11000r/min离心3min，收集沉淀，用少量水复溶后，逐滴加入丙酮中，离心收集沉淀，重复上述操作三次，最后将所得红棕色沉淀溶于适量水中，装入透析袋中(MWCO：1000Da)透析24h，冷冻干燥，得CSO-SS-VE。

3.配体修饰的的还原响应两亲性聚合物对Fe₃O₄纳米粒子装载

实施例5：

称取具还原响应性的两亲性聚合物(CSO-SS-Hex)20mg溶于10ml超纯水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(约10mg)，在剧烈搅拌条件下将其注入两亲性聚合物溶液中，细胞破碎仪(振幅30％，工作2s，停3s)超声乳化3min，室温下敞口搅拌使氯仿自然挥发，待氯仿挥尽后，在剧烈搅拌下，以极缓慢的速度逐滴将3ml 1mg/ml的透明质酸(分子量为14600Da)溶液加入其中，搅拌30min后，将溶液以4000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液，上清液过0.45μm微孔滤膜，收集滤液，冻干即为配体修饰的还原响应型磁性纳米载体。

为了更好的说明本方法制备的透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载药载体的性能，根据以下测试方法进行性能测定，包括形貌表征、粒径分布测定、磁性能考察。

本发明通过透射电镜(TEM)对制备的透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载药载体形貌进行表征，制备的载药载体外观呈球形，形貌均一，结果如图10。

通过马尔文粒度仪对其粒径分布进行考察，所测粒径大小与透射电镜结果相一致，结果如图11。

利用振动样品磁强计(VSM)对其磁性能进行考察，所得磁滞回线如图12，饱和磁强度为8.53emu/g，几乎观测不到矫顽力和剩磁，故表现出超顺磁性行为，可满足生物医学的应用。

本发明利用永磁铁对所制备的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体的磁响应行为进行更加直观的考察。准确配制1mg/ml的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体水溶液，将其置于10ml的西林瓶中，在西林瓶一侧放一磁铁，观测载体的磁响应行为，结果如图13，所制备的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体具良好的磁响应性，放置磁铁前载体溶液呈均一的溶液状态(图13a)，在溶液一侧放置磁铁后可快速在磁体附近富集(图13b)，轻摇后立即重新分散为均一状态，无沉淀析出(图13c)。

本发明制备的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体通过MTT实验对其生物相容性进行考察。精密称取一定量的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体，加入适量的PBS缓冲液(PH＝7.4)，超声配制成2mg/ml的载体悬液，实验前，在无菌的条件下，用新鲜的DMEM不完全培养基将载体悬液分别稀释为400μg/ml，200μg/ml，100μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，10μg/ml，5μg/ml，1μg/ml。取对数生长期的的A549或SMMC-7721细胞，胰酶消化收集细胞后，以5*10^3个/孔的密度接种到96孔板中，每孔加入100μl含10％胎牛血清的的DMEM培养基，每组设置三个平行孔。孵育24h待细胞贴壁80％后，用移液枪吸弃上清液，更换为100μl DMEM培养基或者含不同浓度样品的DMEM培养基，继续孵育48h，取出96孔板，避光条件下加入10μl 5mg/ml的MTT溶液，继续避光孵育2h，使用酶标仪在570nm波长下测定各孔的吸光度值，记录结果，按照下述公式计算细胞的存活率：

其结果如图14，本发明制备的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体即使在400μg/ml的高浓度下，对人非小细胞性肺癌细胞(A549)和人肝癌细胞(SMMC-7721)共孵育48h，仍保持有70％以上田胞存活率，表明本发明制备的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体具有较低的细胞毒性，具有较好的生物相容性。

为说明本发明制备的靶向配体修饰的还原响应型磁性纳米载体中靶向配体的修饰有助于肿瘤细胞对该载体的摄取，本发明以未经靶向配体修饰的载体为对照组，通过FITC对载体进行荧光标记，以A549为模型细胞，采用流式细胞仪对细胞内荧光强度进行定量分析，HA/CSO-SS-Hex/Fe₃O₄和CSO-SS-Hex/Fe₃O₄细胞内荧光强度结果分别如图15和图16，结果表明，经共孵育后，胞内载体的荧光强度呈时间依赖性，同一时间点时，靶向配体修饰的载体组胞内荧光强度更强，说明靶向配体的加入能有效促进肿瘤细胞对载体的摄入。

实施例6：

称取具还原响应性的的两亲性聚合物(CSO-SS-Chol)20mg溶于10ml超纯水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(约10mg)，在剧烈搅拌条件下将其注入两亲性聚合物溶液中，细胞破碎仪(振幅30％，工作2s，停3s)超声乳化3min，室温下敞口搅拌使氯仿自然挥发，待氯仿挥尽后，在剧烈搅拌下，以极缓慢的速度逐滴将3ml 1mg/ml的透明质酸(分子量为14600Da)溶液加入其中，搅拌30min后，将溶液以4000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液，上清液过0.45μm微孔滤膜，收集滤液，冻干即为配体修饰的还原响应型磁性纳米载体。

实施例7：

称取具还原响应性的的两亲性聚合物(CSO-SS-VE)20mg溶于10ml超纯水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(约10mg)，在剧烈搅拌条件下将其注入两亲性聚合物溶液中，细胞破碎仪(振幅30％，工作2s，停3s)超声乳化3min，室温下敞口搅拌使氯仿自然挥发，待氯仿挥尽后，在剧烈搅拌下，以极缓慢的速度逐滴将3ml 1mg/ml的透明质酸(分子量为14600Da)溶液加入其中，搅拌30min后，将溶液以4000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液，上清液过0.45μm微孔滤膜，收集滤液，冻干即为配体修饰的还原响应型磁性纳米载体。

4.配体修饰的还原响应型磁性纳米载体对疏水性抗肿瘤药物的装载

实施例8：

称取具还原响应性的的两亲性聚合物(CSO-SS-Hex)20mg溶于10ml超纯水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(约10mg)，在剧烈搅拌条件下将其注入两亲性聚合物溶液中，细胞破碎仪(振幅30％，工作2s，停3s)超声乳化3min，室温下敞口搅拌使氯仿自然挥发，待氯仿挥尽后，精密称取10.0mg紫杉醇，溶于1ml无水乙醇中，配制成10mg/ml的紫杉醇乙醇溶液，将其以极缓慢的速度逐渐滴加到上述磁性纳米载体溶液中，搅拌30min后，冰浴超声(振幅30％，工作2s，停3s，15min)，超声完毕，在剧烈搅拌下，以极缓慢的速度逐滴将3ml 1mg/ml的透明质酸(分子量为14600Da)溶液加入其中，搅拌30min后，将其转移到透析袋(MWCO：1000Da)中透析过夜，待透析结束，将透析袋中溶液全部转移至烧杯中，以4000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液，上清液过0.45μm微孔滤膜，收集滤液，冻干即为配体修饰的还原响应型磁性纳米载药复合物。

本发明采用将一定量的透明质酸修饰的还原响应型磁性纳米载药复合物置于3500Da透析袋中，并将其放入含有不同浓度还原性谷胱甘肽(GSH)的缓冲液中，模拟载体在不同生理环境下的药物释放行为，间隔一定时间取出一定量的透析液，利用高效液相色谱计算不同时间药物的累计释放量，结果如图17所示，该载体具明显的还原响应性，在高浓度的还原条件下可使药物短时间内大量释放，而在非还原条件下，药物可以被很好地保护，不会使其过早的释放和泄露。

实施例9：

称取具还原响应性的的两亲性聚合物(CSO-SS-Chol)20mg溶于10ml超纯水中，吸取1ml Fe₃O₄溶液(约10mg)，在剧烈搅拌条件下将其注入两亲性聚合物溶液中，细胞破碎仪(振幅30％，工作2s，停3s)超声乳化3min，室温下敞口搅拌使氯仿自然挥发，待氯仿挥尽后，精密称取10.0mg紫杉醇，溶于1ml无水乙醇中，配制成10mg/ml的紫杉醇乙醇溶液，将其以极缓慢的速度逐渐滴加到上述磁性纳米载体溶液中，搅拌30min后，冰浴超声(振幅30％，工作2s，停3s，15min)，超声完毕，在剧烈搅拌下，以极缓慢的速度逐滴将3ml 1mg/ml的透明质酸(分子量为14600Da)溶液加入其中，搅拌30min后，将其转移到透析袋(MWCO：1000)中透析过夜，待透析结束，将透析袋中溶液全部转移至烧杯中，以4000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液，上清液过0.45μm微孔滤膜，收集滤液，冻干即为配体修饰的还原响应型磁性纳米载药复合物。

实施例10：

称取具还原响应性的两亲性聚合物(CSO-SS-VE)20mg溶于10ml超纯水中，吸取1mlFe₃O₄溶液(约10mg)，在剧烈搅拌条件下将其注入两亲性聚合物溶液中，细胞破碎仪(振幅30％，工作2s，停3s)超声乳化3min，室温下敞口搅拌使氯仿自然挥发，待氯仿挥尽后，精密称取10.0mg紫杉醇，溶于1ml无水乙醇中，配制成10mg/ml的紫杉醇乙醇溶液，将其以极缓慢的速度逐渐滴加到上述磁性纳米载体溶液中，搅拌30min后，冰浴超声(振幅30％，工作2s，停3s，15min)，超声完毕，在剧烈搅拌下，以极缓慢的速度逐滴将3ml 1mg/ml的透明质酸(分子量为14600Da)溶液加入其中，搅拌30min后，将其转移到透析袋(MWCO：1000)中透析过夜，待透析结束，将透析袋中溶液全部转移至烧杯中，以4000r/min离心10min，弃去沉淀，收集上清液，上清液过0.45μm微孔滤膜，收集滤液，冻干即为配体修饰的还原响应型磁性纳米载药复合物。