靶向survivin纳米抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物技术药物领域，更具体地讲，涉及一种利用七肽和十二肽作为互补决定区的非保守序列的纳米抗体的设计构建和制备方法。

背景技术：

肝癌是世界上发病率最高的恶性肿瘤之一。据报道，每年全球范围内的肝癌新发患者数量多达约75万，中国占其中的55％。目前治疗主要有手术切除、放射治疗和化学药物治疗。这些疗法对早期肝癌可获得较满意的效果，但对晚期肝癌且伴有局部扩散和远处转移者，疗效往往较差。而身体对放疗和化疗不良反应较大，放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常组织细胞也有影响。

生物靶向治疗是以肿瘤细胞过度表达的某些标志性分子为靶点，选择针对性地阻断、干预受该标志性分子调控和密切相关的信号传导通路，从而达到抑制肿瘤生长、进展及转移的效果。生物靶向治疗具有较好的分子选择性，能选择性、高效地杀伤肿瘤细胞，减少对正常组织的损伤。同时，为避免肿瘤细胞对药物产生耐药性，现在有越来越多的治疗策略是关于靶向凋亡抑制因子的，survivin就是其中之一。

Survivin是已知的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中最小的成员(142个氨基酸残基)，它的大小约为16.5kDa。与其他IAP家族成员的结构相比，survivin的结构较特殊：其他IAP家族成员的N末端是2-3个包含70个氨基酸残基的杆状病毒IAP重复序列(BIR)，C末端是一个锌指环的结构；而survivin的N末端是一个锌结合BIR域，C末端是一个长的α螺旋。单拷贝的survivin基因有六种剪接体，除了野生型的含3个内含子，4个外显子的survivin，还有五个survivin剪接体，分别为在外显子2和3之间插入69个碱基的survivin-2B，缺失一个外显子的survivin-△Ex3，隐藏于内含子3内的外显子3B取代外显子4的survivin-3B，由外显子1,2和来源于内含子2组成的survivin-2α，以及由外显子1,2和来源于内含子3组成的survivin-3α，这些survivin剪接体的转录和翻译已经被很多研究者证实了，这些剪接体在哺乳动物细胞的表达量要远高于正常组织。

在骆驼体内不仅存在着传统的四链抗体，还存在着天然缺失轻链的重链抗体(HCAb)。所有的骆驼科动物体内都存在重链抗体，但在其他偶蹄类动物中则没有发现重链抗体，重链抗体是由一个可变区域(variable domain，VHH)和两个恒定区域(constant domain，CH2和CH3)组成的，虽然它是天然缺失轻链以及重链的恒定区CH1的，但是重链抗体仍然具有可以与单克隆抗体可比拟的抗原结合力。更重要的是，单独克隆与表达重链抗体可变区，得到可以稳定存在并可以独立结合抗原的VHH抗体，由于VHH抗体的大小是在纳米级(直径2.5nm，高4nm)，因此VHH抗体也称为纳米抗体(Nb)。到目前为止，纳米抗体是已知最小的抗原结合片段、。

目前，获取特异性纳米抗体主要有两种方法，最为常用的方法是用特异性蛋白或者表达该种蛋白的细胞免疫骆驼科动物，使其大量产生重链抗体。随后，收集外周血淋巴细胞，用噬菌体展示技术构建特异性纳米抗体文库，再进行筛选鉴定，通过免疫骆驼科动物构建纳米抗体噬菌体文库能够保持纳米抗体功能多样性的完整，同时这也是一种简单而直观的过程，可以在较短的时间内获取高亲和力的特异性纳米抗体。然而，在有些条件下，这种方法是很难进行的，如：当抗原是具有高毒性和致病性的，是错误折叠的包涵体，是自我免疫抗原，或者是一些无免疫性的小分子化合物时，构建经免疫的纳米抗体噬菌体文库是非常困难的。在这种情况下，天然纳米抗体噬菌体文库是另外一种可选的方法，理论上它是可以跳过免疫而直接淘选出靶向任何抗原的特异性纳米抗体，然而，在已经报道的纳米抗体噬菌体文库库容量是1.6×10⁵-5×10⁹colony-forming units(CFU)/mL，较小的库容量加之非经免疫特异性不强，以及受到自身免疫耐受和所接触抗原的限制，因此很难筛选到高亲和力的纳米抗体。基于此，我们充分利用纳米抗体的结构：保守的框架区与非保守的决定其特异性的互补决定区，尝试一种新型的获取对survivin具有特异性亲和力的纳米抗体的方法。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供与survivin具有高亲和力的多肽组合。

本发明的第二个目的在于提供与survivin具有高亲和力的多肽组合在制备靶向survivin纳米抗体中的应用。

本发明的第三个目的在于提供靶向survivin纳米抗体的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供靶向survivin纳米抗体的制备方法制备获得的靶向survivin纳米抗体。

本发明的第五个目的在于提供靶向survivin纳米抗体在制备治疗肝癌药物中的应用。

本发明的第六个目的在于提供靶向survivin纳米抗体与细胞穿膜肽TAT融合表达的产物在制备治疗肝癌药物中的应用。

为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：与survivin具有高亲和力的多肽组合，其特征在于，所述多肽组合包括七肽和十二肽，所述七肽序列如SEQ ID NO：1——SEQ ID NO：5任一所示，所述十二肽序列如SEQ ID NO：6——SEQ ID NO：7任一所示。

作为一个优选方案，所述多肽组合为SEQ ID NO：1+SEQ ID NO：6组合，SEQ ID NO：2+SEQ ID NO：6组合，SEQ ID NO：4+SEQ ID NO：6组合，SEQ ID NO：1+SEQ ID NO：7组合，SEQ ID NO：4+SEQ ID NO：7组合。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：与survivin具有高亲和力的多肽组合在制备靶向survivin纳米抗体中的应用。

为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：靶向survivin纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将与survivin具有高亲和力的多肽组合作为纳米抗体互补决定区的非保守序列；

(2)通过基因操作将这些非保守序列分别整合到纳米抗体一致性框架中，获得嵌合纳米抗体。

为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：利用靶向survivin纳米抗体的制备方法制备获得的靶向survivin纳米抗体。

为实现本发明第五个目的，本发明公开以下技术方案：靶向survivin纳米抗体在制备治疗肝癌药物中的应用。

为实现本发明第六个目的，本发明公开以下技术方案：靶向survivin纳米抗体与细胞穿膜肽TAT融合表达的产物在制备治疗肝癌药物中的应用。

所述七肽序列Seq1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述七肽序列Seq2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述七肽序列Seq3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述七肽序列Seq4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述七肽序列Seq5的序列如SEQ ID NO：5所示。所述十二肽序列SeqA的序列如SEQ ID NO：6所示，所述十二肽序列SeqB的序列如SEQ ID NO：7所示。

七肽和十二肽的组合方式为seq1-seqA，seq2-seqA，seq3-seqA，seq4-seqA，seq5-seqA，seq1-seqB，seq2-seqB，seq3-seqB，seq4-seqB，seq5-seqB。

七肽序列Seq1的序列：ARTKQTA(SEQ ID NO：1)(丙氨酸—精氨酸—苏氨酸—赖氨酸—谷氨酰胺—苏氨酸—丙氨酸)

七肽序列Seq2的序列：ATKSNLI(SEQ ID NO：2)(丙氨酸—苏氨酸—赖氨酸—丝氨酸—天冬酰胺—亮氨酸—异亮氨酸)

七肽序列Seq3的序列：DNSHTHT(SEQ ID NO：3)(天冬氨酸—天冬酰胺—丝氨酸—组氨酸—苏氨酸—组氨酸—苏氨酸)

七肽序列Seq4的序列：SQLPFHH(SEQ ID NO：4)(丝氨酸—谷氨酰胺—亮氨酸—脯氨酸—苯丙氨酸—组氨酸—组氨酸)

七肽序列Seq5的序列：SLLGQTP(SEQ ID NO：5)(丝氨酸—亮氨酸—亮氨酸—甘氨酸—谷氨酰胺—苏氨酸—脯氨酸)

十二肽序列SeqA的序列：SGVYKVAYDWQH(SEQ ID NO：6)(丝氨酸—甘氨酸—缬氨酸—酪氨酸—赖氨酸—缬氨酸—丙氨酸—酪氨酸—天冬氨酸—色氨酸—谷氨酰胺—组氨酸)

十二肽序列SeqB的序列：SPTVSDWMPIYI(SEQ ID NO：7)(丝氨酸—脯氨酸—苏氨酸—缬氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—色氨酸—甲硫氨酸—脯氨酸—异亮氨酸—酪氨酸—异亮氨酸)

为实现获取靶向survivin纳米抗体的目的，在获取其保守框架的基础上，最主要的是获取与survivin具有高亲和力的多肽作为CDR1，CDR2与CDR3的survivin结合环。将原始纳米抗体序列与一些癌症相关因子(如EGFR，bax，VEGF)的特异性纳米抗体序列比对，我们最终确定CDR1非保守区域的氨基酸残基数目为4个，CDR2非保守区域的氨基酸残基数目为7个，CDR3非保守区域的氨基酸残基数目为12个。据报道，survivin可以识别Smac N末端的A1-V2-P3-I4，因此靶向survivin纳米抗体的CDR1的非保守区域选用该序列。对于更长的CDR2及CDR3序列的非保守区域，我们从库容量为1.5×10¹³PFU/ml的随机七肽与十二肽噬菌体展示文库中以survivin为靶分子筛选得到。

本发明的优点在于：从随机七肽与十二肽噬菌体展示文库中筛选与survivin结合能力强的七肽及十二肽作为纳米抗体互补决定区的非保守序列，通过基因操作将这些非保守序列分别整合到纳米抗体一致性框架中，共获得10种嵌合纳米抗体。进一步从ELISA，MTT，流式检测凋亡实验中发现，TAT-Nb4A(纳米抗体Nb4A与细胞穿膜肽TAT融合表达)展现了最好的效果。单克隆抗体由于鼠源内源性免疫原性所引起的不良免疫反应经常会导致免疫系统产生排异反应，人源化困难，另外，较大的体积也使单克隆抗体具有较弱的组织渗透能力，这使得其在与肿瘤相互作用过程中超过80％的单克隆抗体是不起作用的。本发明制备的纳米抗体体积小，免疫原性小，稳定性好，可溶性高，吸收好，人源化简单，表达容易，偶联其他分子容易，并可用于诊断\成像\示踪。因此，作为抗体药物有着广阔的应用前景。

附图说明

图1为PCR扩增survivin电泳图，泳道M:DL2000Marker；泳道1：survivin基因。

图2为survivin双酶切PCR产物，泳道M:DL2000Marker；泳道1，2：双酶切PCR产物。

图3为双酶切pET-24a质粒，泳道M:DL2000Marker；泳道1：双酶切的pET-24a质粒；泳道2：pET-24a质粒。

图4为菌液PCR鉴定阳性克隆子，泳道M:DL2000Marker；泳道1-4：Survivin基因。

图5为蛋白电泳分析纯化survivin蛋白。泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1-6：400mM咪唑洗脱收集液。

图6为蛋白电泳分析透析的survivin，泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1，2：复性的survivin蛋白。

图7为ELISA鉴定survivin结合的阳性噬菌体克隆子。

图8为PCR扩增替换的CDR2序列的纳米抗体上游片段，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb2A基因的上游片段；泳道2：Nb3A基因的上游片段；泳道3：Nb4A基因的上游片段；泳道4：Nb5A基因的上游片段。

图9为PCR扩增替换的CDR2序列的纳米抗体下游片段，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb2A基因的下游片段；泳道2：Nb3A基因的下游片段；泳道3：Nb4A基因的下游片段；泳道4：Nb5A基因的下游片段。

图10为PCR扩增替换CDR2序列的纳米抗体的全长，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb2A基因；泳道2：Nb3A基因；泳道3：Nb4A基因；泳道4：Nb5A基因。

图11为PCR扩增替换的CDR3序列的纳米抗体，泳道M:DL1000Marker；泳道1,2：Nb1B基因的上游片段；泳道3,4：Nb2B基因的上游片段；泳道5,6：Nb3B基因的上游片段；泳道7,8：Nb4B基因的上游片段；泳道9,10：Nb5B基因的上游片段。

图12为PCR扩增替换的CDR3序列的纳米抗体下游片段，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb1B基因的下游片段；泳道2：Nb2B基因的下游片段；泳道3：Nb3B基因的下游片段；泳道4：Nb4B基因的下游片段；泳道4：Nb5B基因的下游片段。

图13为PCR扩增替换CD3序列的纳米抗体的全长，泳道M:DL1000Marker；泳道1：Nb1B基因；泳道2：Nb2B基因；泳道3：Nb3B基因；泳道4：Nb4B基因；泳道5：Nb5B基因。

图14为蛋白电泳分析纯化的10种纳米抗体，泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1：Nb1A；泳道2：Nb2A；泳道3：Nb3A；泳道4：Nb4A；泳道5：Nb5A；泳道6：Nb1B；泳道7：Nb2B；泳道8：Nb3B；泳道9：Nb4B泳道10：Nb5B。

图15为纳米抗体与survivin之间亲和力大小。

图16为PCR扩增TAT-Nbs，泳道M:DL1000Marker；泳道1：TAT-Nb1A基因；泳道2：TAT-Nb2A基因；泳道3：TAT-Nb4A基因的上游片段；泳道4：TAT-Nb1B基因；泳道5：TAT-Nb4B基因。

图17为纯化的TAT-Nbs的蛋白电泳图，泳道M:低分子量蛋白Marker；泳道1：TAT-Nb1A蛋白；泳道2：TAT-Nb2A蛋白；泳道3：TAT-Nb4A蛋白；泳道4：TAT-Nb1B蛋白；泳道5：TAT-Nb4B蛋白。

图18为MTT实验分析抗survivin TAT-Nbs对HepG2与QSG-7701的细胞存活，A.将浓度分别为20，40，60，80，100μg/mL的TAT-Nb1A，TAT-Nb2A，TAT-Nb4A，TAT-Nb1B及TAT-Nb4B分别作用HepG2与QSG-7701细胞48小时的MTT检测。B.将浓度为80μg/mL的TAT-Nb1A，TAT-Nb2A，TAT-Nb4A，TAT-Nb1B及TAT-Nb4B分别作用HepG2与QSG-7701细胞4，12，24，36及48小时的MTT检测。

图19为TAT-Nb1A and TAT-Nb4A对细胞形态的影响。

图20为流式检测TAT-Nb1A与TAT-Nb4A对HepG2细胞诱导凋亡能力。

图21为Western blotting分析TAT-Nb4A作用后HepG2中survivin与β-actin的表达。

图22为获得的抗原特异性的纳米抗体(Nbs)策略图示。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.运用七肽与十二肽噬菌体文库筛选survivin结合多肽

主要材料及试剂

主要设备

主要溶液配制

扩增survivin的基因序列，以表达survivin蛋白的酵母菌质粒为模板，扩增survivin基因序列(图1)，PCR扩增survivin序列的纯化采用DNA片段回收试剂盒进行。

从过夜培养的含有pET-24a质粒的大肠杆菌中抽提质粒，双酶切PCR产物与质粒(图2，3)，将双酶切的survivin基因序列与pET-24a质粒过夜连接。

转化：

①将连接产物吸取到感受态的EP管中，混合均匀。

②将上述EP管冰浴30min。

③在42℃恒温水浴中热激90sec，热激后迅速再冰浴15min。

④在上述EP管中加入不含抗生素的800μl LB培养基，200rpm 37℃条件下培养1小时。

⑤将菌液在10000rpm条件下离心1min，吸取200μl离心上清液混匀沉淀，在平板上用玻璃珠辅助涂匀菌液，倒置并于37℃条件下过夜培养。

⑥用接种环挑取获得的单克隆，在5mL LB培养基中培养8-10h，进行菌液PCR鉴定(图4)。将阳性克隆送至测序(公司：上海睿迪生物科技)。

将测序结果与survivin基因序列进行比对，将测序正确的含survivin基因序列的质粒取1μl转化至E.coli BL21感受态中，步骤。挑取过夜培养获得的单克隆加入到5mL含5μl 50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养，再吸取1mL加入至含100mL，100μl 50mg/mL卡那霉素LB液体培养基的500mL的培养瓶中，培养至培养基出现浑浊，OD约为0.6(约2.5h左右)时，加入70-80μl浓度为1mol/l IPTG诱导，在培养温度30℃，转速为200rpm左右的条件下诱导10h或者过夜。

Survivin蛋白的纯化

①将survivin过夜诱导物于转速为8000rpm条件下离心10min，弃去上清液。

②在沉淀的菌体中加入20-30mL破菌缓冲液并吹打均匀，用超声破碎仪破碎：功率为120w左右，超声时间为3s，间歇时间为5s，循环为99个，重复3次。

③将破碎后的菌体于4℃，12000rpm条件下离心15min，将上清液放置于冰浴盒中保存；离心获得的沉淀加入10mL溶解缓冲液，在离心管内加入转子，在磁力搅拌器上溶解包涵体。

④待上述包涵体全部溶解后，取出转子，在4℃，10000rpm条件下离心10min，用0.45μm滤膜过滤离心所获上清液后置于冰浴盒中保存。

⑤在蛋白纯化柱中加入1mL预先混匀的镍填料，再加入超纯水与破菌缓冲液平衡蛋白纯化镊柱。

⑥分别向镊柱中加入冰浴盒中保存的上清液与包涵体溶解液，为增加survivin与镊柱结合率，每种分别加两遍(survivin在上清液中少量表达，在包涵体中大量表达)。然后，加入包涵体结合缓冲液与包涵体洗涤缓冲液去除膜蛋白等杂蛋白，当镊柱中仅剩有少量的洗涤缓冲液后，加入包涵体洗脱缓冲液，待洗涤缓冲液全部流出后，用1.5mL EP管收集流出的survivin蛋白。收集之后，向镊柱中加入超纯水清洗，并加入20％的乙醇，于4℃保存。

⑦将获得的survivin蛋白用蛋白电泳检测其纯化情况(图5)。

Survivin蛋白的透析及浓缩

处理透析袋：

①用剪刀将透析袋剪成约为15cm左右的长度。

②将透析袋放入含有500mL 2％(w/v)NaHCO₃以及pH为8.0的1mmol/L EDTA₂Na的烧杯中，并用高压灭菌锅在100℃煮沸10min。

③用去离子水洗净透析袋，并放置于500mL pH为8.0的1mmol/LEDTA₂Na的溶液中在100℃的条件下煮沸10min。

④冷却后，将处理好的透析袋放于50％乙醇中后置于4℃冰箱中保存。

将纯化好的survivin蛋白收集液与适量溶解缓冲液一并加入透析袋中，用夹子夹好后，置于透析液(1.5L透析液：30mL Tris母液，43.8g NaCl，360g脲素)中，置于4℃冰箱中，在磁力搅拌器中透析。期间，更换透析液两次，脲素浓度逐渐降低(4mol/L→2mol/L→0)。

将透析好的survivin蛋白取样用蛋白电泳检测(图6)，并在4℃，10000rpm条件下离心10min，将上清液加入到预先用超纯水清洗的超滤管中并在4℃，4000g条件下浓缩。

采用Bradford工作液测定survivin的浓度

①配置Bradford工作液：称取重量为50mg的G-250(考马斯亮兰)，溶解于25ml 95％的乙醇中，再加入85％的磷酸60ml后，用超纯水定容至500ml。

②将浓度为1mg/mL的BSA标准品配成8个不同的浓度梯度，分别加入190μL Bradford工作液，每个浓度的样品各取10μL至96孔板中，反应5min后，在OD595nm的波长下测定酶标仪读数，并绘制出蛋白浓度测定所需要的标准曲线。

③取190μL Bradford工作液于96孔板中，再加入浓缩并经稀释的survivin

10μL，同样反应5min后读数，根据读数计算survivin浓度。

以survivin为靶分子，淘选与其结合的七肽与十二肽

分别以survivin为靶分子从噬菌体七肽库及十二肽库中进项四轮筛选，以下步骤以第一轮淘选为例，在随后的淘选中淘选条件越来越严苛以便淘汰与survivin结合能力不强的噬菌体：第一轮：survivin浓度为100μg/mL，TBST浓度为0.1％，survivin与噬菌体结合时间为60min；第二轮：survivin浓度为70μg/mL，TBST浓度为0.3％，survivin与噬菌体结合时间为50min；第三轮：survivin浓度为40μg/mL，TBST浓度为0.5％，survivin与噬菌体结合时间为40min；第四轮：survivin浓度为10μg/mL，TBST浓度为0.5％，survivin与噬菌体结合时间为30min。

①用包被液稀释浓缩后的survivin使其浓度为100μg/mL，将其包被到96孔板中，每孔中150μL，用超纯水润湿纸巾，包裹96孔板外，并在最外层用保鲜膜密封，以保持其湿润，并在400rpm的条件下在4℃冰箱中轻微震荡包被过夜。

②将包被液与蛋白混合液倒出，在干净纸巾上拍甩，使96孔板上只留有包被在孔板上的survivin蛋白，每孔中加满封闭液用以封闭没有包被survivin的位点，4℃放置1h。

③如步骤②中方法倒出封闭液，用排枪加入0.1％TBST洗板6次，每次洗过之后在干净纸巾上拍甩，以确保TBST缓冲液全部倒出。

④10μL原始噬菌体七肽库/十二肽库(每次保证所加噬菌体的滴度10¹¹)，各加入990μL 0.1％TBST进行稀释混匀，在每个孔中加入100μL，在室温下温和震荡孔板60min。

⑤如步骤②中方法倒出噬菌体培养液，如步骤③中方法洗板10次。

⑥加入噬菌体洗脱缓冲液，在室温条件下温和震荡孔板15min，将洗脱下来的能与survivin结合的噬菌体吸取至15mL EP管中，在EP管中加入1.44mL噬菌体中和缓冲液，放置于4℃。得到的噬菌体通过扩增实验进行下一轮的筛选。

噬菌体滴度的测定

①挑取M13噬菌体宿主ER2738的单克隆，接种于5mL低盐LB培养基中培养，约培养4.5h使其OD600nm在0.5左右。

②用微波炉将顶层琼脂融化，在灭菌的试管中分装3mL，噬菌体有几个稀释倍数，就分装几个试管，保存于45℃烘箱中。同时，将与试管相同数目的LB/IPTG/Xgal平板置于37℃培养箱中预热。

③用低盐LB培养基稀释并混匀待测噬菌体，以10倍的稀释倍数递增，一般情况下，未经过扩增的噬菌体的稀释倍数通常在10¹-10⁴，已经扩增的噬菌体稀释倍数通常在10⁸-10¹¹。

④将处于对数中期的ER2738菌液分装于与稀释梯度数目相同的1.5mL EP管中，每个EP管200μL。

⑤将上述EP管中加入10μL第一个稀释倍数的待测噬菌体，混匀后加入预先预热的顶层琼脂，快速加入至LB/IPTG/Xgal平板内并旋转混匀，待其凝固冷却后在37℃培养箱中过夜倒置培养。然后再以相同的方法处理其余稀释倍数的噬菌体。

⑥对出现1-100个蓝斑的平板计数，计算噬菌体的滴度。若所有平板的蓝斑数都超过100，则增加稀释倍数；反之，若所有平板都没出现蓝斑，则降低稀释倍数。

噬菌体的扩增及提纯

①将淘选过程中洗脱下来的噬菌体连同ER2738过夜培养物置于低盐LB培养基中震荡培养约4.5h，使噬菌体侵染ER2738，并在其宿主扩增的过程中完成其本身的扩增。

②将混合培养液在4℃，12000g的条件下离心10min，将上清液装入另一新的离心管再在相同条件下离心，再一次将上清液转入新的离心管中，并用上清液1/6体积的PEG/NaCl作用，在4℃冰箱中过夜放置。

③将上述培养液在4℃，12000g的条件下离心15min，收集沉淀，重悬于1mL TBS并转入1.5mL EP管中离心5min收集上清液。

④加入上述上清液1/6体积的PEG/NaCl作用，冰上孵育60min。

⑤4℃，12000g的条件下离心10min，将沉淀溶于200μL TBS中，置于4℃冰箱保存。

ELISA鉴定阳性克隆

①在96孔板中分别包被100μg/mL的survivin与BSA，包被方法同淘选步骤。

②弃包被液，加入ELISA鉴定用的封闭液，在4℃条件下封阻2h。

③弃封闭液，用0.1％TBST洗板6次，每孔中加入待鉴定的已经扩增的噬菌体，保证survivin包被板与BSA包被板加入相同浓度与相同体积展示同种序列的噬菌体作用2h。

④弃噬菌体培养液，用0.1％TBST洗板6次，每孔加入200μL稀释的HRP标记的抗M13噬菌体抗体室温震荡1h。

⑤取21mL提前配置好的ABTS储液加入36μL 30％的H₂O₂混合均匀，弃去抗体稀释液，用0.1％TBST洗板6次，在每孔加入200μL ABTS与H₂O₂混合液，室温震荡10-15min，用酶标仪在OD410nm条件下读数(图7)。抽提所选的克隆的DNA

①对扩增的ELISA阳性噬菌体克隆在4℃，12000g条件下离心处理30sec。

②加入200μl PEG/NaCl并室温静置10min沉淀噬菌体。

③4℃，12000g离心10min，加入100μl碘化物缓冲液重悬沉淀的噬菌体。

④在上述EP管中加入250μl纯乙醇，室温静置10min后离心处理，并用70％的乙醇洗沉淀，置60℃烘箱中10min，使乙醇完全蒸发，避免其影响后面测序。

⑥用30μl ddH₂O重悬沉淀，得到阳性噬菌体的单链DNA进行测序。

实施例2.嵌合纳米抗体的构建表达纯化及其与survivin之间亲和力的测定质粒及菌株

主要仪器及设备

分子克隆实验所需试剂与试剂盒

所用其他试剂

构建质粒所需试剂配制

蛋白表达纯化所需试剂配制

蛋白电泳所需试剂配制

全基因合成Nb1A(由seq1与seqA组合，含HA标签，FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3)的序列，在此基础上对其CDR2与CDR3的非保守区的序列进行替换。

运用重叠的引物特异性替换CDR2与CDR3

Fusion PCR替换纳米抗体CDR2的基因序列分为三步PCR：①以合成的含有NdeI和XhoI酶切位点的Nb1A的基因序列为模板，分别以F1，R1-2a为引物进行PCR替换获得Nb2A基因序列上游片段(图8)，以F2-2a，R1为引物扩增Nb2A基因序列的下游片段(替换的序列分别在由引物R1-2a与F2-2a中引入，上游片段与下游片段含有一段含有替换序列的重叠链)(图9)；②以胶回收纯化的Nb2A基因序列的上游片段与下游片段互为模板，F1，R1为引物进行PCR，可以获得Nb2A的基因序列全长(图10)。

Fusion PCR替换纳米抗体CDR3的基因序列分为三步PCR：①以合成的含有NdeI和XhoI酶切位点的Nb1A的基因序列为模板，分别以F1，R1-1为引物PCR替换获得Nb1B基因序列的上游片段(图11)，以F1-1，R1为引物扩增Nb1B基因序列的下游片段(图12)，(替换的序列分别在由引物R1-1与F1-1中引入，上游片段与下游片段含有一段含有替换序列的重叠链)；②以胶回收纯化的Nb1B基因序列的上游片段与下游片段互为模板，F1，R1为引物进行PCR，可以获得Nb1B的基因序列全长(图13)。

纳米抗体的纯化

①8000rpm，离心10min收集菌体，并用25-30mL裂解液裂解菌体。

②用匀浆机破碎菌体，压力为1000bar左右，破碎后在4℃，12000rpm条件下离心，用含脲素的缓冲液溶解沉淀，将上清液与溶解的沉淀跑蛋白电泳鉴定纳米抗体是是可溶性表达还是包涵体表达。

③包涵体沉淀以裂解液相同体积的Buffer I(含2％曲拉通X100)重悬，37℃，200rpm条件下振荡30min。

④4℃，8000g条件下离心10min，收集沉淀并以相同体积的Buffer I重悬，超声破碎悬浮液。

⑤4℃，8000g条件下离心10min，收集沉淀并以相同体积的BufferI(含2％曲拉通X100)重悬，37℃，200rpm条件下振荡30min。

⑥4℃，8000g条件下离心10min，收集沉淀并以相同体积的Buffer I重悬，37℃，200rpm条件下振荡30min。

⑦4℃，8000g条件下离心10min，收集沉淀并以相同体积的2mol/L脲素溶解，低温搅拌30min。

⑧4℃，8000g条件下离心10min，收集上清液，蛋白电泳检测2mol/L脲素的包涵体溶解液所含纳米抗体情况。沉淀继续以相同体积的4mol/L脲素溶解，低温搅拌30min。

⑨4℃，8000g条件下离心10min，收集上清液，蛋白电泳检测4mol/L脲素的包涵体溶解液所含纳米抗体情况。沉淀继续以相同体积的8mol/L脲素溶解，低温搅拌30min。

⑩4℃，12000g条件下离心10min，收集上清液，几乎所有沉淀都溶解在8mol/L脲素中，弃去未溶解的沉淀，蛋白电泳检测8mol/L脲素的包涵体溶解液所含纳米抗体情况。

鉴定纳米抗体抗体纯化效果

蛋白电泳(SDS-PAGE)分析纯化结果

①将配蛋白胶所用的玻璃板冲洗干净，用吹风机吹干待用。

②将玻璃板放置在配胶架上夹紧，在胶板缝隙加满超纯水并放置10min验证是否漏水。如不漏水，用剪好的滤纸擦干胶板缝隙。

③在烧杯中加入各组分配置分离胶(15％)，并混匀沿胶板缝隙缓慢加入，避免产生气泡，剩下部分用无水乙醇补齐以压平分离胶放置30min。

④倒出乙醇，用剪好的滤纸擦干，在烧杯中加入各组分配置浓缩胶(5％)，并混匀沿胶板缝隙缓慢加入，避免产生气泡，加好后放入梳子，放置30min。

⑤取30μl蛋白样品，向样品中加入10μl 4×loading buffer，沸水煮10min使蛋白变性，期间，将玻璃板放置于电泳槽中，并加入1×蛋白电泳缓冲液，将梳子缓慢并垂直拔出。

⑥加入10μl蛋白marker，再依次加入蛋白样品，每孔中加入20μl，加好后连同电极，调节电压为80V，电泳槽中会出现不断上升的气泡。

⑦待样品跑过分离胶时加大电压至120V，当样品跑至玻璃板底部时关闭电源，撬开玻璃板将蛋白胶拿出放置染色盘中，加入染色液，将染色盘放置在振荡器中至少振荡6h。

⑧将染色液回收，用自来水冲洗蛋白胶2次，加入脱色液，在振荡器中振荡脱色，若脱色液变蓝，更换脱色液，直到出现清晰条带，将蛋白胶置于UVItec凝胶成像仪拍照并保存(图14)。

纯化后的纳米抗体与survivin之间的亲和力是鉴于纳米抗体的HA标签，进而通过ELISA方法测定。简单地说，将两种浓度的survivin(5和10μg/mL)包被在96孔板中，相同浓度的BSA作为阴性对照也与survivin以同样的条件包被在孔板中，在用5％脱脂乳粉37℃封闭1h(再用TBST清洗)，在不同浓度的survivin与BSA孔中分别加入4种不同浓度(1.25，2.5，5和10μg/mL)的10种纳米抗体(Nb1A，Nb2A，Nb3A，Nb4A，Nb5A，Nb1B，Nb2B，Nb3B，Nb4B，Nb5B)室温孵育30min(再用TBST清洗)，再在孔板中加入HRP标记的抗HA的抗体(稀释比例1:1000)，室温孵育30min(再用TBST清洗)，最后加入HRP底物ABTS，作用10-15min，设置酶标仪波长为OD410nm并读数。每种纳米抗体与survivin之间亲和力的计算公式如下：

Ag/Ag’＝n

Kaff＝n-1/2([Nb’]-[Nb])

最终，获得5种与survivin有较高亲和力的纳米抗体(图15)，分别为Nb1A，Nb2A，Nb4A，Nb1B，Nb4B，选择这5种纳米抗体进行后续实验。

实施例3.靶向survivin纳米抗体对肝癌HepG2细胞活性的研究细胞株

人肝癌细胞HepG2与正常肝细胞QSG-7701为实验室储存。细胞株的培养基成分为含10％胎牛血清，100mg/mL链霉素，100unit/mL青霉素的DMEM，在37℃，5％CO2的条件下培养。

主要仪器

主要试剂

主要试剂配制

TAT基因序列是通过TAT-F1及R1两个引物加入在纳米抗体(Nb1A,Nb2A,Nb4A,Nb1B,Nb4B)的N末端(，使PCR扩增产物与pET-24a都具有相同的酶切位点(NdeI与XhoI)(图16)，通过双酶切产生相同的粘性末端，再连接转化，挑单克隆测序，将测序比对正确的序列的质粒转化至E.coli BL21中，再诱导表达，包涵体洗涤方法纯化5种TAT-Nbs(图17)，再用Bradford方法测定蛋白浓度。

在塑料杯中装入温水调节其温度为37℃，从液氮罐中迅速取出细胞，放置塑料杯中使其溶解，将其移入到培养瓶中，加入9mL培养基，混匀，置于37℃，5％CO₂的培养箱中过夜培养，第二天更换新鲜培养基，弃漂浮死细胞后继续培养。

将置于4℃保存的培养基与-20℃保存的胰酶放在37℃培养箱中预热，用倒置显微镜观察细胞形态以及细胞的增殖状态，当细胞增殖数目未达到80％出现漂浮细胞时，弃去原培养基，用PBS清洗两遍细胞，加入4mL新鲜培养基继续培养；当细胞铺满细胞瓶的80％以上体积时，弃去原培养基，加入500μL预热的胰酶，消化30sec左右，吸去胰酶，拍打培养瓶，当看到细胞下滑时，加入4mL新鲜培养基，沿培养瓶瓶壁用无菌吸管吹打细胞使其形成单细胞悬液后，吸取一半的细胞并移至另一培养瓶中继续培养，在原细胞培养瓶与新细胞培养瓶中加入培养基，使其最终体积均为4mL，再将两个培养瓶放入培养箱中继续培养。

当培养瓶底层铺满细胞时，弃去原培养基，用PBS洗两遍，弃去PBS，加入胰酶消化，加入新培养基终止消化并吹打细胞使其形成单细胞悬液，移入至离心管中，在4℃，900rpm的条件下离心8min，弃去上清液，在沉淀中加入1mL细胞冻存液悬浮沉淀，再移入细胞冻存管中盖紧盖子。将冻存管置于4℃冰箱30min后，转入-20℃冰箱2h,再转入-80℃冰箱过夜，第二天转入液氮罐中长期保存。

TAT-Nbs对HepG2及QSG-7701细胞生长活性的抑制是通过MTT实验来测定的，其原理为：活细胞线粒体中细胞色素C和琥珀酸脱氢酶可以使MTT生成蓝紫色的结晶甲瓒，形成的甲瓒结晶可以进一步在DMSO中溶解，因此，甲瓒的生成量与活细胞的数目是成正比的，而死细胞中由于缺乏琥珀酸脱氢酶而缺少甲瓒结晶，因此该方法可以区分活细胞与死细胞，及确定细胞存活率。具体实验步骤如下：

①纯化好TAT-Nb1A，TAT-Nb2A，TAT-Nb4A，TAT-Nb1B，TAT-Nb4B五种蛋白置于-20℃保存备用。

②当肝癌细胞HepG2与正常肝细胞QSG-7701两种细胞铺满细胞培养瓶底部时，用胰酶消化处理细胞成单细胞悬液，并用细胞计数板计数，取合适体积的细胞加入15mL离心管中，加培养基至15mL，且稀释后的细胞浓度为2×10⁴个/ml。

③将稀释的细胞加入96孔板中，在超净台“划十字”以使细胞均匀分布在孔板中，再放置培养箱中培养，待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入培养基稀释的蛋白或只加入培养基(将测定的浓度较高的蛋白加入培养基稀释，使五种蛋白浓度分别为100μg/mL，80μg/mL，60μg/mL，40μg/mL，20μg/mL，0μg/mL，并将每个浓度的TAT-Nbs装于2mLEP管中待用)，做6个实验组平行孔，每孔加入200μL蛋白；12个对照组平行孔，每孔加入200μL培养基，放置培养箱中培养4h，12h，24h，36h以及48h，期间，用倒置显微镜观察HepG2及QSG-7701两种细胞的细胞形态是否发生变化(图19)。

④在每个实验孔与对照孔中加入20μL预先配置好的，在-20℃避光保存的浓度为5mg/ml MTT溶液，再继续培养4h。

⑤吸去孔板中的液体，每孔加入150μL DMSO，在振荡器上振动10min，在酶标仪OD 490nm读数，同时参考OD 570nm的读数。

⑥计算细胞存活率(图18)。

选择对肝癌细胞HepG2细胞的生长活性有较强抑制能力的anti-survivin TAT-Nbs进一步采用Annexin V-FITC/PI双染法检测其细胞凋亡率，其原理为：在活细胞中，磷酯酰丝氨酸只会分布在细胞膜磷脂双分子层里侧，而在早期凋亡的细胞中，磷酯酰丝氨酸会侧翻并暴露在磷脂双分子层外侧，而Annexin V可以与磷脂酰丝氨酸发生特异性地结合，因此可检测到暴露在细胞膜外的磷脂酰丝氨酸的早凋亡的细胞；对于活细胞，PI不能透过完整的细胞膜对细胞染色，而对于死细胞或者是凋亡中晚期的细胞，PI可以透过细胞膜进而对细胞染色，因此，Annexin V-FITC/PI可以检测处于不同凋亡时期的细胞及死细胞，再用流式细胞仪进行检测。其具体的实验过程为：

①将铺满细胞培养瓶中的HepG2细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液，用培养基稀释HepG2细胞为合适的密度并铺在6孔板中，在超净台“划十字”使细胞分布均匀，置于37℃细胞培养箱中培养。

②过夜培养后，吸去6孔板中的原培养基，加入2mL新鲜培养基稀释的不同蛋白浓度加入到6孔板中(将测定的浓度较高的蛋白加入培养基稀释，使蛋白浓度分别为120μg/mL，80μg/mL，40μg/mL，0μg/mL)在37℃细胞培养箱中培养48h。

③从细胞培养箱中取出6孔板，将每个孔的培养基分别转移到不同的2mLEP管中，并用PBS洗6孔板2次，再向每个孔中加入200μl 37℃预热的胰酶，当细胞变圆并脱落的时候，吸去胰酶，并加入EP管中的培养基，用移液枪吹打并分散细胞，移入至原培养基所在EP管中，4℃，2000rpm条件下离心15min。

④弃去上清液，用PBS重悬沉淀的细胞，4℃，2000rpm条件下离心10min。

⑤重复④的步骤。

⑥弃去上清液，吸取500μl凋亡试剂盒附带的Binding Buffer，重悬细胞，避光条件下在细胞中加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀，在细胞培养箱中避光孵育15min。

⑦在细胞中加入5μl PI溶液，在细胞培养箱中继续避光孵育10min后，将EP管避光放在冰盒中，在波长为488nm处用流式细胞仪检测各样品的荧光强度，并分析各个凋亡时期的细胞的比例。

选择对肝癌HepG2细胞有较强促凋亡能力TAT-Nb，分析经TAT-Nb作用后，细胞内survivin表达水平与未经TAT-Nb作用的细胞内survivin表达水平是否出现差异，同时选择在MTT实验中对HepG2细胞生长抑制效果不好的

TAT-Nb2A作为阴性对照。其具体的实验过程为：

①将铺满细胞培养瓶中的HepG2细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液，用培养基稀释HepG2细胞为合适的密度并铺在6孔板中，在超净台“划十字”使细胞分布均匀，置于37℃细胞培养箱中培养。

②过夜培养后，吸去6孔板中的原培养基，加入2mL新鲜培养基稀释的不同蛋白浓度加入到6孔板中(将测定的浓度较高的的蛋白加入培养基稀释，使蛋白浓度分别为120μg/mL，80μg/mL，40μg/mL，0μg/mL，TAT-Nb2A的浓度为120μg/mL)在37℃细胞培养箱中培养48h。

③吸去培养基，加入PBS，用刮刀刮取孔板中的细胞并收集到2mL EP管中，4℃，1000rpm的条件下离心10min收集细胞，用预冷的PBS重悬细胞，并与上一步相同的条件离心，弃去上清液，加入细胞裂解液，用移液枪吹打混匀，并在冰盒上裂解30min，期间，每隔5min用移液枪吹打几次。

④4℃，1500rpm的条件下离心10min，收集上清液，并用PBS稀释20倍(取出2μL，加入38μL PBS)用Bradford方法测总蛋白的浓度，根据测定的蛋白浓度，量取一定体积使每个实验样品的总蛋白为50μg。

⑤配置蛋白电泳胶，将预染marker及加入loading buffer煮沸处理过的蛋白样品，加到进样孔中，打开电源并调节电压为80V，当溴酚蓝跑过浓缩胶后调节电压至100V，当溴酚蓝跑至胶板底部时停止电泳。

⑥将电泳胶小心从玻璃板中分离出来并浸泡在转膜缓冲液中，切去浓缩胶，并按照预染marker显示出来的各条带的位置，将survivin及β-actin分子量大小的部分分别剪下，裁剪与蛋白电泳胶大小一致的PVDF膜，裁剪后，将PVDF膜在甲醇中浸泡活化5min，同时将3张用转膜缓冲液浸湿的滤纸铺在湿转仪的阳极碳板上，将蛋白胶整齐放置于滤纸上，再将PVDF膜用镊子小心盖在蛋白胶上，此过程避免出现气泡，最后在PVDF膜上再盖上3张浸湿的滤纸，以及在滤纸上盖上负极板，打开电源调节电压为60V，恒压转膜时间约为2h。

⑦电转结束后，将PVDF膜放于封闭液中，在振荡器上室温封闭2h。弃去封闭液，将PVDF膜放入封闭袋中，在含有survivin目标条带大小的封闭袋中加入封闭液稀释的survivin抗体(稀释比例为1:1000)；在含有β-actin目标条带大小的封闭袋中加入封闭液稀释的β-actin抗体(稀释比例为1:2000)，将封闭袋固定在旋转仪上，将旋转仪放入4℃冰箱中，过夜孵育一抗。

⑧取出PVDF膜，同时回收survivin与β-actin抗体。并用TBST缓冲液洗涤15min，期间，每隔5min换一次TBST。

⑨将PVDF膜分别转入封闭液稀释的羊抗兔IgG-HRP二抗及羊抗鼠IgG-HRP二抗中(稀释比例均为1:2000)，室温摇晃孵育1h。

⑩取出PVDF膜并用TBST缓冲液洗涤30min，期间，每隔5min换一次TBST。再将PVDF放入凝胶成像仪中，每次加200μL配置好的ECL试剂，将PVDF中含蛋白的那一面朝上放置，选择合适的曝光时间拍照(图21)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 靶向survivin纳米抗体及其制备方法和应用

<130> /

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Ala Thr Lys Ser Asn Leu Ile

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Asp Asn Ser His Thr His Thr

1 5

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Ser Gln Leu Pro Phe His His

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Ser Leu Leu Gly Gln Thr Pro

1 5

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<212> PRT

<213> 人工合成

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Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His

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<212> PRT

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Ser Pro Thr Val Ser Asp Trp Met Pro Ile Tyr Ile

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<212> DNA

<213> 人工合成

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cataataaat cagattgctt ttggttgcaa tggcggccac aaattcgcgt tc 52

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccattgcaac caaaagcaat ctgatttatt atgccgatag cgtgaaag 48

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<211> 52

<212> DNA

<213> 人工合成

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cataataggt atgggtatgg ctattatcaa tggcggccac aaattcgcgt tc 52

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccattgataa tagccatacc catacctatt atgccgatag cgtgaaag 48

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<212> DNA

<213> 人工合成

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cataataatg atgaaacggc agctggctaa tggcggccac aaattcgcgt tc 52

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccattagcca gctgccgttt catcattatt atgccgatag cgtgaaag 48

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cataatacgg ggtctgaccc agcaggctgg cggccacaaa ttcgcgttc 49

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ccattagcct gctgggtcag accccgtatt atgccgatag cgtgaaag 48

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<213> 人工合成

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ggccccaata cggttcgctt ttctgtgcaa tcggaacggc ggcgcaataa taaacggc 58

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<212> DNA

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ggaattccat atgtatccgt atgatgtgcc ggattatg 38

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccgctcgagg ctgctcacgg tcacctggg 29