本发明属于生物医药领域，涉及一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。
背景技术：
：肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。随着医学诊断技术特别是分子诊断技术的不断提高，针对肺癌的新的基因不断被发现，基于驱动基因的新型靶向药物不断涌现，肺癌精准治疗成为了关注的热点。肺癌相关基因(alk，braf，egfr、kras和nras)的热点突变，有如下：alk基因的热点突变，涉及1151tins、l1152r、c1156y、f1174la、l1196m、g1202r、s1206y、g1269a等；braf基因的热点突变，v600e；egfr基因的热点突变，涉及g719a、g719c、g719s、a763_y764insfqea、t790m、l858r等；kras基因的热点突变，涉及g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、q61k、q61l、q61r、q61h等。目前已报道的检测肺癌相关基因突变的方法有：1)直接测序法。用pcr扩增产物进行测序和ta克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中应用。2)变性高效液相色谱法(dhplc)。该方法对已知和未知的突变位点均可以检测，灵敏性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认具体位置，最终需要测序确认。3)高分辨率溶解曲线(hrm)是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于pcr扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确认具体位置，最终需要测序确认。4)探针扩增组织突变法(arms)。利用引物的3’端末位碱基必须与其模板dna互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性pcr扩增引物，在严格的条件下，只有在引物的3’碱基与模板配对时pcr扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常dna互补，一个与突变dna互补，对于纯合性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的pcr，结合有与突变dna完全互补的引物才可以延伸并得到pcr扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。5)等位基因特异的taqman聚合酶链式反应(cast-pcr)。该方法采用优化taqman探针，通过一段特异设计的mgb探针来阻止引物与野生型dna结合，选择性的优化扩增突变型dna，该检测方法的灵敏度在1～0.1％左右。这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，不能满足对肺癌检测的需求。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用。首先，本发明要求保护引物对组和/或记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体在制备用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中的应用；所述肺癌相关基因为alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因。所述引物对组由(1)-(4)所示的特异于alk基因的4个引物对、(5)所示的特异于braf基因的1个引物对、(6)-(12)所示的特异于egfr基因的7个引物对和(13)-(14)所示的特异于kras基因的2个引物对组成；(1)由序列表中序列1和序列2所示的两个单链dna组成的引物对1；(2)由序列表中序列3和序列4所示的两个单链dna组成的引物对2；(3)由序列表中序列5和序列6所示的两个单链dna组成的引物对3；(4)由序列表中序列7和序列8所示的两个单链dna组成的引物对4；(5)由序列表中序列9和序列10所示的两个单链dna组成的引物对5；(6)由序列表中序列11和序列12所示的两个单链dna组成的引物对6；(7)由序列表中序列13和序列14所示的两个单链dna组成的引物对7；(8)由序列表中序列15和序列16所示的两个单链dna组成的引物对8；(9)由序列表中序列17和序列18所示的两个单链dna组成的引物对9；(10)由序列表中序列19和序列20所示的两个单链dna组成的引物对10；(11)由序列表中序列21和序列22所示的两个单链dna组成的引物对11；(12)由序列表中序列23和序列24所示的两个单链dna组成的引物对12；(13)由序列表中序列25和序列26所示的两个单链dna组成的引物对13；(14)由序列表中序列27和序列28所示的两个单链dna组成的引物对14。所述检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法，具体可包括如下步骤：(a)从待测者的血浆样本中提取游离核酸为模板，以所述引物对组中的各引物进行pcr扩增，得到扩增产物；(b)对所述扩增产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物1；(c)对所述回收产物1进行pcr富集，得到富集产物；(d)对所述富集产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物2；(e)对所述回收产物2进行高通量测序，根据测序结果确定所述待测者的肺癌相关基因是否发生突变。步骤(a)中，进行所述pcr扩增时，所述引物对组中的各引物对被分在两组分别进行多重pcr扩增；其中一组中的引物有所述引物对1、所述引物对3、所述引物对5、所述引物对7、所述引物对9、所述引物对11和所述引物对13，另一组中的引物有所述引物对2、所述引物对4、所述引物对6、所述引物对8、所述引物对10、所述引物对12和所述引物对14。两组多重pcr反应的反应体系，各引物均为等摩尔使用。两组多重pcr反应的反应程序，退火温度均为65℃。其中，所述高通量测序可为illumina测序，具体如nextseq500测序。其次，本发明还要求保护一种用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒。所述肺癌相关基因为alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因。本发明所提供的用于检测肺癌相关基因突变的试剂盒中含有前文所述的引物对组。根据需要，所述试剂盒中还可含有前文所述的记载有“检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法”的可读性载体。另外，为了便于判断所述待测者的肺癌相关基因是否发生突变，所述试剂盒中还可含有正常人基因组dna对照品。当然，所述试剂盒中还可含有pcr反应所需的常规试剂。再次，本发明还要求保护一种检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法。该方法可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。当该方法为疾病诊断治疗方法时，该方法具体为通过检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变来诊断所述待测者是否患有肺癌。本发明所提供的检测待测者的肺癌相关基因是否发生突变的方法，具体可包括如下步骤：(a)从待测者的血浆样本中提取游离核酸为模板，以所述引物对组中的各引物进行pcr扩增，得到扩增产物；(b)对所述扩增产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物1；(c)对所述回收产物1进行pcr富集，得到富集产物；(d)对所述富集产物进行磁珠纯化回收，得到回收产物2；(e)对所述回收产物2进行高通量测序，根据测序结果确定所述待测者的肺癌相关基因是否发生突变。步骤(a)中，进行所述pcr扩增时，所述引物对组中的各引物对被分在两组分别进行多重pcr扩增；其中一组中的引物有所述引物对1、所述引物对3、所述引物对5、所述引物对7、所述引物对9、所述引物对11和所述引物对13，另一组中的引物有所述引物对2、所述引物对4、所述引物对6、所述引物对8、所述引物对10、所述引物对12和所述引物对14。两组多重pcr反应的反应体系，各引物均为等摩尔使用。两组多重pcr反应的反应程序，退火温度均为65℃。其中，所述高通量测序可为illumina测序，具体如nextseq500测序。本发明以血浆作为检测样本，有多种优势，首先可以替代有风险的侵入性组织活检，并且不会受到病灶位置的局限，同时检测到多个转移病灶的遗传变化，还可在整个治疗过程中进行多次检测。本发明方法克服了传统检测方法的不足(如由于ctdna在血液样本中的含量非常低(<1.0％)，检测难度大，并且大多数针对ctdna的检测只能识别单一的热点突变或少数几个基因突变)，针对肺癌相关基因(alk基因、braf基因、egfr基因和kras基因)热点突变设计特异性引物14对，可准确有效地监测肺癌相关基因的突变，该检测方法的灵敏度在0.05％。可准确有效地监测肺癌相关基因的突变。将来自患者的基因文库进行分析，全面、系统、准确地解读肿瘤药物与基因的关系，获得患者特异性肿瘤突变位点。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、本发明检测肺癌相关基因突变的方法的建立及应用一、供试样本来源于中国医学科学院肿瘤医院被临床诊断为肺癌的患者的血浆样本，编号为2015-r-oncoamp067(患者知情且同意)。采用康为世纪游离dna提取试剂盒cw2603s提取血浆游离dna，备用。二、检测待测样本肺癌相关基因突变情况其中，本发明涉及肺癌相关基因(alk，braf，egfr、kras和nras)的热点突变，具体如下：(1)alk基因的热点突变：涉及1151tins、l1152r、c1156y、f1174la、l1196m、g1202r、s1206y、g1269a等；(2)braf基因的热点突变：v600e；(3)egfr基因的热点突变：涉及g719a、g719c、g719s、a763_y764insfqea、t790m、l858r等；(4)kras基因的热点突变：涉及g12c、g12r、g12s、g12a、g12d、g12v、g13c、g13r、g13s、g13a、g13d、q61k、q61l、q61r、q61h等。本发明所提供的检测待测样本肺癌相关基因突变情况的大体流程如下：(1)step1pcr扩增，扩增目的基因片段；(2)琼脂糖凝胶电泳，并磁珠纯化回收；(3)pcr富集；(4)琼脂糖凝胶电泳和磁珠纯化回收；(5)高通量测序。1、肺癌相关基因突变检测引物共14对，分别放在2个pool。具体见表1。表114对肺癌相关基因突变检测引物2、将2ml血浆游离dna平分为2份，分别作为每个pool的模板。具体反应体系如表2和表3所示。反应程序如表4所示。表2pool-1的pcr反应体系组成体积(μl)5×phusionhfbuffer40dntps(2.5mm)19.2pool-1fpmix(1μm)4pool-1rpmix(1μm)4phusionhotstartⅱdnapolymerase4dna1ml血浆游离dnaddh2o补足到200μl表3pool-2的pcr反应体系表4pool-1和pool-2的pcr反应程序3、2％凝胶电泳制备2％琼脂糖凝胶，pool-1和pool-2反应体系各取3.5μlpcr产物进行凝胶电泳检测。电压设置：200v；时间：10min。检测结果可目的条带约200bp，或者只有引物二聚体没有目的条带(产物量较低，凝胶无法显示)均属正常现象，可继续下步实验。4、产物纯化将同一待检样本的pool-1产物和pool-2产物混合于1.5mlep管中；进行磁珠纯化，具体步骤如下：1)琼脂糖凝胶电泳检测确定扩增有效后，对剩余pcr产物进行磁珠纯化；2)向pcr产物中加入1.2倍体积的磁珠(beckman公司的ampure，货号是a63881)，上下抽吸混匀至少二十次；3)将混合液放在室温下5分钟，使dna充分被吸附在磁珠上。4)吸附结束后，置于磁力架上室温放置5分钟(不要旋转tube)5)待溶液变得清澈后，用移液器将澄清的液体移弃(注意：枪头不要碰到磁珠)。6)保持8连管在磁力架上不动，加入200μl80％酒精(酒精配置时间在两周以内，并确保封闭好)，室温放置30秒后移弃澄清液。7)重复步骤6)一次，并将管底的残留液体彻底吸干。8)将反应管从磁力架上移开，室温放置5分钟(此步骤是为了彻底挥发掉残留的酒精，以免影响后续反应实验)。9)加入33μl的ddh2o，枪头吹打充分混匀，室温放置3分钟。10)将反应管置于磁力架上，室温放置5分钟。11)转移步骤10)反应管中30μl澄清液与对应的已经贴好条形码编号的离心管中，盖上管盖；12)文库样本可置于-20℃长期保存。5、pcr富集具体反应体系如表5所示。反应程序如表6所示。表5pcr富集的反应体系组成体积(μl)5×phusionhfbuffer10dntps(2.5mm)4.8富集反应fprimer(50μm)2富集反应rprimer(50μm)2phusionhotstartⅱdnapolymerase1step1pcr产物100ngddh2o补足至50表6pcr富集的反应程序6、2％凝胶电泳制备2％琼脂糖凝胶，取3.5μlpcr产物进行凝胶电泳检测。电压设置：200v；时间：10min。使用凝胶成像系统对其进行扫描，在200～300bp之间有目的条带。7、产物纯化详细步骤参见“4、产物纯化”。8、qubit测定浓度使用invitrogenqubit(q32857)测定文库浓度。9、高通量测序使用nextseq500进行高通量测序，获得待检样本的序列信息。10、生物信息分析使用生物信息学软件对待检样本序列信息进行分析，结果如表7所示。表7待测样本肺癌相关基因突变情况检测结果注：实验过程中pcr及相关步骤会产生部分背景突变，经过研究对比在0.05％以下；因此该检测中0.05％以下突变频率的可信度会降低。<110>迈基诺（重庆）基因科技有限责任公司<120>一种检测肺癌相关基因热点突变的试剂盒及其应用<130>gncln171096<160>28<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1tacctgatgatcagggcttccat23<210>2<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2ctctgtaggctgcagttctcag22<210>3<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3tctctcggaggaaggacttgag22<210>4<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4cctctctgctctgcagcaaatt22<210>5<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5actcttgctccttccatccttg22<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6gttcatcctgctggagctcat21<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7gggtgaggcagtctttactcac22<210>8<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8cctttcttcccagagacattgctg24<210>9<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>9tcagtggaaaaatagcctcaattcttacc29<210>10<211>30<212>dna<213>人工序列<220><223><400>10cttcatgaagacctcacagtaaaaataggt30<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>11gcctcttacacccagtggagaa22<210>12<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>12tgtgccagggaccttaccttat22<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>13gcaccatctcacaattgccagt22<210>14<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>14ccttgttggctttcggagatgt22<210>15<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>15aaattcccgtcgctatcaaggaat24<210>16<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>16ctgccagacatgagaaaaggtg22<210>17<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>17catgcgaagccacactgac19<210>18<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>18ggcatgagctgcgtgatga19<210>19<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>19tacgtgatggccagcgtgg19<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>20ccaatattgtctttgtgttcccgg24<210>21<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223><400>21gcctcctggactatgtccg19<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>22ggatcctggctccttatctccc22<210>23<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>23gccaggaacgtactggtgaaaa22<210>24<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223><400>24cctaaagccacctccttactttgc24<210>25<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223><400>25tacctctattgttggatcatattcgtcca29<210>26<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223><400>26attataaggcctgctgaaaatgactga27<210>27<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223><400>27tcctcatgtactggtccctcat22<210>28<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>28gtttctcccttctcaggattcctac25当前第1页12