一种检测牛smc2基因隐性致死突变的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测牛SMC2基因隐性致死突变的方法，涉及分子生物学领域，本发明方法基于焦磷酸测序技术，采用一对引物、一条通用引物和一条测序引物，核苷酸序列如SEQ ID No.1、2、3、4所示，对牛8号染色体95410507bp位点的单核苷酸多态性进行分析，结果发现野生型纯合子在突变位点处为T/T基因型，焦磷酸测序结果图显示T碱基与C碱基的峰高比例为3:1；而致死突变携带者峰图在突变位点处为T/C基因型，焦磷酸测序结果图显示T碱基与C碱基的峰高比例为5:3。本发明提供的方法操作简单，灵敏度高，准确性强，通量高，检测成本低，在牛的保种、育种过程中具有重要应用价值。
【专利说明】
-种检测牛SMC2基因隐性致死突变的方法
技术领域
[0001] 本发明设及分子生物学技术领域，具体设及用于牛SMC2基因型检测的SNP分子标 记、W及检测牛SMC2基因隐性致死突变的方法。
【背景技术】
[0002] 单核巧酸多态性标记(SNP)，主要是指基因组上由单个核巧酸突变所引起的DNA序 列多态性。通过检测单核巧酸多态性标记检测基因型是近些年兴起的一种方法。分子标记 在动物育种中的应用已有一段时间，相比传统育种方法，分子育种大大加快了选育效率，节 省了育种时间，使得育种学家可W在分子水平上不断探索并选育更优良的家畜品种。
[0003] 已有多种方法可用于SNP检测，目前比较常用的有基因忍片方法、DNA测序法、质谱 法、W及化qMan巧光定量方法等。不同方法根据所依据的原理不同适用于不同的研究。忍片 和质谱技术适用于大规模的多态信息检测。而测序和化qman技术适用于高精度、高准确性 的判定SNP多态信息。在多种测序技术中，焦憐酸测序是一种基于酶级联反应的新型DNA测 序技术。是目前少数能够得到定量序列结果的技术之一，其准确度高，重复性好，广泛用于 多种遗传多态性分析。
[0004] 焦憐酸测序技术(pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，焦憐酸测序 法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媳美，而 速度却大大的提高。焦憐酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大 通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核巧酸多态性（single nucleotide polymor地isms,SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。该技术进行改进 后可W满足上百个核巧酸序列的测序工作，运样该技术又可W满足对重要微生物的鉴定与 分型，特定DNA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。焦憐酸测序技术的原理是：引物 与模板DNA退火后，在DNA聚合酶化NA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfu巧lase)、巧光 素酶（luciferase)和Ξ憐酸腺巧双憐酸酶(Apyrase)等4种酶的协同作用下，将引物上每一 个dNTP的聚合与一次巧光信号的释放偶联起来，通过检测巧光的释放和强度，达到实时测 定DNA序列的目的。焦憐酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构 成。反应底物为5 ' -憐酷硫酸(adenosine-5' -曲OS地osulfat，APS)、巧光素（luciferin)。在 每一轮测序反应中，反应体系中只加入一种脱氧核巧酸Ξ憐酸(dNTP)。如果它刚好能和DNA 模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放 出一个分子的焦憐酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可W和APS结合形成ATP， 在巧光素酶的催化下，生成的ATP又可W和巧光素结合形成氧化巧光素，同时产生可见光。 通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基 数成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就 没有检测峰。反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在Apyra S e的作用下发生降解。待上 一轮反应完成后，加入另一种dNTP,使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确 的DNA序列信息。焦憐酸测序技术可W用来研究单核巧酸多态性（single nucleotide polymo巧Msm，SNP)，分子诊断细菌与病毒分型、甲基化分析、法医鉴定及药物基因组学等 方面都有广泛的应用。该技术不需要凝胶电泳，也不需要对DNA样品进行任何特殊形式的标 记和染色，具有大通量、低成本、快速、直观的特点。
[0005] 近年来，随着全基因组标记技术的广泛应用，一些影响奶牛繁殖力的基因位点被 发现。2011年，美国科学家化nRaden等人在分析牛SNP忍片数据的基因型信息时发现，有5种 单倍型从来没有W纯合状态出现在牛群中，由此推断该5中单倍型纯合时导致个体死亡 (VanRaden等，2011)。其中，在荷斯坦牛品种中发现的巧中单倍型被命名为皿1化olstein 化plotype 1)、皿2(Holstein 化plotype 2)和皿3(Holstein Haplotype 3)。研究发现， 2011年北美荷斯坦牛群中皿1携带率为4.5%，由皿1导致的妊娠率降低3.1%，死胎率为 0.7%，对奶牛产业造成了巨大的经济损失(化nRaden等，2011)。
[0006] 2014年，McClure等人通过外显子捕获技术和二代测序技术，掲示了皿3的致病机 理是牛8号染色体第24外显子上的SMC2(s1:;ruc1:ural maintenance of chromosomes 2)基 因上的T/C突变，导致编码的氨基酸由苯丙氨酸突变为丝氨酸，SMC2基因在染色体结构的维 持和DNA的修复中起关键作用，突变导致SMC2基因功能异常，最终导致胚胎死亡(McClure 等，2014)。该突变物理位置为牛UMD3. 1全基因组序列上8号染色体的95410507位点。 化nRaden等(2011)报道了基于SNP单倍型的皿3检测方法。该方法需要首先对待检样本进行 SNP忍片检测，然后通过统计学方法推断单倍型，进而判定个体携带皿3的概率。此方法不仅 因依赖忍片检测而成本很高，同时还需事先建立参考群体的基因型数据库;另外，由于其本 质上是利用周围SNP标记对致病突变位点基因型的间接推断，所W结果并非100%准确。因 此需要一种能够大通量、低成本、快速、直观且准确地检测牛8号染色体SMC2基因上的CA突 变的方法。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种检测牛SMC2基因隐性致死突变的方法。
[000引为达到上述目的，本发明根据位于牛8号染色体95410507bp位点处牛SMC2基因隐 性致死突变的SNP分子标记，该SNP分子标记的多态性为T/C，提供了用于检测该SNP分子标 记的引物核巧酸序列如SEQ ID NO. 1-2所示。
[0009]进一步地，用于检测该SNP分子标记的引物还包括一条5'端添加生物素标记的通 用引物和一条焦憐酸测序引物，其核巧酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。
[0010]本发明提供了上述SNP分子标记在牛育种中的应用。
[0011]本发明提供了上述SNP分子标记在牛种质资源改良中的应用。
[001^ 本发明提供了一种用于检测牛SMC2基因隐性致死突变的试剂盒，含有1对引物，一 条通用引物和一条焦憐酸测序引物，其核巧酸序列分别如SEQ ID NO. 1-4所示。
[0013] 进一步地，本发明试剂盒利用焦憐酸测序法对牛8号染色体95410507bp位点的核 巧酸进行SNP检测。
[0014] 优选地，本发明检测牛SMC2基因隐性致死突变试剂盒的工作步骤如下： [001引（1)提取待测牛的基因组0魁，从其为模板，从560 10側.1-3所示的引物为扩增引 物，进行PCR反应；
[0016] (2)W步骤（1)的扩增产物为模板，WSEQ ID NO.4所示的核巧酸序列为测序引物 进行焦憐酸测序，根据突变位点的峰图来判断基因型，当焦憐酸测序结果图上显示τ碱基与 C碱基的峰高比例为3:1时，突变位点为ΤΛ基因型，为野生型纯合子；当焦憐酸测序结果图 上显示Τ碱基与C碱基的峰高比例为5:3时，突变位点为T/C基因型，为致死突变携带者。 [0017] 其中，步骤（1)中PCR扩增的反应体系为：总体积40yL，其中含dNTP、Mg2+的2 XPCR buf f er 20yL，浓度20μΜ的上游引物化L，浓度20μΜ的下游引物0.化L，浓度ΙΟμΜ的通用引物 0.化L，基因组DNA模板化g，加水补至40μ1反应体系。
[001引步骤（1)中PCR反应条件为:95 °C预变性8min; 95 °C变性30sec，60 °C退火30sec，72 。(:延伸30sec，45个循环;72°C终延伸lOmin。
[0019] 本发明提供了上述试剂盒在牛育种中的应用。
[0020] 本发明提供了上述试剂盒在牛种质资源改良中的应用。
[0021] 本发明还提供一种检测牛SMC2基因型的方法，是利用焦憐酸测序法对8号染色体 95410507bp位点的核巧酸进行SNP检测。
[0022] 进一步地，上述方法包括W下步骤：
[0023] (1)提取待测牛的基因组DNA，W其为模板，WSEQ ID NO.1-3所示的引物为扩增引 物，进行PCR反应；
[0024] (2)W步骤（1)的扩增产物为模板，WSEQ ID NO.4所示的核巧酸序列为测序引物 进行焦憐酸测序，根据突变位点的峰图来判断基因型，当焦憐酸测序结果图上显示T碱基与 C碱基的峰高比例为3:1时，突变位点为ΤΛ基因型，为野生型纯合子；当焦憐酸测序结果图 上显示T碱基与C碱基的峰高比例为5:3时，突变位点为T/C基因型，为致死突变携带者。
[0025] 本发明提供的一种检测牛SMC2基因型的方法，SNP分子标记，试剂盒可应用于选育 不携带APAF1致死基因的牛只。
[0026] 本发明利用牛SMC2基因隐性致死突变的SNP位点设计特异性引物，进行焦憐酸测 序，根据T/G峰值判断牛SMC2基因的基因型可实现对牛SMC2基因隐性致死突变携带者个体 的快速检测，克服了常规PCR-RFLP方法检测SNP位点时必须有酶切位点的要求，从而大大地 提高牛育种和保种效率;本发明的检测方法可高通量实现牛SMC2基因隐性致死突变的检 测，且操作简单，费用低廉，准确度高。
【附图说明】
[0027] 图1为本发明所用引物及测序序列在牛SMC2基因序列上的位置(基因组序列来源 于化sembl牛基因序列UMD3.1)。下划线显示引物所在位置，其中直线为上下游引物，波浪线 为测序引物；阴影处为测序序列，阴影处从左向右第9个碱基为T/C突变位点。
[0028] 图2为牛SMC2基因隐性致死突变携带者部分测序结果。箭头处为突变位点（T/C突 变）。该突变的基因组物理位置为牛8号染色体95410507bp位（牛UMD 3.1基因组图谱 http://www.ensembl.org)。
[0029] 图3为PCR产物电泳胶图。泳道1-6显示PCR产物为单一的245bp条带；Μ为DNA Marker〇
[0030] 图4为利用本发明方法检测SMC2基因隐性致死突变位点的基因型。图4A为野生型 纯合子，突变位点处T碱基与C碱基的峰高比例为3:1;图4B为致死突变携带者，突变位点处T 碱基与C碱基的峰高比例为5:3。
【具体实施方式】
[0031] W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0032] 实施例1检测牛SMC2基因隐性致死突变的焦憐酸测序方法的建立
[0033] 1、基因组DNA提取采用高盐法从牛冻精中提取基因组DNA。
[0034] 2、引物筛选与PCR扩增
[0035] 从ensembl数据库化ttp: //asia. ensembl. org/)获取目标DNA序列（UMD3.1:8 : 95410307:95410707:1),设计PCR扩增引物和测序引物。下述引物及测序序列在牛SMC2基因 序列上的位置见图1。
[0036] 表1检测牛SMC2基因隐性致死突变的引物组合
[0037]
[0038] 其中，上游引物（SMC2-F)、下游引物（SMC2-R)将扩增出包含隐性致死突变位点的 SMC2基因片段;通用引物（SMC2-U)序列与下游引物（SMC2-R)的前20bp完全一致，其作用是 在PCR产物的5 '端添加生物素标记，最终得到5 '端带有生物素标记的24化P DNA片段;进行 焦憐酸测序时，加入测序引物(SMC2-S)进行测序，根据突变位点的峰图来判断基因型。理论 上野生型纯合子峰图在突变位点处T与C的比例为3:1;而致死突变携带者峰图在突变位点 处T与C的比例为5:3。因此，通过测序峰图，可W准确区分野生型纯合子和致死突变携带者。 突变纯合子的胚胎不可存活，在妊娠期流产，因此试验中不会观察到突变纯合子的基因型。
[0039] 野生型纯合子在突变位点处为ΤΛ基因型，在焦憐酸测序结果图上，显示T碱基与C 碱基的峰高比例为3:1;而致死突变携带者峰图在突变位点处为T/C基因型，在焦憐酸测序 结果图上，显示T碱基与C碱基的峰高比例为5:3,见图2。
[0040] PCR反应体系：总体积40化，其中2 X PCR buf f er (包含dNTP、Mg2+) 20化，上游引物 (浓度20μΜ) 1化，下游引物(浓度20μΜ)0.化L，通用引物(浓度1 ΟμΜ)0.化L，基因组DM模板化 g，加水补至40化。
[0041 ] PCR反应条件:95 °C预变性8min;然后45个循环，95 °C变性30sec，60 °C复性30sec， 72°C 延伸 30sec;最后 72°C 延伸 lOmin。
[0042] 仪器为Applied Biosystems 9700型PCR仪。
[0043] (3)PCR产物的凝胶电泳检测
[0044] 制作浓度为2%的琼脂糖凝胶，取每个样品的PCR产物化L点样，在TAE缓冲液中 120V电压下电泳15min。在凝胶成像系统中观察电泳结果，为单一的约24化P条带，见图3。
[0045] (4)PCR产物的焦憐酸测序
[0046] 本实施例所用试剂为QIANGEN公司生产的退火缓冲液（PyroMark Annealing Buffer)、结合缓冲液（PyroMark Binding Buffer)、测序反应试剂（PyroMark Gold Q96Reagents试剂盒（包含酶混合物、底物混合物及四种碱基），W及GE公司（General Electric Company)生产的链霉亲和素琼脂糖珠 （Streptavidin Sepharose High Performance)。具体步骤为：
[0047] 1化37化标记有生物素的PCR产物中加入20化g链霉亲和素琼脂糖珠和化L结合缓 冲液，室溫下震荡20min，使生物素与链霉亲和素充分结合，将PCR产物吸附到琼脂糖珠上。
[0048] 2)用过滤吸头将吸附了PCR产物的琼脂糖珠吸起，然后在70%乙醇中清洗5s;变性 缓冲液(0.2M化0H)中清洗5s;清洗缓冲液(0.01M Tris-Acetate，PH=7.6)中清洗15s;最 后将过滤吸头悬空30s(仰角>90° )，由此得到单链PCR产物。
[0049] 3)将吸头置于酶标板正上方，关掉吸累开关，待压强变为加寸将过滤吸头放入含有 1化测序引物和40化退火缓冲液的酶标板中，轻轻摇动15s，使单链PCR产物进入酶标板。将 装有样品的酶标板放入80°C烘箱2min，再冷却到室溫，使测序引物(SMC2-S)与单链PCR产物 台口口 〇
[0050] 4)将装有样品的酶标板放入焦憐酸测序仪，将酶、底物和四种碱基分别加入试剂 舱中，打开PyroMark Q96软件，选定SNP检测方法，输入待测序列（TACTCATTT/CCACACA)，设 置相关参数后运行程序进行检测。
[0051] 5)根据测序峰图进行基因型判型
[0052] 在PyroMark Q96软件中观察测序结果，见图4A和图4B。根据测序峰图判定每个样 品的基因型:野生型纯合子峰图在突变位点处T碱基与C碱基的峰高比例为3:1;而致死突变 携带者峰图在突变位点处T碱基与C碱基的峰高比例为5:3。
[0053] 本发明研发过程中设计了多对引物，但效果均不如上述引物效果好。例如下述引 物：
[0化4]
[0055] 经过琼脂糖凝胶电泳，结果发现该对引物扩增后有杂带，不符合实验要求，故而舍 弃。经过筛选比较后，发现本发明表1的引物组合能够获得最佳的检测效果，能够准确、特 异、高效地检测牛APAF1基因隐性致死突变。
[0056] 实施例3本发明方法的实际应用
[0057] 利用本发明实施例1所记载的方法对北京奶牛中屯、的152头荷斯坦公牛进行了临 床检测，共发现致死突变携带者15头，携带者所占比例为9.9%。根据检测结果，制定了运些 公牛的选种和选配方案，从而逐步淘汰有害基因携带者，显著提高了选种效率。
[0058] 上文虽然已对本发明W及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领 域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W对相应的条件等做一 些改进，运些改进也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于检测牛SMC2基因隐性致死突变的SNP分子标记，位于牛8号染色体 95410507bp位点处，该SNP分子标记的多态性为T/C，其特征在于，用于检测该SNP分子标记 的引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1-2所示。2. 如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，用于检测该SNP分子标记的引物还包 括一条5'端添加生物素标记的通用引物和一条焦磷酸测序引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO .3-4所示。3. -种用于检测牛SMC2基因隐性致死突变的试剂盒，其特征在于，含有1对引物，一条 通用引物和一条焦磷酸测序引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1-4所示。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒利用焦磷酸测序法对牛8号染色 体95410507bp位点的核苷酸进行SNP检测。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其工作步骤如下： (1) 提取待测牛的基因组DNA，以其为模板，以SEQ ID NO. 1-3所示的引物为扩增引物， 进行PCR反应； (2) 以步骤（1)的扩增产物为模板，以SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列为测序引物进行 焦磷酸测序，根据突变位点的峰图来判断基因型，当焦磷酸测序结果图上显示T碱基与C碱 基的峰高比例为3:1时，突变位点为T/T基因型，为野生型纯合子；当焦磷酸测序结果图上显 示T碱基与C碱基的峰高比例为5:3时，突变位点为T/C基因型，为致死突变携带者。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤（1)中PCR扩增的反应体系为：总体积 40yL，其中含dNTP、Mg2+的2 X PCR buf f er 20yL，浓度20μΜ的上游引物lyL，浓度20μΜ的下游 弓丨物0. lyL，浓度ΙΟμΜ的通用引物0.9yL，基因组DNA模板lyg，加水补至40μ1反应体系。7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，步骤（1)中PCR反应条件为:95 °C预变性 8min;95°C 变性 30sec，60°C 退火 30sec，72°C 延伸 30sec，45 个循环；72°C 终延伸 lOmin。8. 权利要求1或2所述的SNP分子标记在牛育种中的应用。9. 权利要求3-7任一所述试剂盒在牛育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106011250SQ201610393611
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】张毅, 劳兰兰, 肖炜, 俞英, 唐韶青, 刘林, 王雅春, 孙东晓, 张胜利
【申请人】中国农业大学, 北京市畜牧总站