用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒。本发明所述试剂盒的组份设置及其结果判读方案使得检测过程简便，可操作性强。检测结果可靠、特异性好，同时利用实时荧光PCR技术，通过计算ΔCt值对乳腺癌组织标本中的HER2基因扩增水平进行检测，可用于通过血液ctDNA检测进行乳腺癌辅助诊断，临床以及预后等多个研究领域。
【专利说明】
用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩増的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种人外周血循环肿瘤DNA中化r2基因扩增 的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。在欧美国家，乳腺癌占 女性恶性肿瘤的25%-30%。20世纪末的统计资料表明全世界每年约有130万人诊断为乳腺 癌，而有40万人死于该病。在我国许多大城市，乳腺癌发病率已经上升为女性恶性肿瘤的第 一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成为妇女健康的最大威胁。
[0003] 表皮生长因子受体-2化pidermal growth factor recepto;r-2,皿R2),是一种位 于乳腺和乳腺癌细胞表面的受体，能够控制癌细胞的生长、浸润和癌细胞的转移，大约20% 的乳腺癌病例中存在皿R2基因和/或蛋白水平增加，它是乳腺癌的独立预后因子，在乳腺癌 的祀向治疗和预后判断中的作用已经得到了全世界临床医生的认可。肥R2阳性的肿瘤是一 种高危肿瘤，皿R2癌基因的扩增预示病情进展迅速，局部复发的危险性高，化疗缓解期短， 无病生存期(DFS)和总生存期(0S)缩短，对某些常规的化疗和激素治疗反应性差。目前最为 常用并经FDA批准的适用于治疗肥R2过度表达或皿R2基因扩增的乳腺癌的药物是曲妥珠单 抗(赫赛汀），由于运种药物只有针对皿R2基因扩增和蛋白过度表达的病人才有效，因此准 确评价肥R2基因和蛋白水平至关重要。
[0004] 鉴于皿R2基因在乳腺癌诊断和治疗上的指导意义，采用灵敏、有效的方法对它进 行检测显得极其重要。目前，检测肥R2的方法主要有化154、1肥^15山(：1甜、1?1'斗0?等，其中 临床最常用的是IHC法和FI甜法，而IHC法是检测皿R2的蛋白表达水平，FISH法是检测肥R2 的基因扩增水平。国内大部分医院已经开展了皿R2I肥检测，该方法简便易行、价格低廉、但 易受多种因素的影响。国外探针试剂盒及祀向药物(赫赛汀)较昂贵，FISH技术要求较高，而 国内各医疗单位乳腺癌肥R2检测的准确性、可重复性和完整性尚不尽人意。
[0005] 外周血循环肿瘤核酸中可检测到与乳腺癌细胞一致的基因突变。运些基因突变的 检测可W为乳腺癌的分期及药物的治疗和预后提供丰富的信息。因此，外周血循环肿瘤DNA 的化r2基因扩增检测为乳腺癌的早期诊断和治疗提供的很好的研究方向。
【发明内容】
[0006] 鉴于上述问题，提出了本发明，W便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决 上述问题的用于外周血循环肿瘤核酸DNA中化r2基因扩增的检测试剂盒。
[0007] 在第一方面，本发明提供了一种人外周血循环肿瘤DNA中化r2基因扩增检测的试 剂盒，所述试剂盒包括:祀向化r2基因目的位点的特异引物、Her2基因特异性水解探针、内 参基因的引物和内参基因的水解探针。
[000引在本发明的一些实施方案中，所述化r2基因目的位点为化r2基因共济失调毛细血 管扩张突变ATM区。
[0009] 在本发明的一些实施方案中，所述内参基因为GAPDH、β-ac t i η、B2M、SDHA、HPRT1中 的一种或者多种。
[0010] 在本发明的一些实施方案中，所述化r2基因目的位点的特异引物分别为：
[0011 ]正向引物：5'-ggctccagagcccacaggc-3'沈Q ID NO: 1;
[0012] 反向引物：5'-tttgttgagccaaacaaagttctctgt-3'沈Q ID N0:2。
[0013] 在本发明的一些实施方案中，所述化r2基因特异性水解探针为5 ' -ccctcactga tcttgccttc cttgctctcc acccctgacc-3'SEQ ID NO:3。
[0014] 在本发明的一些实施方案中，所述内参基因的引物选自w下引物对：
[0015] 5'一tt 邑邑 attt 邑邑 atatttttatt 邑 taaaa - 3'SEQ ID N0:4和5'一 曰曰ttcggc曰曰曰曰c曰ccc曰曰曰c曰ccc曰-3'SEQ ID NO:5；
[0016] 5'一taatttgtgtgtgtgtttattggtttg-3'SEQ ID N0:6和5'一 cctcc曰ccc曰曰ttc曰曰曰g曰曰c曰cc曰曰-3'SEQ ID NO:7；
[0017] 5'一tttatattattataatggaaagtatg - 3'SEQ ID N0:8和5'一 曰tttc曰曰t曰曰gt曰曰曰曰曰曰c曰曰曰曰曰曰曰c-3'SEQ ID NO:9；
[0018] 5'一gtggttagagttaatattatatagtatg - 3'SEQ ID N0:10^R5'一 aaa1:a1:actat1:aacaa1:aaccaccat-3 ' SEQ ID NO: 11; W及
[0019] 5'一邑attata 邑ata 邑邑邑邑 t 邑a 邑a 邑aaa 邑a - 3'SEQ ID NO: 12和5'一 ctt曰t曰g曰t曰ggggtg曰g曰g曰曰曰g曰-3'SEQ ID NO :13〇
[0020] 在本发明的一些实施方案中，所述内参基因的水解探针选自5'- ctaacctttaaaatcaaat-3'沈Q ID NO 14、5'-aaatacacacaaacgttca-3'沈Q ID N0:15、5'- aacatttactagaaataat-3'沈Q ID N0:16、5'-taatattacacataaccac-3'SEQ ID N0:17、5,- accacaaataa1:acacatcc-3'沈Q ID NO: 18中的任一个。
[0021] 在本发明的一些实施方案中，所述化r2基因的探针和内参基因的探针5'端报告巧 光基团分别选自FAM、TET、肥X、TAMRA、Texas Red、Rox和C巧中的一种。
[0022] 在本发明的一些实施方案中，所述化r2基因的探针和内参基因的探针3'端的泽灭 基团分别选自B册1、B册2、TAMRA和DABCTL中的一种。
[0023] 在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中还包含阴性质控品、阳性质控品和无 模板对照。
[0024] 在本发明的一些实施方案中，所述阳性质控品为乳腺癌化r2阳性基因组DNA、所述 阴性质控品为健康人全基因组DNA。
[0025] 在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒中，PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1 ~10XPCR缓冲液、0.1 ~ImM dNTPs、0.01 ~0. lOU/ul TaqDNA聚合酶、1 ~5mM氯化儀。
[0026] 在第二方面，本发明提供如第一方面所述的试剂盒在制备用于扩增人外周血循环 肿瘤DNA中化r2基因的药物中的用途。
[0027] 有益效果：
[0028] 1、本发明通过化r2基因与内参基因 PCR扩增结果的计算，来对检测结果给出判定， 提高了检测结果的敏感性和可靠性。Her2基因与内参基因 PCR扩增结果指其Ct值，即Her2基 因与内参基因的巧光信号到达设定的阔值时所经历的循环数。通过化r2基因与内参基因 PCR扩增结果的计算来对检测结果给出判定的方式是:Her2基因 Ct《32,判定结果：阳性； 化r2基因 Ct〉32,化r2基因 Ct-内参基因 Ct《8,判定结果：阳性;Ct〉32,化r2基因 Ct-内参基因 Ct〉8,判定结果：阴性。
[0029] 2、本发明利用循环肿瘤DN的化r2基因模板非特异性扩增，提高了其灵敏度，可W在 循环肿瘤DNA中检测化r2基因状况，操作简单。通过目的基因与内参基因 PCR扩增结果的计 算，来对检测结果给出判定，提高了检测结果的敏感性和可靠性。
[0030] 3、本申请与直接测序法的不同之处在于此申请所用方法为直接通过PCR(聚合酶 链式反应)得到的巧光信号直接判断化r2基因状态;而直接测序法需要通过PCR对目标区域 扩增后进行测序反应方能得到化r2基因的状态。
[0031] 4、本发明所述试剂盒的组份设置及其结果判读方案使得检测过程简便，可操作性 强。检测结果可靠、特异性好。
[0032] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 而可依照说明书的内容予W实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够 更明显易懂，W下特举本发明的【具体实施方式】。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步的阐述，应理解，运些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后本领域技术 人员可W对本发明做各种改动或修改，运些等价同样落于本申请所附权利要求书所限定的 范围。
[0034] 实施例1:
[0035] 材料:待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。所述阳性质控品为乳腺癌患者基 因组DNA，所述阴性质控品为正常人类基因组DNA。
[0036] 所用引物和探针:化r2基因目的位点引物:SEQ ID N0:1和沈Q ID N0:2;化r2基因 特异的水解探针SEQ ID N0:3;内参基因的引物SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5;内参基因的水 解探针SEQ ID NO: 14,其中化r2基因目的位点引物和探针都是根据化r2基因共济失调毛细 血管扩张突变ATM区SEQ ID NO: 19设计并筛选的。所有引物和探针纯度应达到电泳级 (PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PA(iE电泳结果或 HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度 为long/μL备用。
[0037] 仪器:Lighixycler 480、nano化op 1000、高速离屯、机、水浴锅、縱满震荡仪、冰箱、 烘箱、灭菌锅。
[003引试剂：循环肿瘤DNA提取试剂盒（上海医脉赛科）、DNA聚合酶（罗氏公司）、10XPCR Buffer(罗氏公司）、MgC12(罗氏公司）、dNTP(TaKaRa)、纯化水。
[0039] (1)循环肿瘤DNA的提取
[0040] 采用上海医脉赛科技有限公司的循环肿瘤DNA提取试剂盒提取病人循环肿瘤DNA, 具体步骤如下：
[0041 ] A、血浆样品至2ml离屯、管中，加入蛋白消化液A、蛋白酶K、37°C恒溫解30min。B、加 入核酸结合液、DNA提取磁珠，混合后加入Solutio址R，置于旋转混和仪，溫和和混匀25min。
[0042] C、用磁分离架吸附磁珠 Imin，弃上清。
[0043] D、加入洗涂液I洗涂磁珠两次。
[0044] E、加入洗涂液II洗涂磁珠两次。
[0045] F、吸附磁珠，弃上清后静置3-6min。
[0046] G、加入洗脱液，置于室溫，混和均匀洗脱5min。
[0047] Η、磁场吸附磁珠，回收含基因组DM的洗脱液。
[0048] I、通过微量DNA定量对样品中获得的DNA含量进行定量测定。
[0049] J、将上述获得的循环肿瘤DNA作为模板。
[0050] (2)PCR反应的体系和反应条件
[0化1 ] 所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1~10XPCR缓冲液、0.1~ImM dNTPs、0.1 ~luM Her2基因引物、0 . 1~luM内参基因引物0.05~2ng/ul模板DNA、0 . 1~luM Her2Taqman水解探针、0.1~luM内参基因 Taqman水解探针、0.01~0. lOU/ul TaqDNA聚合 酶、1~5mM氯化儀。
[0052] 所述检测基因为化r基因、所述内参基因为GAPDH。所述化r2基因的探针和内参基 因的探针5/端报告巧光基团为FAM;所述化r2基因的探针和内参基因的探针y端的泽灭基 团为B册1。
[0053]所述dNTPs中包括lOmM dATPUOmM dCTP、10mM dTTP和lOmM dGTP，所述PCR体系中 包含Tris · Cl、氯化钟、硫酸儀和氯化儀。
[0054] 所述PCR扩增反应的具体过程为:92~97°C预变性5~35分钟，再进行聚合酶链式 反应扩增阶段，92~97°C变性10~30s，50~65°C退火10~30s，并进行35~55个循环。
[0055] (3)PCR反应的加样布局(见表1)
[0056] 待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模板对照均进行3个复孔检测，PCR仪 96孔板加样布局见下表。表中PC代表阳性质控品（Positive Control)，NC代表阴性质控品 (Negative Control)，NTC代表无模板对照（No template control)，S代表检测样本 (sample)。
[0化7] 表1
[0化引 ____
[0059] 实验结束W后，按W下步骤进行检测结果的分析、判定:
[0060] 进行无模板对照(NTC)的扩增曲线分析，Her2基因和内参基因（最优选:ACTB)此时 应无扩增曲线明显扩增信号，说明实验无污染，可W继续分析。
[0061] 质控品的内参基因（ACTB)应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，质控品内参基因 (ACTB)的CP值应符合下表中参数范围；阴性质控品的化r2基因应无明显扩增曲线变化，阳 性控品化r2的CP值应符合下表中质控品的参数范围。质控品检测满足W上条件时，证明实 验有效，可继续分析。
[0062] 样本的内参基因（ACTB)应均有扩增信号，且呈S型扩增曲线，样本单个PCR检测结 果应按照表2样本检测-单个PCR结果判读。
[0063] 表 2
[0064]
[0065] 若不符合表2中的1、2项要求，则建议重新检测。
[0066] 在W上实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如按照分子克 隆实验指南（第Ξ版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件或制造厂商所建议的条件进行操 作。
[0067] 临床实施例:
[0068] a)样本选择依据
[0069] 样本为经病理学检查确诊为浸润性乳腺癌患者的石蜡包埋组织切片。
[0070] b)入选标准
[0071 ] 1.临床上已确诊的浸润性乳腺癌患者；
[0072] 2.可获得足够病理标本；
[0073] 3.有免疫组化法（1肥)测定结果
[0074] C)排除标准和剔除标准
[0075] 1.FI甜杂交片不可读；
[0076] 2.相邻组织切片肥染色光镜下见浸润性乳腺癌细胞数量少；
[0077] 3.内对照组呈现非预想结果；
[007引 4.FISH信号不均一(一致性<75%);
[0079] 5.出现背景弥散信号(>10%信号位于细胞浆）；
[0080] 6.酶消化过度(核分辨不清、持续性自发巧光）；
[0081 ] 7.细胞核轮廓不清或有重叠；
[0082] 8.未按照说明书中的标准方法进行操作，比如未用中性缓冲甲醒固定、固定少于 化或多于4她；
[008；3 ] d )、样本采集、保存、运输方法等
[0084]样本采集为浸润性乳腺癌患者的石蜡标本，于10%的中性福尔马林固定24-48小 时。切片厚度4μπι，在室溫中至少可W保存一年。运输过程中，不得剧烈震荡，W免影响检测 结果。
[00化]e)判定标准
[0086] 每例乳腺癌样本在浸润性癌区域，随机计数30个癌细胞核中的双色信号。W皿R- 2/CEP17比值作为肥R-2的扩增定量标准。皿R-2/CEP17〉2.2,提示扩增阳性;肥R-2/CEP17< 1.8,提示扩增阴性;二者比值介于1.8~2.2之间，为可疑结果;此时可选择增加细胞计数至 50个或由另外一个分析者重新计数，若仍为临界值则在FISH检测报告中注明或重复进行 FI甜或I肥检测。
[0087] 4、15例样本的检测结果显示，本发明检测结果准确度与临床金标检测结果完全一 致。 Γ00881
[0089] 对比例:
[0090] 探针GEP17/GLP 肥R2
[0091] 1、对比例来源
[0092] 购于美国Creative Diagnostic公司，美国Creative Bioarray公司
[0093] 2、主要原材料确定依据
[0094] (1)质理标准
[00M]①生产商提供的技术指标
[0096]
[0097] ②适用于本产品的技术要求
[0098] 性状要求:粉色液体
[0099] 灵敏度、特异性和准确性均能达到本实验的要求。
[0100] (2)试验设计
[0101] 探针质量是决定FISH实验是否成功的关键因素。探针的灵敏度、特异性和稳定性 是选择探针的主要指标。我们通过对不同公司探针(GEP17，GLP皿R2)的灵敏度、特异性和 稳定性检测，来选择探针来源。
[0102] ①灵敏度
[0103] 在阴性参考片中分析50个中期分裂相，应该有至少98条17号染色体着丝粒位置显 示绿色巧光;至少98条肥R-2/neu基因（17ql2)的位置显示红色巧光。
[0104] ②特异性
[0105] 阴性参考片N1中期分裂相，要求应无任何染色体位点之间的交叉杂交现象；杂交 只出现在巧巾探针预期的祀区域中。
[0106] ③准确性
[0107] 将探针与3张阴性参考片N2~N4、3张阳性参考片P1~P3进行杂交，在显微镜下观 察结果。根据结果判读标准，其符合率应为100 %。
[010引（3)试验结果
[0109] 表1不同厂家探针选择试验结果对比
[0110]
[0111]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征W及方法，但本发 明并不局限于上述详细特征W及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征W及方法 才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料 和步骤的等效替换W及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护 范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒，所述试剂盒包括：靶向 Her2基因目的位点的特异引物、Her2基因特异性水解探针、内参基因的引物和内参基因的 水解探针。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其中所述Her2基因目的位点为Her2基因共济失调毛细 血管扩张突变ATM区。3. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述内参基因为GAPDH、f3-actin、B2M、SDHA、 HPRT1中的一种或者多种。4. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因目的位点的特异引物分别为： 正向引物：SEQ ID N0:1; 反向引物：SEQ ID N0:2。5. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因特异性水解探针为SEQ ID N0:3。6. 如权利要求3所述的试剂盒，其中所述内参基因的引物选自以下引物对:SEQ ID NO: 4和5、SEQIDN0:6和7、SEQIDN0:8和9、SEQIDN0:10和11以及SEQIDN0:12和13。7. 如权利要求3所述的试剂盒，其中所述内参基因的水解探针选自SEQ ID NO 14-18中 的任一个。8. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因的探针和内参基因的探针5'端报 告荧光基团分别选自FAM、TET、HEX、TAMRA、Texas Red、Rox和Cy5中的一种。9. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因的探针和内参基因的探针3'端的 淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和DABCYL中的一种。10. 如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述试剂盒中还包含阴性质控品、阳性质控品 和无模板对照。11. 如权利要求10所述的试剂盒，其中所述阳性质控品为乳腺癌Her2阳性基因组DNA、 所述阴性质控品为健康人全基因组DNA。12. 如权利要求1-11中任一项所述的试剂盒在制备用于扩增人外周血循环肿瘤DNA中 Her 2基因的药物中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK106011239SQ201610341102
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】章文羿, 李晶, 崔航, 黄清瑞
【申请人】北京安必奇生物科技有限公司