靶向PD-1的多肽及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及靶向人pd-1蛋白的多肽及其应用。

背景技术：

免疫系统中存在着众多的共刺激信号和共抑制信号精确调控t细胞反应的强度和质量，这些抑制信号被称为免疫检查点。肿瘤细胞通常会过表达这些免疫检查点蛋白，从而抑制t细胞的激活，逃避免疫系统的杀伤。通过不同的策略增强t细胞的活性对肿瘤免疫治疗具有重要意义，其中对免疫检查点进行阻断是增强t细胞活性的有效策略之一。t细胞表面存在着一系列的免疫抑制性分子，如pd-1、ctla-4、tim-3、slam等，这些免疫抑制性分子可以与其相应的配体结合从而激活免疫抑制调节通路，进而导致t细胞功能的衰竭，其中，pd-1/pd-l1通路是目前的研究热点。

pd-1是t细胞表面一个重要的抑制性受体，因最初在凋亡的t细胞淋巴瘤中发现，并能促进程序性细胞死亡而得名。pd-1蛋白可诱导性地表达于活化的t细胞、b细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及单核细胞等。其配体有两个，分别为pd-l1(cd274，b7-h1)和pd-l2(cd273，b7-dc)。pd-l1比pd-l2的分布更加广泛，pd-l1可以在b细胞、dc、巨噬细胞、骨髓源肥大细胞、t细胞、成纤维细胞、上皮细胞等细胞中表达，而pd-l2仅在dc、巨噬细胞、记忆性b细胞等细胞中表达，因此，阻断pd-1/pd-l1通路比阻断pd-1/pd-l2通路更为有效。pd-1/pd-l1抑制免疫通路的机理如下：肿瘤细胞存在着大量的基因突变以及蛋白的异常表达，可以作为肿瘤抗原活化t细胞。肿瘤特异性细胞毒t细胞到达肿瘤部位后，通过t细胞抗原受体(tcr)识别肿瘤细胞，释放干扰素γ(ifn-γ)以及t细胞颗粒，杀伤肿瘤细胞。但ifn-γ除具有抗肿瘤作用外，还能够诱导肿瘤细胞表达pd-l1。这些pd-l1与活化的t细胞中的pd-1结合后，抑制t细胞的抗肿瘤作用。

虽然目前已经有很多阻断pd-1/pd-l1通路的药物进入临床试验或者个别药物已经获得美国fda的审批，例如：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab和pidilizumab，以及靶向与pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等，但是这些药物大部分都是抗体类药物，具有生产成本高、组织渗透性差、易产生免疫原性等缺点。

与抗体类药物相比，多肽分子因具有较高的特异性和组织亲和性、生产成本低、不易产生免疫原性及较好的组织渗透性等优点，而成为最有吸引力的抗体替代物。因而，研究并开发出一些低分子量的有机小分子或者多肽类药物成为阻断pd-1/pd-l1通路的重要研究方向。

综上所述，本领域急需低分子量的有机小分子或者多肽作为阻断pd-1/pd-l1通路的候选药物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供能够阻断pd-1/pd-l1通路的低分子量的有机小分子或者多肽类。

在第一方面，本发明提供一种式i表示的多肽：

[xaa0]-[xaa1]-asp-tyr-[xaa2]-arg-[xaa3]-tyr-[xaa4](i)

其中，

[xaa0]为glyasn、thrglu、或pheasn构成的肽段、或无；

[xaa1]为trp、lys或met；

[xaa2]为asnsergln、arghisglyasnile、serleuglugluleu、sertrplysserglu、glnasn、cysprocys、cyshisglyprocys、cysalagluproleu、sertrpcysprocys构成的肽段；

[xaa3]为alaglnleu、metlysleuala、glulysalalys、leulysgluala、或glulyscyslys构成的肽段；

[xaa4]为asngln、aspleu、lys、aspleu、或arg；

并且所述多肽具有pd-1结合活性，所述多肽的长度为15-18个氨基酸。

在具体的实施方式中，所述多肽选自下组：

(a)氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；

(b)将(a)所述的多肽经过1-6个(较佳地1-4个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有pd-1结合活性的由(a)衍生的多肽。

在优选的实施方式中，所述多肽与pd-1的结合kd值为1-5μm，优选1-4μm、更优选1-3μm，最优选与天然pd-l1与pd-1的结合kd值近似。

在具体的实施方式中，所述多肽选自氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽。

在具体的实施方式中，所述多肽是氨基酸序列如seqidno:1或6所示的多肽。

在第二方面，本发明提供一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的多肽。

在第三方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的分离的核酸分子。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞包括但不限于：细菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

在优选的实施方式中，所述细菌包括但不限于：大肠杆菌、枯草杆菌；所述酵母包括但不限于：毕赤酵母、酿酒酵母。

在第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的赋形剂。

在优选的实施方式中，所述的药物组合物还包含：(c)药学上可接受的其它阻断pd-1/pd-l1通路的药物。

在另一优选的实施方式中，所述其它阻断pd-1/pd-l1通路的药物包括但不限于：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab，以及靶向pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等。

在优选的实施方式中，所述的药物组合物还可包含其它抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括但不限于：ipilimumab、ramucirumab、trametinib、ceritini、dabrafenib等。

在另一优选的实施方式中，所述药物组合物的剂型适用于以下给药方式，包括但不限于：注射给药、输注给药、腹膜内给药、瘤内给药、肌肉内给药。

在第五方面，本发明提供本发明第一方面所述的多肽的用途，用于制备抑制pd-1与pd-l1结合或抑制肿瘤、或治疗细菌、病毒或真菌引起的感染或治疗炎性疾病的药物。

在具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于：黑色素瘤、肺癌(优选非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏病、非何杰金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、小儿实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤等；

所述病毒包括但不限于：肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、孢疹病毒、流感病毒、腺病毒、冠状病毒、麻疹病毒、登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒等；

所述细菌包括但不限于：衣原体、立克次氏体、分枝杆菌、葡萄球菌、肺炎球菌、霍乱、破伤风等；

所述真菌包括但不限于：假丝酵母、曲霉、皮炎芽酵母等；或者

所述炎性疾病包括但不限于：强直性脊柱炎、自身免疫性溶血性贫血、关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性贫血、多肌炎等。

在第六方面，本发明提供一种抑制pd-1与pd-l1结合的方法，包括步骤：利用本发明第一方面所述的多肽或本发明第四方面所述的药物组合物抑制pd-1与pd-l1结合。

在优选的实施方式中，所述抑制pd-1与pd-l1结合的方法是体外非治疗性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示实施例3构建的人pd-1重组质粒的pcr鉴定结果，其中marker代表dna分子量marker；泳道中出现的条带为目的条带(357bp)。

图2显示实施例4的经纯化人pd-1蛋白的sds-page电泳结果，其中m代表蛋白分子量marker；泳道1代表人的pd-1蛋白，该目的条带大小为13kda，与理论值大小一致。

图3a显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:1的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为1.38μm。

图3b显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:2的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为3.13μm。

图3c显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:3的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为3.14μm。

图3d显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:4的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为3.39μm。

图3e显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:5的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为3.32μm。

图3f显示人的pd-1蛋白与人pd-l1蛋白结合的spr图，测得人pd-l1蛋白与pd-1蛋白的kd值为1.15μm。

图4显示人pd-l1蛋白与氨基酸序列为seqidno:1的多肽竞争结合人pd-1蛋白的spr图。

图5a显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:6的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为2.08μm。

图5b显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:7的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为3.96μm。

图5c显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:8的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为3.11μm。

图5d显示人pd-1蛋白与氨基酸序列为seqidno:9的多肽结合的spr图，测得的该条多肽与pd-1蛋白的kd值为4.81μm。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现了一组靶向人pd-1蛋白的多肽，该组多肽能够竞争性地与人pd-1蛋白结合，从而成为研究pd-1/pd-l1免疫检查点阻断剂的多肽类先导药物，进而为抗肿瘤药物的发展提供基础。在此基础上完成了本发明。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的技术人员的普遍理解相同的含义。为便于理解本发明，对本发明涉及的相关术语作如下定义，但本发明的范围并不限于这些具体的定义。

pd-1蛋白

本文所用的术语“pd-1蛋白”是指人体内t细胞表面的一个重要的抑制性受体。其有两个配体，分别为pd-l1和pd-l2。pd-l1与活化的t细胞中的pd-1结合后，起到抑制t细胞的抗肿瘤作用。因此，阻断pd-1/pd-l1通路对于抑制或杀伤肿瘤有着积极作用。

本领域技术人员熟知，人体内的蛋白有可能产生一定突变，而仍保留其活性。因此，本发明所述的pd-1蛋白包括包含一定突变的pd-1蛋白，只要该突变的pd-1蛋白在人体内行使与野生型pd-1相同的功能。例如，在具体的实施方式中，本发明所述的pd-1蛋白具有seqidno:14所示氨基酸序列(pptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterrae)，其相应的编码核苷酸序列如seqidno:13所示。

pd-1蛋白具有与其特异性结合的配体(pd-l1)。例如，在具体的实施方式中，本发明所述的pd-l1具有seqidno:12所示氨基酸序列。

本发明的多肽

本发明提供能够竞争性结合人pd-1蛋白的多肽，这些多肽具有结构上的相似性，即，在特定的位置具有特定的氨基酸残基。

在具体的实施方式中，本发明提供式i表示的多肽：

[xaa0]-[xaa1]-asp-tyr-[xaa2]-arg-[xaa3]-tyr-[xaa4](i)

其中，[xaa0]为glyasn、thrglu、或pheasn构成的肽段、或无；[xaa1]为trp、lys或met；[xaa2]为asnsergln、arghisglyasnile、serleuglugluleu、sertrplysserglu、glnasn、cysprocys、cyshisglyprocys、cysalagluproleu、sertrpcysprocys构成的肽段；[xaa3]为alaglnleu、metlysleuala、glulysalalys、leulysgluala、或glulyscyslys构成的肽段；[xaa4]为asngln、aspleu、lys、aspleu、或arg；这些多肽的长度为15-18个氨基酸。

这些多肽与人pd-1蛋白具有良好的结合亲和力，其中结合亲和力最高的多肽与人pd-1蛋白的天然配体pd-l1相当。在优选的实施方式中，所述多肽为氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；或者将氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽经过1-6个，(较佳地1-4个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有pd-1结合活性的衍生多肽。

在具体的实施方式中，本发明的多肽与pd-1的结合kd值为1-5μm，优选1-4μm、更优选1-3μm，最优选与天然pd-l1与pd-1的结合kd值近似。

在优选的实施方式中，本发明的多肽选自氨基酸序列如seqidno:1-9中任一所示的多肽；更优选氨基酸序列如seqidno:1或6所示的多肽。

在本发明的多肽的基础上，本发明提供一种分离的核酸分子以及宿主细胞，所述核酸分子编码本发明的多肽，所述宿主细胞包含所述的分离的核酸分子。

本领域技术人员知晓如何选取宿主细胞并在其中进行蛋白质的表达，例如，所述宿主细胞包括但不限于：细菌、酵母、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在具体的实施方式中，所述细菌包括但不限于：大肠杆菌、枯草杆菌；所述酵母包括但不限于：毕赤酵母、酿酒酵母。

由于本发明的多肽与人pd-1蛋白具有良好的结合亲和力，这些多肽能作为pd-1/pd-l1结合的抑制剂或调节pd-1/pd-l1结合程度的调节剂。因此，本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的多肽以及药学上可接受的赋形剂。

本发明的多肽显然还可以与其它机理的阻断pd-1/pd-l1通路的药物以及其它抗肿瘤药物联用以增强彼此的作用。因此，上述药物组合物中还可包含药学上可接受的其它阻断pd-1/pd-l1通路的药物。例如，所述其它阻断pd-1/pd-l1通路的药物包括但不限于：靶向pd-1蛋白的nivolumab、pembrolizumab、pidilizumab，以及靶向pd-l1的mpdl3280a、mdx1105、medi4736等。在优选的实施方式中，所述的药物组合物还可包含其它抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包括但不限于：ipilimumab、ramucirumab、trametinib、ceritini、dabrafenib等。

本领域技术人员知熟知，本发明的药物组合物的具体剂型取决于要采用的给药方式。例如，本发明的药物组合物可采用的给药方式包括但不限于：注射给药、输注给药、腹膜内给药、瘤内给药、肌肉内给药，等等。而药物组合物中活性成分的含量可由医学领域的技术人员根据，例如患者的性别、年龄、总体健康状况等实际情况自主决定。

基于本发明的多肽的活性，本领域技术人员不难想到可将其制备成抑制pd-1与pd-l1结合的药物或抑制肿瘤的药物。在具体的实施方式中，所述肿瘤包括但不限于：黑色素瘤、肺癌(优选非小细胞肺癌)、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、何杰金氏病、非何杰金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、小儿实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(cns)肿瘤、原发性cns淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊轴瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、t细胞淋巴瘤。

在其它实施方式中，所述抑制pd-1与pd-l1结合的药物还可用于治疗细菌、病毒或真菌感染。例如，以下病毒引起的感染：肝炎病毒(甲型、乙型和丙型)、孢疹病毒、流感病毒、腺病毒、冠状病毒、麻疹病毒、登革热病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒等；以下细菌引起的感染：衣原体、立克次氏体、分枝杆菌、葡萄球菌、肺炎球菌、霍乱、破伤风等；或以下真菌引起的致病感染：假丝酵母、曲霉、皮炎芽酵母等。

在其它实施方式中，所述抑制pd-1与pd-l1结合的药物还可用于治疗炎性疾病，包括但不限于：强直性脊柱炎、自身免疫性溶血性贫血、关节炎、重症肌无力、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性贫血、多肌炎等。

在本发明的多肽或药物组合物的基础上，本发明进一步提供了一种抑制pd-1与pd-l1结合的方法，包括利用本发明的多肽或药物组合物抑制pd-1与pd-l1结合的步骤。在具体的实施方式中，所述抑制pd-1与pd-l1结合的方法是体外非治疗性的。

本发明的优点：

1.本发明提供了能够竞争性结合人pd-1蛋白的多肽；

2.本发明的多肽能与人pd-1蛋白良好结合，其中，结合亲和力最高的多肽与人pd-1蛋白的结合情况与天然pd-l1蛋白无异；

3.本发明的多肽具有较高的特异性、组织亲和性、不易产生免疫原性以及较好的组织渗透性；和

4.本发明的多肽的生产成本低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(coldspringharborlaboratorypress，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

实施例1.本发明多肽的合成

(1)实验仪器与材料

二甲基甲酰胺(dmf)、哌啶、树脂、二氯甲烷(dcm)、茚三酮反应试剂、苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)、三异丙基硅烷(tis)、乙二硫醇(edt)、无水乙醚、三氟乙酸(tfa)、n-甲基吗啉(nmm)、甲醇、乙醇、20种氨基酸、多肽固相合成管、质谱仪器microtof-q11(brukerdaltonics)。

(2)实验步骤

称量树脂并投入到多肽固相合成管中，加入适量的dmf溶胀半小时以上。抽掉dmf，用脱保护液(哌啶:dmf＝1:4)进行fmoc去保护反应，置于摇床上10分钟。抽掉脱保护液，用dmf、dcm洗涤三次，从固相合成管中取出少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测并记录颜色，准备投料，进行氨基酸缩合反应。分别按照seqidno:1-9所示的氨基酸序列取相应氨基酸、hbtu，并用少量的dmf溶解，投入到固相合成管中，加入10倍的nmm，搅拌反应。1-2小时后，从固相合成管中取少量树脂于试管中，用乙醇洗涤2次，茚三酮法检测。抽掉固相合成管中的液体，用dmf、甲醇、dcm各洗涤2次，得到第一个氨基酸缩合后的肽树脂。对所得肽树脂重复进行以上“fmoc去保护、氨基酸缩合”反应步骤，至最后一个氨基酸反应完毕，得到氨基酸序列如seqidno:1-9所示的肽。反应完毕后，dmf、甲醇、dcm各洗涤2次，继续抽干10-15分钟。固相合成管中取出合成完的部分肽树脂，于室温下在裂解液(tfa94.5％；水2.5％；edt2.5％；tis1％)中裂解两小时。将树脂过滤后，于旋蒸仪中蒸干，用无水乙醚洗涤6次，然后常温挥干。粗肽使用分析级hplc纯化，使用hplc检测纯度>90％。所得的纯肽使用质谱鉴定。最后将纯化后的溶液冻干，即可得到纯品。表1列出了本发明多肽的分子量的理论值和质谱测定的实际值。

实施例3.人的pd-1重组质粒的构建

目的基因为pd-1蛋白上34-150位氨基酸的编码核酸。利用ncoi和ndei两个酶切位点设计的特异性引物将目的片段克隆到pet-28a载体(novagen公司)上。正向引物为：5’-ttttccatgggtccccccaccttctccccag-3’(seqidno:10)；反向引物为：5’-gccgccgcatatgttattctgcccttctctctg-3’(seqidno:11)。以人的pd-1基因为模板，进行pcr扩增。pcr体系为：2μlpd-1质粒，2μl正向引物，2μl反向引物，5μl10×缓冲溶液，4μldntp，1μlpfu聚合酶，34μlddh2o。pcr扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸48s，30个循环；72℃10min。pcr扩增完毕后，进行核酸电泳，切下目的条带，用pcr产物回收试剂盒回收pcr产物。将所得的pcr产物和质粒pet-28a载体分别用ncoi和ndei两个限制性核酸内切酶进行双酶切，然后在t4连接酶的作用下连接，转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞中。过夜培养后，挑取单克隆进行菌液pcr鉴定(结果见图1)，然后取阳性重组子测序，保留菌株和甘油菌。通过重组质粒构建的人的pd-1具有如seqidno:13所示的核苷酸序列。

实施例4.人的pd-1蛋白的表达与纯化

本发明所用到的人的pd-1蛋白是经原核生物表达、纯化后获得的。具体实验步骤如下：将测序正确的重组质粒转化到e.colibl21感受态细胞中进行诱导表达。挑取单个菌落接种于含有卡那霉素的tb培养基中，于37℃振荡培养过夜。次日将小培产物扩培到1l的tb培养基中，培养至od600为0.5-0.6，加入诱导剂iptg至终浓度为0.5mm，37℃诱导5-7h。在4,000rpm下收菌，先用裂解缓冲溶液(50mmtris-hcl，ph8.0，50mmnacl,，1mmdtt，0.5mmedta，5％甘油)裂解细菌，然后再高压破碎，在12,000rpm下离心取沉淀。用洗杂缓冲液(20mmtris-hcl，ph8.0，2m尿素，2.5％tritonx-100)洗杂两次，取沉淀。然后再用溶解缓冲溶液(20mmtris-hcl，ph8.0，8m尿素)溶解蛋白，离心取上清。取3kda的蛋白超滤浓缩管浓缩蛋白至5ml左右，将其加入到1l的复性缓冲液(50mmtris-hcl，ph8.0，50mml-arg，24mmnacl，1mmkcl，1mmedta)中，用稀释法在4℃下复性24h。用3kda的浓缩管浓缩蛋白，至20ml左右，将蛋白装入透析袋中，在透析缓冲液(50mmtris-hcl，ph8.0，150mmnacl，1mmdtt)中透析过夜，浓缩。对获得的蛋白过阳离子交换柱和分子筛进行纯化。将过完分子筛后的蛋白进行14％sds-page凝胶电泳，鉴定纯化后的蛋白纯度。所得电泳图如图2所示，蛋白大小约为13kda，与人pd-1蛋白的理论值吻合，说明成功获得了人pd-1蛋白。

实施例5.人pd-1蛋白与本发明多肽的spr结合实验

本发明的多肽与人pd-1蛋白的结合通过biacoret200进行表面等离子体共振(surfaceplasmonresonances,spr)实验测定。具体实验步骤如下：用10mm醋酸钠溶液将纯化好的pd-1蛋白稀释到50μg/ml，使用氨基偶联试剂盒将pd-1蛋白偶联到cm5芯片上，流速为10μl/min，结合时间为420s，最后的偶联量约为5000ru。结合实验是在含有0.05％的表面活性剂p20的pbs溶液(137mmnacl，2.7mmkcl，8mmna2hpo4，2mmkh2po4，ph7.4)中进行的。实验温度设定为25℃，流速为30μl/min，结合时间90s，解离时间120s。将多肽用运行溶液溶解后，成倍稀释成不同浓度，随着运行溶液结合到pd-1上。得到的结合数据用biaevaluation2.0软件分析，利用稳态拟合得到亲和力kd值。本发明的多肽与人pd-1蛋白的spr结合实验的实验结果如图3a-3e以及图5a-5d所示。表1列出了本发明的多肽的序列及spr实验测得的kd值。

本发明人同时检测了人pd-1蛋白与人pd-l1蛋白的结合亲和力kd值，其为1.15μm(如图3f所示)。

表1.本发明的多肽序列、分子量及它们与人pd-1蛋白结合的kd值

实施例6.人pd-l1蛋白与seqidno:1所示多肽竞争性结合人pd-1蛋白的spr实验

根据实施例5中的spr实验结果，seqidno:1所示多肽与人pd-1蛋白的结合亲和力最高。因而，本发明人以seqidno:1所示多肽为例，探究了该肽阻断人pd-1蛋白与人pd-l1蛋白结合的能力。人pd-l1蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司。

具体实验步骤如下：首先将50μg/ml人pd-l1蛋白通过氨基偶联的方法偶联到cm5芯片表面；然后将不同浓度的seqidno:1所示多肽(125nm，62.5nm，31.25nm，15.60nm，0nm)分别与100nm的人pd-1蛋白在冰上孵育15min，随运行缓冲溶液(10mm磷酸盐缓冲液，2.7mmkcl，137mmnacl和0.05％表面活性剂p20，ph7.4)流经芯片表面，流速为30μl/min，结合时间为90s，解离时间为120s；最后用biaevaluation2.0软件分析实验结果。实验结果如图4所示，随着多肽浓度的升高，溶液中未结合的pd-1蛋白浓度逐渐下降，从而使得pd-1与pd-l1的结合减弱，响应值随之下降。spr实验结果如图4所示，该结果表明seqidno:1所示多肽能够阻断人pd-1与pd-l1的结合。

讨论：本发明提供了靶向人pd-1蛋白，即，能够竞争性结合人pd-1蛋白的多肽，各多肽在特定的位置具有特定的氨基酸残基，从而能够具备相似的结构。这些多肽均能与人pd-1蛋白发生良好的结合，其中，seqidno:1所示多肽与人pd-1蛋白的结合亲和力最高，其kd值为1.38μm与pd-l1和pd-1的结合kd值相当。因此，这些多肽能作为pd-1/pd-l1结合的抑制剂或调节pd-1/pd-l1结合程度的调节剂，以及为研究pd-1/pd-l1免疫检查点阻断剂和设计、开发阻断pd-1/pd-l1通路提供了多肽类先导药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。