使用非扩增dna的直接snp检测的制作方法

专利名称：使用非扩增dna的直接snp检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测样品中目标核酸分子的方法，该样品中包含具有比扩增的核酸分子更高的生物复杂度的核酸分子，例如在基因组DNA中。具体地，本发明涉及使用纳米粒子标记的探针检测SNP的方法和探针。本发明也涉及检测生物学有机体，具体为样品中的细菌病原体如葡萄球菌DNA，和检测抗生素抗性基因，如赋予抗生素甲氧西林(methicillin)抗性的mecA基因的方法。
背景技术：
在不同个体中观测到的基因组DNA之间的单核苷酸多态性(SNPs)或者单碱基变异不仅构成了遗传多样性的基础，也被认为是疾病倾向的标记，可用于更好地进行疾病控制、增加对疾病状况的理解、以及最终促进发现更有效的药物。因此，为了这个共同的目标，即发展可以快速可靠地鉴别SNPs的方法，正在进行着大量努力。由于人类基因组DNA固有的复杂度(单倍体基因组＝3×109bp)和相关的敏感性的需要，大多数的这些努力都需要通过如PCR等方法进行目标扩增。直接在人类基因组DNA中检测SNPs的能力将使检测简单化，并且消除SNP鉴别中与目标扩增相关的误差。
可以采用许多方法鉴定单核苷酸多态性，包括DNA测序、限制性酶分析、或特异性位点杂交。但是，对SNP和突变的高通量基因组范围的筛选，需要高度精确和灵敏地同时分析多个位点的能力。为了提高灵敏度和特异性，目前检测单核苷酸的高通量方法依赖于涉及目标核酸样品扩增的步骤，通常采用聚合酶链式反应(PCR)(参见，例如，Nikiforov等，公布于1997年10月21日的U.S.Pat.No.5,679,524；McIntosh等，公布于1998年12月30日的PCT申请WO 98/59066；Goelet等，公布于1995年5月11日的PCT申请WO 95/12607；Wang等，1998，Science 2801077-1082；Tyagi等，1998，Nature Biotechnol.1649-53；Chen等，1998，Genome Res.8549-556；Pastinen等，1996，Clin.Chem.421391-1397；Chen等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.9410756-10761；Shuber等，1997，Hum.Mol.Gen.6337-347；Liu等，1997，Genome Res.7389-398；Livak等，Nature Genet.9341-342；Day和Humphries，1994，Anal.Biochem.222389-395)。之所以PCR扩增对基于SNP的传统杂交是必要的，主要有两个原因第一，当获得每个单倍体基因组具有3,000,000,000个碱基对的人总DNA时，含有SNP位点的目标序列仅仅代表了总DNA的非常小的一部分。例如，20个碱基对的目标序列仅仅代表了总DNA的0.00000033％(正常的基因组有两个目标序列拷贝，但是他们具有不同的SNP位点，并因此被认为是不同的位点)。因此，由于灵敏度的不足，少数微生物的通常的DNA样品对于许多的现有技术来讲是不够的。然而，更重要的原因是，足够短的以致于允许区分单个碱基的寡核苷酸与20个碱基的目标序列的杂交并非专一地与目标区杂交，而是在较小程度上与基因组中其他的区域结合。由于非目标DNA的压倒性数量，非特异性杂交制造了很大的背景，以致于掩盖了特异性信号。因此，一个目标区的扩增就成了显著减少非特异性序列的必要步骤。此扩增步骤称为“复杂度简化(complexity reduction)”。然而，PCR技术的保真度是有限的。PCR引物对的组合倾向于产生假反应产物或者在一些特定区域是不成功的。另外，当非目标序列被复制后，或者由于错误结合而使错误被导入目标序列时，终产物中的错误数就随着每个循环的PCR扩增呈指数上升。这样，在搜寻核酸群体中的罕见变异时，PCR错误就可能是一个基本的缺点。
最后，使用目标扩增的缺点是每个SNP位点都必须分开扩增。而由于人类基因组中可能有数百万的SNP，因此，这成为无法完成的任务。即便扩增的方法和策略是围绕SNP-位点特异性扩增问题，当前的技术发展水平也只能同时鉴定总SNP中的很小比例(少于0.1％)(见，例如，Kennedy等，2003，Nature Biotechnol.211233-1237)。Whitehead生物医学研究院(Whitehead Institute for Biomedical Reserch)的Eric Lander和人类基因组计划的其中一个领导者指出，舍弃目标扩增是基因组范围SNP筛选中最重大的挑战之一(见Lander E.1999，Nature Genetics Suppl.213-4)。因此，现有技术中还需要更加灵敏、有效、成本低的检测样品中SNP的方法，这样的方法不需要目标扩增或者复杂度简化。
DNA突变的鉴定对于微生物的鉴定也是重要的(见Edwards等，J.Clin.Micro.393047-3051)。例如，葡萄球菌属包括至少38个不同的种，这些种中的大多数在医院感染中被鉴定(Edwards等，J.Clin.Micro.393047-3051)。因此，微生物的快速鉴定和物种形成分析(speciation)对鉴定感染源是重要的，感染源的鉴定帮助确定病人的治疗方法、以及在流行病学意义上识别感染的发作和医院病原体的交叉传播(Olive和Bean，1999，J.Clin.Micro.371661-1669)。基于生化测试的鉴别细菌的传统方法通常时间较长(1＞天)并且常常无法精确鉴别具体物种(Hamels等，2001，Biotechniques 311364-1372)。因此，大量的工作都专注于发展更加快速、精确、并且代价更小的基于核酸序列鉴定的具体细菌物种鉴别方法，尤其是医院病原体如葡萄球菌。相同家族或属的微生物包含系统发生上保守的编码相同蛋白的基因(Hamels等，2001，Biotechniques 311364-1372)。尽管来自相同家族的基因序列通常是高度保守的，但还是鉴别出了多种基因(如16S rRNA)之中的种特异性序列突变。已经发展出靶向16S rRNA基因可变区的寡核苷酸探针用于实时PCR检测来鉴定多种凝固酶阴性和阳性葡萄球菌物种(Edwards等，J.Clin.Micro.393047-3051)。
另外，已经发展了微阵列通过PCR扩增的femA基因序列来鉴定葡萄球菌属、种和抗生素抗性(Hamels等，2001，Biotechniques 311364-1372)。微阵列包含识别femA基因中种特异性序列变异(三个或更多个碱基的序列变异)的寡核苷酸探针，femA基因与5种临床相关的葡萄球菌菌种(金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、人型葡萄球菌(S.hominis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus))有关，而靶向相同基因保守区的寡核苷酸探针用于葡萄球菌属的鉴别。然而，微阵列和基于实时PCR的检测的一个主要的缺点就是需要PCR，这使得无论是从临床还是从成本的观点来看都不太理想(见上述用于SNP鉴定的PCR讨论)。因此，现有技术中仍然需要更加灵敏、有效、成本更低的用于检测和分析样品中的生物学微生物的方法，这样的方法不需要目标扩增或者复杂度简化。
发明概述本发明提供检测样品中目标核酸序列的方法，其中样品包含比扩增的核酸分子更高生物复杂度的核酸分子，目标核酸序列与已知核酸序列至少有一个单核苷酸的不同。例如，一个单核苷酸的差异就可以是一个单核苷酸多态性。
一方面，不包括前期目标扩增或复杂度简化的检测样品中目标核酸序列的方法包括下述步骤a)提供结合有捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中捕获寡核苷酸具有与目标核酸序列的第一部分的至少一部分互补的序列；b)提供包含探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)中的目标核酸序列的第二部分的至少一部分互补的序列；c)在捕获寡核苷酸能够与目标核酸序列的第一部分有效杂交，以及探测探针能够与目标核酸序列的第二部分有效杂交的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与目标核酸序列的第一和第二部分杂交。
另一方面，不包括前期目标扩增或复杂度简化的检测样品中目标核酸序列的方法包括下述步骤a)提供结合有许多捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中捕获寡核苷酸具有与目标核酸序列的一个或一个以上部分互补的序列；b)提供包含探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)中不被基板上的捕获寡核苷酸识别的目标核酸序列的一个或一个以上部分互补的序列；c)在捕获寡核苷酸能够与目标核酸序列的一个或一个以上部分有效杂交，以及探测探针能够与不被捕获寡核苷酸识别的目标核酸序列的一个或一个以上部分有效杂交的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与目标核酸序列杂交。
本发明也提供了鉴定样品中单核苷酸多态性的方法，其中样品中包含比扩增的核酸分子更高生物复杂度的核酸分子。
一方面，不包括前期目标扩增或复杂度简化的鉴定样品中单核苷酸多态性的方法包括步骤a)提供结合有至少一个捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中所述的至少一个捕获寡核苷酸具有与包含特定多态性的核酸靶物的至少一部分互补的序列；b)提供结合有探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)的核酸靶物的至少一部分互补的序列；c)在捕获寡核苷酸能够与核酸靶物有效杂交，以及探测探针能够与核酸靶物有效杂交的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与核酸靶物杂交。
另一方面，不包括前期目标扩增或复杂度简化的鉴定样品中单核苷酸多态性的方法包括步骤a)提供结合有多个捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中捕获寡核苷酸具有与核酸靶物的多个部分互补的序列，每个部分都包含特定的多态性；b)提供含有探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)的核酸靶物的至少一部分互补的序列，核酸靶物不被基板上的捕获寡核苷酸所识别；c)在捕获寡核苷酸能够与核酸靶物的多个部分有效杂交，以及探测探针能够与核酸靶物有效杂交的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与核酸靶物杂交。
在一个实施方案中，目标核酸的核苷酸差异或者单核苷酸多态性能够被结合于基板上的捕获寡核苷酸或者探测寡核苷酸所识别。
在另一个实施方案中，样品中的目标核酸分子包含基因组DNA、基因组RNA、表达的RNA、质粒DNA、线粒体或其他细胞器官DNA、游离的细胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述两种或两种以上的混合物。
在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的基板可以包含许多捕获寡核苷酸，每个捕获寡核苷酸能够识别一个或一个以上不同的单核苷酸多态性或核苷酸差异，样品可以包含一个以上的核酸靶物，每一个核酸靶物都包含不同的单核苷酸多态性或核苷差异，能够与许多捕获寡核苷酸中的其中一个杂交。此外，本发明的方法可以提供一个或一个以上类型的探测探针，每一类型的探测探针都结合有探测寡核苷酸，能够与不同的核酸靶物杂交。
在一个实施方案中，样品可以与探测探针接触，以使存在于样品中的核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交，然后，可以将结合于探测探针上的核酸靶物与基板接触，以使核酸靶物与基板上的捕获寡核苷酸杂交。任选地，样品可以与基板接触，以使样品中的核酸靶物与捕获寡核苷酸杂交，然后，与捕获寡核苷酸结合的核酸靶物可以与探测探针接触，以使核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交。在另一个实施方案中，样品可以同时与探测探针和基板接触。
在另一个实施方案中，探测寡核苷酸可以包含可探测的标记。该标记可以是，例如，荧光的、发光的、发磷光性、放射性的、或者是纳米粒子，可以将探测寡核苷酸连接于树枝状高分子(dendrimer)、分子聚集体(molecular aggregate)、量子点(quantum dot)、或者珠子。所述标记可通过例如光子学、电子学、声学、光声、重力、电化学、电光、质谱、酶学、化学、生物化学、或者物理学手段探测。
在一个实施方案中，探测探针可以是结合有探测寡核苷酸的纳米粒子探针。纳米粒子可由贵重金属如金或银制成。纳米粒子可以使用例如光学或平板扫描仪检测。扫描仪可连接在电脑上，电脑上安装了能够计算灰度值的软件，所计算的灰度值提供检测到的核酸量的定量值。在由金、银或其他金属制成的能够促使自动金属显影(autometallography)的纳米粒子所在位置，可以通过银染高灵敏度地检测以目标核酸分子的方式与纳米粒子结合的基板。任选地，可以通过检测纳米粒子散射的光来检测与纳米粒子结合的基板。
在另一个实施方案中，可以将附着于基板的寡核苷酸置于两个电极之间，纳米粒子可以由电导体材料做成，本发明的方法的步骤(d)可以包括检测导电性的变化。在另一个实施方案中，其中每一个都能够识别不同的目标核酸序列的许多寡核苷酸附着于基板上的斑点阵列中，每个寡核苷酸斑点都位于两个电极之间，纳米粒子可以由电导体材料做成，本发明的方法的步骤(d)可以包括检测导电性的变化。电极可以由例如金制成，纳米粒子也由金制成。可选地，基板可以和银染区(silver stain)接触以产生导电性的变化。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以用来区分两个或两个以上同属的物种。一方面，这些物种可以有两个或两个以上不连续核苷酸的不同。另一方面，这些物种可以有两个或两个以上连续核苷酸的不同。
在一个实施方案中，本发明的目标核酸序列可以是葡萄球菌基因的一部分。这个实施例方案一个方面，葡萄球菌可以是例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、里昂葡萄球菌(S.lugdunensis)、人型葡萄球菌(S.hominis)、腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)。因此，本发明的方法可以用于葡萄球菌的物种形成分析(例如区分不同种类的葡萄球菌)。
在另一个实施方案中，本发明的目标核酸序列可以是mec A基因的一部分。因此，本发明的方法可以用于鉴定甲氧西林(methicillin)抗性菌株。
在本发明的另外一个实施方案中，目标核酸序列、捕获寡核苷酸、和/或探测寡核苷酸可以包括SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ IDNO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ IDNO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ IDNO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ IDNO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ ID NO78所列出的序列。
通过以下对一些优选实施方案和权利要求更为详细的描述，本发明具体的优选实施方案将会更明显。


图1为本发明一步杂交法示意图。
图2为本发明两步杂交法示意图。
图3示意性显示纳米粒子标记的探测探针、结合于基板的野生型或突变型捕获探针和野生型靶物的杂交复合体。为了检测SNP，测试在适当的实验条件下进行，在该实验条件下可以保留完好匹配的复合体(左)而阻止含有错配的复合体的形成(右)。
图4显示用未扩增的人类基因组DNA[(a)部分]或者鲑精DNA[(b)部分]，在具有野生或突变的因子V基因捕获探针的Superaldehyde片上进行的因子V基因(1691 G->A)的SNP检测。(c)部分是在野生型或突变型捕获探针存在下，进行人类基因组DNA和非特定鲑精DNA的检测信号强度分析的总结图。
图5显示为使本发明的方法能够区分有一个核苷酸(SNP位点)差异的两个目标核酸而调节杂交条件的重要性。
图6(a)、(b)和(c)显示可以设计阵列(捕获探针序列)和杂交条件，以致于可以在同一阵列和同样的杂交条件下检测一个以上的SNP类型，在不依赖于输入DNA的条件下，使野生型和突变型DNA之间的SNP辨别成为可能。
图7显示在CodeLink载片上，在不同甲酰胺浓度条件下，以杂交的方法用非扩增人基因组DNA((a)部分)进行因子V突变基因(1691 G->A)的SNP检测，CodeLink载片上排列了野生型和突变型因子V基因捕获探针。(b)部分图表对人类基因组DNA检测信号强度分析进行了概括，该检测信号强度分析是在野生型或突变型捕获探针存在下，在不同甲酰胺浓度下杂交之后进行的。
图8显示在经最佳调整的条件下，人野生型DNA只在野生型探针上产生信号，而人突变型DNA只在突变型捕获探针上产生信号。
图9(a)-(d)显示图8中理想(中间的)杂交条件的定量数据。
图10(a)和(b)显示可以使用非常少量的(少于1毫克)人总DNA来辨别SNP。图10也显示了捕获寡核苷酸的设计和严格条件下的适当匹配对于捕获(和探测)探针的长度和核苷酸成分的重要性。
图11(a)和(b)显示使用本发明的方法，在一个载片上的10个单独杂交中，在基因组DNA中进行SNP检测的结果。10个杂交中匹配和错配净信号强度标准偏差没有重叠，意味着对于每一个杂交反应，都能够可靠地确定输入DNA的SNP基因型。
图12(a)和(b)显示使用本发明的方法在整个基因组DNA中进行多重SNP鉴定的结果，其中检测因子V、因子II和MTHFR基因的基因型。
图13(a)和(b)显示在患者样品GM16028的整个基因组DNA中进行多重SNP鉴定的结果，其显示了本发明的方法鉴定单一个体中因子V、因子II和MTHFR基因的杂合SNP基因型的能力。
图14(a)和(c)显示在患者样品GM00037的整个基因组DNA中进行多重SNP检测的结果，其显示本发明的方法鉴定单一个体对一个基因是野生的(本例中为因子V)、对另一个基因(本例中是因子II)是杂合的、对第三个基因(本例中为MTHFR)是突变的能力。
图15(a)-(f)显示三个不同的研究者对两个单独的患者样品实施本发明的方法的结果。
图16(a)-(b)显示使用固定在玻璃片上的mecA 2和mecA 6捕获寡核苷酸，对源于葡萄球菌基因组DNA的mecA基因的特异性检测结果，其中葡萄球菌基因组DNA分离于甲氧西林抗性(mecA+)金黄色葡萄球菌细胞，mecA 4标记的金纳米粒子作为探测探针。分离于甲氧西林敏感(mecA-)金黄色葡萄球菌细胞的葡萄球菌基因组DNA用作阴性对照。以已知量的PCR扩增的mecA基因(标记为MRSA 281bp的281个碱基对片段(281 base-pairfragment labeled MRSA 281bp))用作阳性对照。(a)部分显示一系列来自微阵列孔的扫描图像，微阵列孔含有数量不等的甲氧西林抗性基因组DNA靶物(75-300百万拷贝)，阳性对照和阴性对照样品与其相同。(b)部分是显示样品数据分析的图表。通过减去相应的阴性对照斑点的信号来绘制甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌基因组DNA的净信号。在所有的线条中，水平黑线代表相对于含有甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌基因组DNA的阴性对照斑点的三个标准偏差。本图显示对来自总细菌基因组DNA的mec A的特异性检测。
图17用源于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(ATCC编号分别为700699和35984)的PCR扩增子(amplicon)或基因组DNA例示葡萄球菌物种形成分析。为了检测总基因组DNA，在阵列杂交之前，采用超声降解法使DNA样品片段化。(a)部分是一系列来自微阵列孔的扫描图像，微阵列含有Tuf 372bp扩增子或基因组DNA(300ng，～8.0E7拷贝)。水(无靶物)用作对照。阵列板包括结合在其上的Tuf 3和Tuf 4捕获探针。金纳米粒子标记的Tuf 2探针用作探测探针。(b)部分提供了代表(a)部分所示的样品数据分析的图表。水平黑线代表相对于背景的三个标准偏差。(c)部分Tuf 372bp扩增子或者基因组DNA(8.0E7拷贝)。阵列板包括结合在其上的Tuf 5和Tuf 6捕获探针。(d)部分提供了代表(c)部分所示的样品数据分析的图表。水平黑线代表相对于背景的三个标准偏差。
图18(a)-(c)提供了实施例4-6中所用的281个碱基对的金黄色葡萄球菌mecA、450个碱基对的金黄色葡萄球菌coa、142个碱基对的金黄色葡萄球菌Tuf、372个碱基对的金黄色葡萄球菌Tuf和372个碱基对的表皮葡萄球菌Tuf的PCR扩增子的序列。
图19(a)-(j)例示使用PCR扩增的靶物进行葡萄球菌物种形成分析和mecA基因检测，PCR扩增的靶物取自商业上可获得的葡萄球菌株ATCC 35556、ATCC 35984、ATCC 12228、ATCC 700699、和ATCC 15305。(a)、(c)、(e)、(g)和(i)部分是来自微阵列孔的一系列扫描图像，微阵列含有代表5个基因组样品的16S、Tuf或mecA基因中任何一个的PCR产物。(b)、(d)、(f)和(h)部分是代表5个样品数据分析的一系列图表。所有线条中，水平黑线代表相对于背景的三个标准偏差。
图20(a)-(f)例示使用超声降解的基因组DNA靶物进行葡萄球菌物种形成分析及mec A检测，基因组DNA靶物来自商业上可获得的葡萄球菌株系ATCC 35984、ATCC 700699和ATCC 12228。(a)、(c)和(e)部分是微阵列孔的一系列扫描图像，微阵列含有来自ATCC 35984、ATCC 700699或ATCC12228中任一个的基因组DNA。阵列板包括结合有阴性杂交对照的16S 12、mecA 6、Tuf 3、Tuf 4、Tuf 10捕获探针。金纳米粒子标记的16S 13、mecA4和Tuf2探针用作探测探针。(b)、(d)和(f)部分是代表三个样品数据分析的一系列图表。所有线条中，水平黑线代表相对于背景的三个标准偏差。
图21为显示用基因组DNA靶物进行mec A基因检测的敏感性界限的图表。使用表3中的序列，在5x SCC、0.05％Tween 20、0.01％BSA、15％v/v甲酰胺和200pM纳米粒子探针条件下，45℃1.5小时，以进行ATCC700699基因组样品的mec A基因检测的数据分析。图21显示50μl反应体系中(34ng总基因组DNA)330fM的检测界限。图中80处的水平线代表相对于背景的三个标准偏差。
实施本发明的优选实施方案除非上下文另有要求，单数术语应当包括复数术语，复数术语应当包括单数术语。
除非另外指出，下述的术语同本说明书所使用的一致，应当理解为具有下述含义这里使用的“核酸序列”，“核酸分子”，或者“核酸”指这里定义的一个或一个以上寡核苷酸或多核苷酸。这里使用的“目标核酸分子”或“目标核酸序列”是指寡核苷酸或多核苷酸，该寡核苷酸或多核苷酸包含本发明方法使用者所要检测的样品中的序列。
此处术语“多核苷酸”的意思是至少10个碱基长度的单链或双链核酸多聚体。在某些实施方案中，包括多聚核苷酸在内的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或是他们中任何一种的修饰形式。所述的修饰包括碱基修饰如溴尿苷，核糖修饰如阿拉伯糖苷和2’，3’-二脱氧核糖，以及核苷间键修饰如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)。术语“多核苷酸”尤其包括单链和双链形式的DNA。
此处术语“寡核苷酸”指包括天然产生的核苷酸，以及通过天然和/或非天然产生的寡核苷酸键连接在一起的修饰核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的子集，包含通常为单链、具有200或更少碱基长度的成员。在某些实施方案中，寡核苷酸长10至60个碱基。在某些实施方案中，寡核苷酸长12、13、14、15、16、17、18、19、或者20至40个碱基。寡核苷酸可以是单链或双链的，例如，用于基因突变体的构建时。关于编码蛋白质的序列，本发明的寡核苷酸可以为有义或反义寡核苷酸。
术语“天然产生的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括糖基团被修饰或取代的核苷酸或类似的核苷酸。术语“寡核苷酸键”包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯之类的寡核苷酸键。参见，例如，LaPlanche等，1986，Nucl.Acids Res.，149081；Stec等，1984，J.Am.Chem.Soc.，1066077；Stein等，1988，Nucl.Acids Res.，163209；Zon等，1991，Anti-Cancer Drug Design，6539；Zon等，1991，OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUESA PRACTICAL APPROACH，pp.87-108(F.Eckstein，Ed.)，Oxford University Press，Oxford England；Stec等，U.S.Pat.No.5,151,510；Uhlmann和Peyman，1990，Chemical Reviews，90543，其中公开的内容在此一并作为任何目的的参考。寡核苷酸可以包括可探测的标记，以便能够探测寡核苷酸或其杂交。
本发明的方法中所使用的“可寻址基板”可以是任何能够结合寡核苷酸的表面。这样的表面包括但不限于玻璃、金属、塑料或者是包被了功能基团的材料，其中功能基团设计用于结合寡核苷酸。包被可以比单分子层厚；事实上，包被可以包括足够厚的多孔渗水材料以形成多孔渗水的三维结构，寡核苷酸可以扩散至此三维结构并结合在其内表面。
此处所用术语“捕获寡核苷酸”指结合于基板的寡核苷酸，其包含可以将互补核苷酸序列或基因定位(即，在样品中杂交)于目标核酸分子上的核酸序列，并因此使目标核酸分子以杂交的方式通过捕获寡核苷酸附着于基板上。合适的但非限制性的捕获寡核苷酸的例子包括DNA、RNA、PNA、LNA、或者他们的组合。捕获寡核苷酸可以包括天然序列或合成序列，具有或不具有修饰的核苷酸。
本发明的“探测探针”可以是能够附着一个或一个以上探测寡核苷酸的任何载体，其中的一个或一个以上探测寡核苷酸包含与特定核酸序列互补的核苷酸序列。载体本身可以作为标记使用，或者可以包含可探测标记或者由可探测标记所修饰，或者探测寡核苷酸可以携带这样的标记。适于本发明方法的载体包括但不限于纳米粒子、量子点、树枝状高分子(dendrimers)、半导体、珠子、上转换或下转换荧光粉(up-or down-convertingphosphors)、大分子蛋白质、油脂、碳水化合物、或任何尺寸足够的适当的无机或有机分子、或其组合。
此处所用的“探测寡核苷酸(detector oligonucleotide)”或“探测寡核苷酸(detection oligonucleotide)”是如此定义的寡核苷酸其包含可将互补核苷酸序列或基因定位(即，在样品中杂交)于目标核酸分子上的核酸序列。探测寡核苷酸的适当的但非限制性的例子包括DNA、RNA、PNA、LNA、或其组合。探测寡核苷酸可以包括天然序列或合成序列，具有或不具有修饰的核苷酸。
此处所使用的术语“标记”指可以通过光子学、电子学、电光学、磁、重力、声学、酶学、或其它物理或化学手段探测的可探测标记。术语“标记的”指通过如结合放射性标记核苷或者将可探测标记附着于寡核苷酸来结合这样的可探测标记。
此处所用的“样品”指包含核酸的、能够用于本发明方法的任何数量的物质。例如，此样品可以是生物学样品或者可以从源于人、动物、植物、真菌、酵母、细菌、病毒、组织培养物或病毒培养物或其组合的生物样品提取得到。它们可以包含或者提取自固体组织(例如骨髓、淋巴结、脑、皮肤)、体液(例如血清、血液、尿、唾液、精液或淋巴液)、骨骼组织、或者个体细胞。可选地，样品可以包含纯化的或部分纯化的核酸分子，和例如缓冲剂和/或试剂，此缓冲剂和/或试剂用于得到能够成功实施本发明方法的适当条件。
本发明的一个实施例中，样品中的目标核酸分子可以包含基因组DNA、基因组RNA、表达的RNA、质粒DNA、细胞核酸或源于细胞器官(如线粒体)或寄生虫的核酸，或其组合。
此处所用的核酸分子的“生物复杂度”指存在于核酸分子中的非重复核苷酸序列的核苷酸数目，例如，Lewin所著GENE EXPRESSION 2，SecondEditionEukaryotic Chromosomes，1980，John Wiley & Sons，New York中所述，在此一并作为参考。例如，一个包含非重复序列的30个碱基的简单寡核苷酸其复杂度为30。含有4,200,000个碱基对的大肠杆菌(E.coli)基因组复杂度为4,200,000，因为它基本上没有重复序列。然而，人类基因组具有类似的3,000,000,000个碱基对，其中很多是重复序列(例如大约2,000,000,000个碱基对)。类似地人类基因组的总复杂度(即，非重复核苷数)为1,000,000,000。
核酸分子如DNA分子的复杂度不依赖于不同重复序列的数目(即，存在于核酸分子中的每一不同序列的拷贝数)。例如，如果一个DNA具有1个长a个核苷酸的序列，5个拷贝的长b个核苷酸的序列，以及50个拷贝的长c个核苷酸的序列，其复杂度为a+b+c，序列a的重复频率为1，序列b的重复频率为5，序列c的重复频率为10。
可以通过计算DNA的Cot1/2以实验手段确定给定DNA中不同序列的总长度，可以由下面的公式表示，Cot1/2=1k]]>其中C是单链DNA在时间t1/2时的浓度(反应完1/2时)，k为速度常数。Cot1/2代表DNA的两条互补链一半复性时所需的数值。通常地，以Cot曲线方式表示DNA的复性，Cot曲线绘制出了保持单链的DNA的分数(fraction)(C/Co)相对于Cot的常用对数(log)的图或者复性DNA的分数(1-C/Co)相对于Cot的常用对数的图。Cot曲线是由Britten和Kohne于1968年提出的(1968，Science 161529-540)。Cot曲线显示，每条复性的序列的浓度决定了给定DNA的复性率。与此对照，Cot1/2代表存在于反应中的不同序列的总长度。
DNA的Cot1/2与其复杂度成比例。因此，可以通过将其Cot1/2与已知复杂度的标准DNA的Cot1/2对比，来完成DNA复杂度的确定。通常，用于确定DNA复杂度的标准DNA为大肠杆菌DNA，其具有与其基因组长度(4.2×106个碱基对)一致的复杂度，因为大肠杆菌基因组中的每个序列都被认为是唯一的。因此，下面的公式可用于确定DNA的生物复杂度。

在某些实施方案中，本发明提供了可靠的检测和区分(即，鉴定)总人DNA中具有核苷酸突变(如，单核苷酸多态性)的目标核酸分子的方法，此方法不需要首先通过PCR或任何其他方法优选对具体的DNA序列扩增以进行酶学复杂度简化。具体地，本发明的方法包含杂交条件组合(包括反应体积、盐、甲酰胺、温度、以及测试方式)、结合于基板的捕获寡核苷酸序列、探测探针、以及足够灵敏的目标核酸分子检测手段，其中目标核酸分子同时由捕获寡核苷酸和探测探针所识别。
如实施例中所显示的，本发明首次提供了通过一步杂交法成功检测总人类DNA中单核苷酸多态性的方法，该方法不需要前期的扩增或复杂度简化以选择性富集目标序列，也不需要任何酶反应的帮助，该一步杂交法包括两个杂交事件目标序列的第一部分与捕获探针的杂交，以及所述目标序列的第二部分与探测探针的杂交。图1显示一步杂交法示意图。如上面所讨论的，两个杂交事件均发生在同一反应中。靶物可以首先结合在捕获寡核苷酸上，然后再与探测探针如示意图中所示的纳米粒子杂交，或者靶物可以首先与探测探针结合，然后再与捕获寡核苷酸杂交。
在另一个实施方案中，本发明提供了可靠地检测和区分(即鉴定)总DNA中具有一个或一个以上不连续核苷突变的目标核酸分子的方法，此方法不需要首先通过PCR或任何其他方法优选对特定的DNA序列扩增以进行酶学复杂度简化。例如，本发明的方法可用于区分来自同一属的两个或两个以上不同物种的两个或两个以上目标核酸分子，其中这些物种有两个或两个以上不连续核苷酸的差异，可使用具有一个或一个以上核苷酸差异的捕获寡核苷酸和/或具有一个或一个以上核苷酸差异的探测寡核苷酸来区分。本发明的方法也可用于区分同一属中有两个或两个以上连续核苷酸差异的两个或两个以上物种。
在一个实施方案中，可以使用两步杂交法实施本发明的方法。图2显示两步杂交法示意图。这个方法中，杂交事件发生在两个单独的反应中。靶物首先结合在捕获寡核苷酸上，清除所有的非结合核酸后，进行第二次杂交，第二次杂交提供可特异地结合于捕获的目标核酸的第二部分的探测探针。
涉及两步杂交法的本发明的方法在第一次杂交事件(即目标核酸分子的捕获)期间，无需赋予探测探针某些独特的适应性特征(诸如高的Tm和纳米粒子探针的快速熔解行为)即可实施，因为反应是在两个步骤中发生的。第一个步骤没有严格到足以仅仅捕获所需的目标序列的程度。因此，提供第二个步骤(探测探针的结合)来获得所需的针对目标核酸分子的特异性。这两个识别性杂交事件的组合允许所有针对目标核酸分子的特异性。然而为了获得这个敏锐的特异性，所选择的杂交条件是非常严格的。在这样的严格条件下，只有少量的靶物和探测探针被捕获探针所捕获。靶物的量通常很小以致于标准的荧光方法不能检测到，因为它被掩埋于背景中。因此，对本发明来说，使用适当设计的探测探针检测这些少量的靶物是很重要的。本发明所描述的探测探针存在于载体部分，通常被修饰成包含许多的探测寡核苷酸，这样使得此探测探针的杂交动力学增强。第二，探测探针还用一个或一个以上高灵敏度的标记部分来标记，这些高灵敏度的标记部分与适当的检测工具一起，允许检测数量很小的捕获靶物-探测探针复合体。因此，正是因为适当地调整了所有因素，同时使用高灵敏度的检测系统，才使得该方法能够实施。
本发明的两步杂交法可以包含将此处描述的任何探测探针用于检测步骤。在优选实施方案中，纳米粒子探针用于本方法的第二个步骤中。第二个杂交步骤中使用纳米粒子探针的地方和严格性条件与第一步中相同，纳米粒子探针上的探测寡核苷酸可以比捕获寡核苷酸长。这样，纳米粒子探针的独特特征(高Tm和快速熔解行为)所必需的条件就不再需要了。
一步和两步杂交法与本发明中适当设计的捕获寡核苷酸和探测探针一起，提供了相对于以前的检测样品中目标核酸序列的方法来说，新的、意料不到的优势。尤其是，本发明的方法不需要扩增步骤，此扩增步骤的目的是将样品中靶物数量最大化，同时减少非目标序列的相对浓度以增加结合靶物的可能性，如基于聚合酶链式反应(PCR)的检测方法就需要这样的扩增步骤。无需前期目标序列扩增的特异性检测提供了巨大的有利条件。例如，扩增经常导致研究或诊断实验室的污染，导致假阳性测试结果。PCR或其他的目标扩增需要特别培训的人员、昂贵的酶和专门的设备。最重要的是，扩增的效率会随每一个目标序列和引物对而变化，导致确定存在于基因组中的目标序列或目标序列的相对量时出现错误甚至失败。另外，本发明的方法涉及很少的步骤，并因而比基于凝胶的核酸靶物检测方法，如Southern和Northern印迹测试方法，更加容易实施也更加有效。
在一个实施方案中，本发明提供了检测样品中目标核酸序列的方法，其中样品包含生物复杂度比扩增的核酸分子的生物复杂度更高的核酸分子，目标核酸序列与已知的核酸序列至少有一个核苷酸的差异，该方法包括步骤a)提供结合有捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中捕获寡核苷酸可以识别目标核酸序列的第一部分的至少一部分；b)提供包含探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸能够与步骤(a)中的目标核酸序列的第二部分的至少一部分杂交；c)在捕获寡核苷酸能够特异地、选择性地与目标核酸序列的第一部分有效杂交，以及探测探针能够特异地、选择性地与目标核酸序列的第二部分有效杂交的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与目标核酸序列的第一部分和第二部分杂交。在另一个实施方案中，可寻址基板上结合有许多捕获寡核苷酸，能够识别目标核酸序列的多个部分，包含探测寡核苷酸的一个或一个以上探测探针能够与目标核酸序列的一个或一个以上部分杂交，不能被捕获寡核苷酸所识别。
在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定样品中单核苷酸多态性的方法，其中样品包含生物复杂度比扩增的核酸分子的生物复杂度更高的核酸分子。该方法包括步骤a)提供结合有至少一个捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中所述的至少一个捕获寡核苷酸能够识别包含特定多态性的核酸靶物；b)提供结合有探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸能够与步骤(a)的核酸靶物的至少一部分杂交；c)在捕获寡核苷酸能够特异地、选择性地与核酸靶物有效杂交，以及探测探针能够特异地、选择性地与核酸靶物有效杂交的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与核酸靶物杂交。在另一个实施方案中，可寻址基板结合有许多捕获寡核苷酸，能够识别目标核酸序列的多个部分，包含探测寡核苷酸的探测探针能够与目标核酸序列的一部分杂交，而不被捕获寡核苷酸所识别。
本发明的方法可以区分仅有一个核苷酸差异的两个序列。因此，在具体的实施方案中，本发明的方法可用于检测具有至少一个核苷酸突变的具体目标核酸分子。在优选实施方案中，此突变是单核苷酸多态性(SNP)。
在另一个实施方案中，探测寡核苷酸可以被可探测地标记。标记多核苷酸的不同方法是现有技术中已知的，可以方便地应用于此处描述的方法中。在特定的实施例中，本发明的可探测标记可以是荧光的、发光的、拉曼(Raman)活性的、发磷光的、放射性的、或者在散射光中有效的、具有独特的质量的标记，或者是其它的具有一些其它容易探测的特定的可探测物理或化学特性的标记，为了增强所述的可探测特性，该标记可以聚集或者一个或一个以上的拷贝附着于载体上，诸如树枝状高分子(dendrimer)、分子聚集体、量子点或者珠子。标记允许通过例如光子学、电子学、声学、光声学、重力、电化学、酶学、化学、拉曼(Raman)、或者质谱手段探测。
在一个实施方案中，本发明的探测探针可以是结合有探测寡核苷酸的纳米粒子探针。由于源于其尺寸的独特物理化学特性，纳米粒子成为非常感兴趣的研究对象。由于这些特性，纳米粒子为比传统检测方法更敏感、特异性更强、更有成本优势的新型生物传感器的发展提供了很有前景的途径。合成纳米粒子的方法和研究由其衍生的特性的方法学在过去10间得到了广泛的发展(Klabunde，editor，Nanoscale Materials in Chemistry，WileyInterscience，2001)。然而，由于纳米粒子和生物分子这两种迥异的材料之间固有的不相容性，因而缺乏用感兴趣的生物分子功能化纳米粒子的强有力的方法，并因此导致纳米粒子在生物学意义上的应用受到限制。已经发展出用修饰的寡核苷酸功能化纳米粒子的高效方法。见U.S.Patent No.6,361,944和6,417,340(assigneeNanosphere，Inc.)，将其整体一并作为参考。该方法得到由寡核苷酸高度功能化的纳米粒子，其具有令人惊讶的粒子稳定性和杂交特性。由其溶液稳定性可证实所得的DNA修饰的粒子是非常强有力的，其中溶液稳定性包括电解浓度的提高、对离心或冷冻的稳定性、以及重复加热和冷却时的热稳定性。这个装载方法是可控制可修改的。功能化不同大小和成分的纳米粒子，以及向纳米粒子上装载寡核苷酸识别序列可通过装载方法来控制。合适的但非限制性的纳米粒子的例子包括U.S.专利No.6,506,564，国际专利申请No.PCT/US02/16382，提交于2003年5月7日的U.S.专利申请No.10/431,341，以及国际专利申请No.PCT/US03/14100中所描述的那些纳米粒子，所有这些文献此处整体一并作为参考。
前述的制备DNA修饰的纳米粒子，尤其是DNA修饰的金纳米粒子探针的装载方法，已使针对寡核苷酸的新的比色意义上的方案得到发展。这个方法基于两个金纳米粒子探针与感兴趣的DNA靶物的两个不同区域的杂交。由于每一个探针被多个具有相同序列的寡核苷酸功能化，因而当存在足够的靶物时，靶物的结合导致目标DNA/金纳米粒子探针聚集体的形成。由于粒子间距离的缩短，DNA靶物的识别导致比色改变。此比色改变可以用UV-vis分光光度计通过光学手段监测或者用裸眼视觉监测。另外，当溶液浓缩至膜上时颜色加深。因此，简单的比色改变提供了存在或不存在特定DNA序列的证据。使用这个测试，可以检测到飞摩尔(femtomole)量和纳摩尔浓度的模型DNA靶物以及聚合酶链式反应(PCR)扩增的核酸序列。重要地，金探针/DNA靶物复合体显示了非常快速的熔解转变，使之成为高度特异的DNA靶物标记。在模型系统中，一个碱基的插入、删除、或者错配可以通过基于颜色和温度的斑点测试(spot test)或者通过分光光度法监视聚集体的熔解转变很容易地检测到(Storhoff等，J.Am.Chem.Soc.，120，1959(1998))。也可参见，例如，U.S.Patent No.5,506,564。
由于急速的熔解转变，当杂交和检测在非常严格的条件下(例如，比完好匹配的探针/靶物的熔解温度低一度)进行时，即使存在错配的靶物，也可以检测到匹配完好的靶物。伴随着例如通过分子荧光团标记观测到的更宽的熔解转变，在与熔解温度接近的温度条件下的杂交和检测将导致明显的信号丢失，因为探针/靶物复合体的部分熔解导致较低的灵敏度，同时由于错配探针信号的影响，错配探针/靶物复合体的部分杂交也导致较低的特异性。因此，纳米粒子探针提供了检测特异性更高的核酸检测方法。
如此处所述，纳米粒子探针，尤其是金纳米粒子探针，令人惊讶且出乎意料地适合于基因组DNA的直接SNP检测，且无需扩增。首先，在纳米粒子寡核苷酸探测探针中观测到的非常快速的熔解转变转化为具有空前的、令人惊讶的检测特异性，即使在人类基因组背景下也能够允许单个碱基的辨别。第二，在基于DNA微阵列的测试中，基于银的信号放大方法可进一步提供超高的灵敏度提升。
在本发明方法中可以使用例如光学或平板扫描仪来检测纳米粒子。扫描仪可以连接到电脑上，电脑上装载了能够计算灰度值的软件，计算得到的灰度值提供所检测的核酸量的定量值。
适当的扫描仪包括那些用于将文档扫描至电脑中的、能够以反射方式(例如平板扫描仪)工作的扫描仪、其他能够执行这项功能的或者使用相同的光学器件装置、任何类型的灰度敏感测定装置、以及经改装用于扫描本发明的基板的标准扫描仪(例如，经改装的包含基板支撑物的平板扫描仪)(目前，尚未发现能够使用以传输模式工作的扫描仪)。扫描仪的分辨率必须足够大，以使基板上的反应区大于扫描仪的单个像素。在测试中产生的可检测变化相对于基板能够被观测到的前提下(例如，银染中产生的灰斑，可以在白色背景下观测到，但不能在灰色背景下观测到)，扫描仪可以与任何基板一起使用。扫描仪可以是黑白扫描仪或者优选彩色扫描仪。
最优选地，所述扫描仪是用于将文档扫描入电脑的标准彩色扫描仪类型。这样的扫描仪价格便宜，商业上容易获得。例如，可以使用EpsonExpression 636(600×600dpi)、UMAX Astra 1200(300×300dpi)、或者Microtec 1600(1600×1600dpi)。扫描仪连接到电脑上，电脑中装有处理扫描基板获得的图像的软件。此软件可以是商业上容易获得的标准软件，如Adobe Photoshop 5.2和Corel Photopaint 8.0。使用这些软件计算灰度值提供了量化测试结果的手段。
这些软件也可以给有色斑点加上彩色数字，可以得到扫描的图像(如，打印输出)，查看这些图像可以得到核酸存在的定性测定结果、核酸的量，或者两者均有。另外还发现，可以通过从代表阳性结果的颜色中减去代表阴性结果的颜色来提高测试的灵敏度。
电脑可以是标准个人电脑，其在商业上容易获得。这样，当在基板上进行测试时，使用连接于装有标准软件的标准电脑的标准扫描仪，提供了方便、容易、价格低廉的检测和定量核酸的手段。扫描(图像)也可以存储在电脑中，保留结果记录，以便进一步参考或使用。当然，如果需要的话，可以使用更加复杂的装置和软件。
可以与任何类型的催化银还原的纳米粒子一起使用银染。贵重金属(如，金和银)制成的纳米粒子是优选的。见Bassell等，J.Cell Biol.，126，863-876(1994)；Braun-Howland等，Biotechniques，13，928-931(1992)。如果用于核酸检测的纳米粒子不催化银的还原，那么可以将银离子与核酸结合来催化还原。见Braun等，Nature，391，775(1998)。还有，已知银染区可以与核酸上的磷酸基团反应。
银染可用于产生或增强基板上进行的任何测试中的可探测的变化，包括上面描述的那些。具体地，已经发现银染极大地提高了使用单一类型纳米粒子的测试的灵敏度，以致于常常可以不使用纳米粒子层、聚合探针层和核心探针层。
在另一个实施方案中，附着于基板的寡核苷酸可以置于两个电极之间，纳米粒子可以由导电材料制成，本发明方法中步骤(d)可以包括检测导电性的变化。在另一个实施方案中，斑点阵列中的许多寡核苷酸附着于基板上，其中的每一个寡核苷酸都可以识别不同目标核酸序列，每个寡核苷酸斑点都位于两个电极之间，纳米粒子由导电材料制成，本发明方法中步骤(d)包括检测导电性的变化。电极可以由例如金制成，纳米粒子也由金制成。可选地，基板可以与银染区接触以产生导电性变化。
在具体的实施方案中，样品中的核酸分子具有高于扩增核酸分子的生物复杂度。本领域技术人员使用如Lewin，GENE EXPRESSION 2，SecondEditionEukaryotic Chromosomes，1980，John Wiley & Sons，New York中所描述的方法能够很容易地测定目标核酸序列的生物复杂度，该文献此处一并作为参考。
杂交动力学绝对依赖于共反应物(reaction partners)即必须杂交的链的浓度。在给定量的提取自细胞样品的DNA中，总基因组、线粒体(如果存在的话)、以及染色体外成分(如果存在的话)的DNA的量仅仅是几微克。因此，要杂交的共反应物的实际浓度将依赖于这些共反应物的大小和所提取的DNA的复杂度。例如，比较不同来源不同复杂度的DNA样品时，每一基因组中存在一个拷贝的30个碱基的目标序列存在不同的浓度。例如，同一目标序列在1微克总人类DNA中的浓度比在1微克细菌DNA中的浓度大约低1000倍，比存在于1微克小质粒DNA样品中的含量低约1,000,000倍。
人类基因组的高复杂度(1×109个核苷酸)要求异常高的特异性，因为基因组DNA中有冗余和类似序列。例如，为了从全部人类基因组中区分出具有25聚寡核苷酸的捕获链，需要具有40,000,000∶1的区分能力的特异性程度。另外，由于在25聚捕获序列中，野生型和突变型靶物仅仅有一个碱基的差异，因而，为了成功进行基因分型(genotyping)，需要区分具有96％同源性的两个靶物。本发明令人惊讶地、出人意料地提供了有效、特异、灵敏地检测与扩增的核酸分子相比，具有更高复杂度的目标核酸分子的方法。
源于人类组织的样品中目标核酸分子的生物复杂度状况为1,000,000,000，但可能高于或低于植物或动物基因组10倍。优选地，生物复杂度为大约50,000至5,000,000,000。最优选地，生物复杂度为大约1,000,000,000。
在一个实施方案中，杂交条件对于捕获寡核苷酸和/或探测寡核苷酸与目标核酸序列的特异性、选择性杂交是有效的，在这样的杂交条件下，可以检测到单一碱基的错配，即使在所述目标核酸是具有50,000或50,000以上生物复杂度的核酸样品的一部分的情况下，例如下面实施例中所显示的。
本发明的方法可以进一步用于鉴定具体的生物学微生物物种(如葡萄球菌)和/或用于检测赋予抗生素抗性的基因(例如，赋予抗生素甲氧西林抗性的mec A基因)。
甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)已经成为世界范围内第一位的医院病原体。美国大型教学医院中，所有医院来源的葡萄球菌感染中超过40％与这些细菌有关。最近它们已经在较小型的医院中流行(在具有200至500个床位的医院中发生率为20％)，还有育婴家庭(Wenzel等，1992，Am.J.Med.91(Supp 3B)221-7)。MRSA菌株不寻常的也是最不幸的特性是它们获得额外的抗性因子的能力，所述抗性因子可抑制这些菌株对其他用于化疗的抗生素的易感性。现在，这样的多抗性菌株在世界范围内流行，这种病原体的最“先进”形式携带有对大多数可用抗菌剂的抗性机制(Blumberg等，1991，J.Inf.Disease，Vol.63，pp.1279-85)。
甲氧西林抗性的主要遗传成分是所谓的mec A基因。这个基因在一段未知的，非葡萄球菌起源的DNA片段上发现，很可能是由祖先MRSA细胞从外源获得。mec A基因编码名为PBP2A的青霉素(penicillin)结合蛋白(PBP)(Murakami和Tomasz，1989，J.Bacteriol.Vol.171，pp.874-79)，该蛋白对整个beta内酰胺家族抗生素具有非常低的亲和性。目前来看，PBP2A是一类“替代性”细胞壁合成酶，可以在正常PBP(细胞壁合成的正常催化剂)补充物由于环境中的beta内酰胺抗生素而完全失活无法再行使功能时，接管葡萄球菌中至关重要的细胞壁合成任务。早期的转座子失活实验证实了mecA基因的重要属性和其抗生素抗性表型基因产物PBP2A，这个实验中，转座子Tn551转入mec A基因。实验的结果是，抗性水平从亲本细菌中的最小抑制浓度(MIC)值1600μg/ml显著下降至转座子突变体中约4μg/ml的低值(Matthews和Tomasz，1990，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，Vol.34，pp.1777-9)。
随着抗生素抗性株系的增加，以及由凝固酶阴性葡萄球菌种引起的感染数的增加，医院中的葡萄球菌感染变得更加难以治疗。由于许多用于确定物种(物种形成分析)和抗生素抗性的测试需要很长的时间，这些感染的有效治疗方法减少了。有了物种和抗生素抗性状况的快速鉴定，对病人的治疗进程就可以更早实施，并且更少地使用广谱抗生素。因此，很显然需要快速地、高度灵敏地、选择性地鉴定和区分葡萄球菌物种的方法和/或检测mec A基因的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供用于葡萄球菌物种形成分析和/或甲氧西林抗性基因(mec A)检测的寡核苷酸序列和其反义互补序列，以及使用这些序列的纳米粒子标记探针、方法、以及试剂盒。这些设计的序列对葡萄球菌种或mec A基因具有高度的灵敏度和选择性，其中mec A基因产生某些形式的抗生素抗性。这些序列可用于mec A基因检测或者葡萄球菌物种形成分析的预定目的，也可用作其他系统的阴性对照。目前，可以如下述实施例中所示，将Tuf3和Tuf4、或者Tuf5和Tuf6中任一探针组与探针Tuf 2一起，用来将金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌区分开。序列标记的16S用于检测葡萄球菌属中包含的16S rRNA或者DNA的存在。如标准亚磷酰胺化学法等传统方法可用于制备这些序列作为捕获探针和/或纳米粒子标记探针。
在本发明的另一个实施方案中，这些序列可用于使用非扩增基因组DNA的葡萄球菌物种形成分析和/或mec A检测方法中。本发明的mec A基因序列已用于在当前的测试条件和方式下，检测双链PCR产物浓度低至1×10-13M(100fM，3×106个拷贝)，超声降解总基因组DNA含量少至33ng(1×107个拷贝)的50μl反应体系中的mec A基因(见图21)。测试中使用PCR扩增基因产物或者总细菌基因组DNA也检测了用于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌物种形成分析的Tuf基因序列的灵敏度和特异性。目前确定的更低的检测界限为50μl反应体系中，双链PCR产物1×10-12M(1pM，或者3×107个拷贝)，超声降解基因组DNA 150ng(5×107个拷贝)(见图20)。实施这些测试的条件在下面描述。本发明的方法使用未经前期复杂度简化或者目标扩增的细菌基因组DNA，通过区分具有一个或一个以上碱基差异的DNA序列，令人惊讶地提供了有效、灵敏、特异地检测不同葡萄球菌物种的方法。
在本发明的另外一个实施方案中，当使用PCR扩增子时，可以使用第二个纳米粒子探针代替如PCT/US01/46418(Nanosphere，Inc.，Assignee)中所述的附着于阵列基板的捕获序列，其整体一并作为参考。当目标DNA与两个纳米粒子探针杂交导致颜色变化时，该系统可以通过光学方法检测(例如颜色或光散射)。这种类型的测试可用于上述测试中所述的葡萄球菌物种鉴定或mec A基因检测目的。
实施例将通过下面的说明性实施例进一步阐述本发明。以举例的方式提供这些实施例并非要以任何方式限制本发明。在这些实施例中，所有的百分比如果是固体则为重量百分比，如果是液体则为体积百分比，如果没有说明，所有的温度均为摄氏度。
实施例1使用纳米粒子探针在非扩增基因组DNA中鉴定SNP的一步杂交法和两步杂交法用提交于1997年7月21日的PCT/US97/12783、提交于2000年6月26日的PCT/US00/17507、提交于2001年1月12日的PCT/US01/01190中描述的方法制备用于检测目标因子II、MTHFR和因子V序列的金纳米粒子寡核苷酸探针，这些文献整体一并作为参考。图3从概念上阐述了使用具有野生型或突变型捕获探针寡核苷酸的DNA微阵列，将结合有寡核苷酸的金纳米粒子探针用于检测目标DNA的用途。结合于纳米粒子的寡核苷酸序列与目标序列的一部分互补，而结合于玻璃芯片的捕获寡核苷酸序列与目标序列的另一部分互补。在杂交条件下，纳米粒子探针、捕获探针和目标序列结合在一起形成复合体。可以用传统银染增强所得复合体的检测信号。
(a)金纳米粒子的制备如Frens，1973，Nature Phys.Sci.，24120和Grabar，1995，Anal.Chem.67735所述，金胶体(直径13nm)通过使用柠檬酸盐还原HAuCl4来制备。简单地说，所有的玻璃器具都在王水(3份HCl，1份HNO3)中洗净，用Nanopure H2O冲洗，然后使用前用烘箱干燥。HAuCl4和柠檬酸钠购自Aldrich化学药品公司(Aldrich Chemical Company)。水合HAuCl4(1mM，500mL)用于搅动回流。然后，快速加入38.8mM柠檬酸钠(50mL)。溶液颜色从浅黄色变为紫红色(burgundy)，回流持续15分钟。冷却至室温后，使用MicronSeparations Inc.的1微米过滤器过滤红色溶液。使用Hewlett Packard 8452A型二极管阵列分光光度计以紫外-可见(UV-vis)光谱学方法，同时使用Hitachi8100型透射电子显微镜以透射电子显微术(TEM)确定金胶体的特征。当与具有10-35核苷酸范围的靶物和探针寡核苷酸序列聚集时，直径15nm的金粒子会产生可见的颜色变化。
(b)寡核苷酸合成用ABI 8909DNA合成仪，在单柱模式下，采用亚磷酰胺化学法[Eckstein，F.(ed.)Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)]，合成1微摩尔量的与MTHFR、因子II或因子V DNA序列片段互补的捕获探针寡核苷酸。捕获序列包含任何3′-氨基修饰剂，此3′-氨基修饰剂在阵列处理过程中作为共价粘附的活性基团。通过下述的标准DNA合成方案合成寡核苷酸。具有3′-氨基修饰剂附着于固体支撑物上的柱子、标准核苷酸亚磷酰胺和试剂从Glen Research获得。为了帮助纯化，没有将最后的二甲氧三苯甲基(DMT)保护基团从寡核苷酸上切除。合成后，使用氨水将DNA从固体支撑物上裂解下来，结果产生在3’端包含游离胺的DNA分子。以0.03M Et3NH+OAc-缓冲液(TEAA)，pH7，1％/min梯度的95％CH3CN/5％TEAA，用装有反相柱(多孔层实心球粒(Vydac))的Agilent 1100系列装置进行反相HPLC层析。流速1mL/min，260nm进行UV检测。缓冲液收集蒸发后，室温下用80％乙酸处理30min，将DMT从寡核苷酸上裂解掉。然后将溶液蒸发至接近干燥，加入水，使用乙酸乙酯将裂解的DMT从寡核苷酸水溶液中萃取掉。在260nm吸光度处测定寡核苷酸的量，通过分析反相HPLC来评估最终的纯度。
测试MTHFR基因中使用的捕获序列如下MTHFR野生型，5′GATGAAATCGGCTCCCGCAGAC-NH23′(MTHFR-SNP/Cap6-WT22；SEQID NO1)，和MTHFR突变体，5′ATGAAATCGACTCCCGCAGACA-NH23′(MTHFR-SNP/Cap7-mut22；SEQ ID NO2)。与因子V基因相对应的捕获寡核苷酸如下因子V野生型，5′TGG ACA GGC GAG GAA TAC AGGTAT-NH23′(FV-Cap-WT24；SEQ ID NO3)，和因子V突变体，5′CTG GACAGG CAA GGA ATA CAG GTA TT-NH23′(FV-Cap-mut26；SEQ ID NO4)。因子II野生型5′CTCAGCGAGCCTCAATGCTCCC-NH23′(FII-SNP/Cap1-WT22；SEQ ID NO5)，和因子II突变体，5′CTCTCAGCAAGCCTCAATGCTCC-NH23′(FII-SNP/Cap1-mut23；SEQ IDNO6)。
设计用于检测因子II、MTHFR和因子V基因的探测探针寡核苷酸包含类固醇二硫键，5′端接有识别序列。探针的序列如下F II探针，5′Epi-TCCTGG AAC CAA TCC CGT GAA AGA ATT ATT TTT GTG TTT CTA AAA CT3′(FII-Pro I-47；SEQ ID NO7)，MTHFR探针，5′Epi-AAA GAT CCC GGGGAC GAT GGG GCA AGT GAT GCC CAT GTC GGT GCA TGC CTT CACAAA G 3′(MTHFR-Pro II-58；SEQ ID NO8)，因子V探针，5′Epi-CCA CAGAAA ATG ATG CCC AGT GCT TAA CAA GAC CAT ACT ACA GTG A 3′(FV-Pro 46；SEQ ID NO9)。
依据经过如下修改的所述捕获探针合成方法来合成探针寡核苷酸。首先，使用带有代表3′端识别序列的适当核苷酸的支撑物代替氨基修饰剂柱子。第二，使用包含类固醇二硫化物(steroid disulfide)的修饰的亚磷酰胺(phosphoramidite)将5′端类固醇环状二硫化物(steroid-cyclic disulfide)导入连接步骤(参见Letsinger等，2000，Bioconjugate Chem.11289-291和PCT/US01/01190(Nanosphere，Inc.)，这些内容整体一并作为参考)。可以通过以下方法制备亚磷酰胺在脱水条件下，将表雄甾酮(epiandrosterone)(0.5g)、1，2-二噻烷-4，5-二醇(0.28g)、和甲苯(30mL)中的对甲基苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)(15mg)溶液回流7小时(Dean Starkapparatus)；然后在减压条件下去除甲苯，残液置于乙酸乙酯中。此溶液用水洗涤，硫酸钠干燥，浓缩成糖浆状残液，将其在戊烷/醚中静置过夜，得到白色固体状、Rf值(TLC，硅片，醚作为抽提液)为0.5的类固醇二硫代缩酮(steroid-dithioketal)化合物(400mg)；相对照，同样条件下获得的表雄甾酮和1，2-二噻烷-4，5-二醇的Rf值分别为0.4和0.3。从戊烷/醚中重结晶得到白色粉末状、mp 110-112℃，1H NMR，δ3.6(1H，C3OH)，3.54-3.39(2H，m 2OCH的二噻烷环)，3.2-3.0(4H，m 2CH2S)，2.1-0.7(29H，m steroid H)；C23H36O3S2(M+H)的质谱(ES+)计算值为425.2179，实测值为425.2151.Anal.(C23H37O3S2)S计算值15.12；实测值15.26。为了制备类固醇二硫化物缩酮亚磷酰胺衍生物(steroid-disulfide ketal phosphoramidite derivative)，将类固醇二硫代缩酮(100mg)溶于THF(3mL)，在干冰酒精浴中冷却，连续加入N，N-二异丙基乙胺(80μL)和β-氰乙基氯二异丙基亚磷酰胺(β-cyanoethylchlorodiisopropylphosphoramidite)(80μL)；然后，混合液加热至室温，搅动2小时，与乙酸乙酯(100mL)混合，用5％水合NaHCO3和水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩至干燥。残留物置于最小量的二氯甲烷中，-70℃加入己烷使之沉淀，真空干燥；产物100mg；31P NMR 146.02。DNA合成完成后，在氨水条件下，将连接表雄甾酮二硫化物(epiandrosterone-disulfide)的寡核苷酸从支撑物上脱保护，依照上述方法使用反相柱在HPLC上纯化。
(c)寡核苷酸附着于金纳米粒子上4μM寡核苷酸溶液和～14nM的15nm柠檬酸盐稳定化的金纳米粒子胶体溶液在终体积为2mL的溶液中先保温24小时以制备探针。室温下，溶液中的盐浓度在40小时内逐步升高至0.8M。所得溶液通过0.2μm醋酸纤维素滤膜，13,000G旋转20分钟粒化纳米粒子探针。去除悬浮物后，将粒化物重悬于水中。在最后步骤，将探针溶液再次粒化，并重悬于探针存储缓冲液(10mM phos，100mM NaCl，0.01％w/v NaN3)。在基于520nm(ε＝2.4×108M-1cm-1)吸光值估算浓度后，将浓度调整至10nM。
下述特异用于因子II、MTHFR和因子V DNA的纳米粒子-寡核苷酸共轭物以此方式制备因子II探针金-S′-5′-[TCC TGG AAC CAA TCC CGT GAA AGA ATTATT TTT GTG TTT CTA AAA CT-3′]n(FII-ProI-47；SEQ ID NO10)MTHFR探针金-S′-5′-[AAA GAT CCC GGG GAC GAT GGG GCA AGTGAT GCC CAT GTC GGT GCA TGC CTT CAC AAA G-3′]n(MTHFR-II58；SEQ ID NO11)因子V探针金-S′-5′-[CCA CAG AAA ATG ATG CCC AGT GCT TAACAA GAC CAT ACT ACA GTG A-3′]n(FV-46；SEQ ID NO12)S′指通过表雄甾酮二硫化物基团制备的连接单元；n代表识别寡核苷酸的数目。
(d)DNA微阵列的制备使用GMS417阵列排布机(Affymetrix)将捕获链排列于Superaldehyde载片(Telechem)或者CodeLinke载片(Amersham，Inc.)上。将排列斑点的布置设计为允许在每一个载片上进行多个杂交，这样的设计可通过用硅树脂垫片(Grace Biolabs)将载片分割为单独的测试孔的方法获得。野生型和突变型在厂商提供的成斑缓冲液中三倍成斑。依据厂商推荐的方案进行载片的排列后处理。
(e)杂交因子V SNP检测测试方法采用下述的方案进行因子V SNP检测。基因型为纯合野生型的超声降解的人胎盘DNA，或者鲑精DNA(Sigma)用乙醇沉淀，溶解于10nM FV探针溶液。在混合物中加入其他成分，最终的杂交混合物(5μL)包含3xSSC、0.03％Tween20、23％甲酰胺、5nM FV探针、和10μg人DNA、或者参照说明。99℃、4分钟的加热变性步骤之后，将杂交混合物加至检测孔。将阵列于50℃保温90分钟。室温下将阵列浸入0.5M NaNO3、0.05％ Tween 20一分钟，由此开始杂交后的冲洗。去除垫片，再次于0.5M NaNO3/0.05％Tween 20溶液中冲洗检测载片，室温下保温3分钟(2x)，保温时轻微搅动。如上所述，载片用银增强溶液染色，在旋转干燥机上干燥，于Array Worx生物芯片阅读器(Model no.AWE，Applied Precision Inc.，Issaquah，WA，U.S.A.)上成像。
(f)结果因子V SNP检测图4显示在Superaldehyde载片上，人类基因组DNA中因子V基因的SNP辨别。测试阵列包含野生型和突变型捕获斑。顶部显示的阵列与野生型人类基因组DNA杂交，底部的阵列与超声降解的鲑精DNA杂交。野生型斑点的信号明显高于与野生型人类基因组DNA杂交的突变型斑点的信号，显示其为与因子V纯合型野生基因型。在杂交条件下，没有观测到鲑精DNA杂交信号，以其作为测试对照。还用阵列在CodeLink载片上进行了SNP辨别。
所设计的实验显示野生型捕获斑上的杂交并非归因于其他一些序列，而是特异于包含人类因子V基因的基因组。使用人类野生型总DNA，在野生型捕获斑观测到了所期望的强杂交信号，而在突变斑观测到了大约弱了3倍的信号。然而，当抽提自鲑精的基因组DNA作为靶物时，没有观测到信号，因为此DNA不包含人类因子V基因。
图5显示了为使此方法能够区分两个具有1个核苷酸(SNP位点)差异的目标核酸(本例来自具有因子V基因突变的纯合型患者)中而调整杂交条件的重要性。必须确定甲酰胺与SSC缓冲盐浓度的适当平衡以使目标序列优先结合其同源捕获探针(例如Mut-A或Mut-B序列)。另外，图5显示了杂交中不同大小的捕获寡核苷酸序列的影响。Mut-A序列长26个核苷酸，Mut-B序列长21个核苷酸。结果显示在15％FM/1XSSC条件下特异性信号具有显著差异，而在25％FM/6XSSC条件下没有差异，两个探针都产生了具有很好辨别能力的强信号。
为了确定在同样条件下，是否能够检测样品中一个以上的SNP类型，检测了基因组DNA中野生型和突变型因子II和因子V基因的存在。正常人类(wt)基因组DNA、附着于基板上的捕获寡核苷酸和纳米粒子探针一起，40℃混合于35％FM和4X SSC中1小时。在因子II和因子V基因的野生型捕获斑中优先产生信号(图6)。当使用因子II为纯合突变型而因子V为纯合野生型的个体的总基因组DNA时，同样杂交条件下的同样阵列，在因子II突变型捕获斑和因子V野生型捕获斑优先产生信号，清楚无误地鉴定了此人在这两个基因的SNP构型上的遗传组成(图6)。这个结果显示，可以设计捕获寡核苷酸序列和杂交条件，使在同样的杂交条件下，能够在同一阵列中检测一个以上的SNP类型。并且，野生型和突变型DNA的SNP辨别也是可能的，并不依赖于输入DNA是正常来源还是突变来源。
两步杂交法为了确定不同的严格条件对SNP辨别的影响，做了更多的试验。在测试中使用不同百分比的甲酰胺，使检测阵列在不同的严格条件下杂交(图7)。伴随着严格程度的增加，出现信号丢失，而这转而使信号的特异性得到提升。在没有靶物的对照中几乎观测不到信号。测定斑点中信号的定量显示，野生型斑点的信号比突变型斑点的信号高3-6倍(图7B)。这些结果同时为基因组DNA中SNP的辨别不需要任何的目标扩增策略(的观点)提供支持。
将不同长度包括20、21、24、或者26个核苷酸(FV-WT20(SEQ ID NO13)5′(GGACAGGCGAGGAATACAGG)-(PEG)x3-NH2，3′FV-mut21(SEQID NO14)5′(TGGACAGGCAAGGAATACAGG)-(PEG)x3-NH23′，FV-wt24(SEQ ID NO15)5′TGG ACA GGC GAG GAA TAC AGG TAT-NH23′，FV-mut26(SEQ ID NO16)5′CTG GAC AGG CAA GGA ATA CAG GTATT-NH23′)的捕获寡核苷酸按上述方法印于CodeLink载片上，加至5μg正常人胎盘基因组DNA(Sigma，St.Louis，MO)或者因子V突变人基因组DNA(分离自贮藏库培养物GM14899，因子V缺陷，Coriell Institute)。在第一步，将载片和DNA置于20％FM、30％FM或40％FM，和4X SSC/0/04％Tween中40℃保温2小时。然后，室温下将载片在2XSSC中冲洗3分钟。冲洗后，将识别因子V的探测寡核苷酸与纳米粒子探针一起加入，然后将混合物40℃保温1小时。按照上述方法银染检测信号。结果显示，在经最佳调整的条件下(本例中为30％FM)，人野生型DNA只在野生型探针上产生信号，而人突变型DNA只在突变捕获探针产生信号(图8)。改变条件的严格程度导致辨别能力的丧失(严格程度过低)或者信号的丧失(严格程度过高)。图9显示图8中优选(中间的)杂交条件的定量数据。
然后使用不同浓度的DNA在最佳条件下重复试验。如图10中所看到的，DNA浓度为0.5μg、1.0μg和2.5μg时SNP辨别是成功的。因此，此方法能够用很少量(少于1微克)的人总DNA检测SNP。这些结果也显示了捕获寡核苷酸设计，以及严格条件与捕获(和探测)探针的长度和核苷成分适当匹配的重要性。
通过在一个载片的不同孔中用5μg野生型完整基因组DNA进行10个相同的杂交，测定了两步杂交法的可重复性。如图11所示，10个单独杂交中匹配和错配的净信号强度的标准偏差不重叠，显示对于每一个杂交反应，都可以可靠地确定输入DNA的SNP构型。
接下来，用该方法检测因子V、因子II和MTHFR的SNP和制备相同样品中的野生型基因。在上述的杂交条件下，将因子V、因子II或者MTHFR的捕获寡核苷酸与5μg的完整基因组DNA一起保温。第二步中加入专门用于检测因子V、因子II或者MTHFR的纳米粒子探针。此试验的结果如图12-14所示，其显示相同条件下，在单一阵列中可以同时分析至少3个不同基因的SNP构型。图13显示了患者DNA样品(GM16028)中此多元SNP检测的结果，该结果是，对于每一个基因来讲都是杂合的。图14显示了患者多元SNP检测的结果，此患者因子II是杂合的，因子V为野生型，MTHFR为突变的。此方法精确地鉴定了此患者的基因型(患者样品GM00037)。这些结果显示辨别能力是足够强的，能够辨别纯合与杂合突变基因。例如，对于任何给定的SNP来说，一个人可以是纯合的野生型、突变型或者是杂合型(即一个野生型基因和一个突变型基因)。三个单独的SNP位点的这三种不同情形可以在单独的一次测试中正确地分别鉴定。结果显示本发明的方法能够同时鉴定单一样品中的多个SNP。然而本试验中只鉴定了三个SNP，本领域技术人员能够认识到这仅仅是一个代表性数目。在同一阵列中是能够检测更多的SNP位点的。
除了这些试验，两个不同的实验者还使用这些实施例中所述的方法，分别将8个不同的载片与来自2个不同病人的DNA杂交(病人GM14899的DNA为每个载片1个阵列，病人GM1600的DNA为每个载片2个阵列)。对于2个基因中的每一个(因子II和因子V)和每个类型的捕获探针(突变型或者野生型)，每个阵列有4个重复斑点。将净信号强度平均、分类，然后从最低信号强度开始绘图。对于错配信号(每张图中的较低值)，将标准偏差加至平均净信号三次。突变型和相应野生型的信号总是位于彼此的上面。如图15所示，即使是最小的信号强度，匹配的净信号也总是比错配的净信号加上三倍的标准偏差大。因此，在每一个例子中，都能够以大于99％的可靠性来测定SNP的正确构型。这些结果进一步显示了此处所述方法的强大及其可重复性。
实施例2本发明方法的杂交条件现有技术中描述的用于有效杂交反应的标准推荐方案(T.Maniatis，E.F.Fritsch，and J.Sambrook in“Molecular Cloning，A Laboratory Manual”，ColdSpring Harbor Laboratory，1982，p324)主要是规定杂交温度低于Tm～10-20摄氏度，此Tm根据所选择的杂交条件，包括盐和甲酰胺浓度，计算得到。计算Tm值有不同的方法，每种方法都以准确的寡核苷酸序列和缓冲液条件为基础。例如，可以利用计算机程序进行这种计算，这些程序可以从商业途径或在线获得，例如所开发的并保存在Wayne州立大学网站上的HYTHERTM服务器。发明人将HYTHERTM服务器上的所有可用的程序用于进行这些计算，得到了捕获探针和探测探针(即寡核苷酸)的Tm值。如表1所示，捕获探针的Tm值低于或者非常接近于选择用于杂交的温度(即40℃)。因此，在这些条件下，可以预期杂交效率是很低的。另外，捕获寡核苷酸直接附着于基板表面，即，没有连接序列，这意味着最靠近表面的寡核苷酸可能无法参与与目标序列的杂交，因此进一步降低有效Tm值。基于现有技术的教导，本发明方法中所使用的条件出人意料地获得了高效的杂交，尤其是在目标序列只是人类基因组所代表的复杂DNA混合物的一个很微小的片段(例如1/100,000,000或者1million′s％)的情况下。
表1

实施例3纳米粒子-寡核苷酸共轭探针的制备本实施例中，制备了用于mec A和Tuf基因靶物PCR扩增的代表性纳米粒子-寡核苷酸共轭探测探针。使用申请于1997年7月21日的PCT/US97/12783、申请于2000年6月26日的PCT/US00/17507、申请于2001年1月12日的PCT/US01/01190中所描述的方法制备用于检测目标mec A或Tuf基因序列的金纳米粒子-寡核苷酸探针，这些文献整体一并作为参考。
(a)金纳米粒子的制备如Frens，1973，Nature Phys.Sci.，24120和Grabar，1995，Anal.Chem.67735所述，金胶体(直径13nm)通过使用柠檬酸盐还原HAuCl4来制备。简单地说，所有的玻璃器具都在王水(3份HCl，1份HNO3)中洗净，用Nanopure H2O冲洗，然后在使用前烘箱干燥。HAuCl4和柠檬酸钠购自Aldrich化学药品公司(Aldrich Chemical Company)。水合HAuCl4(1mM，500mL)用于搅动回流。然后，快速加入38.8mM柠檬酸钠(50mL)。溶液颜色从浅黄色变为紫红色(burgundy)，回流持续15分钟。冷却至室温后，使用MicronSeparations Inc.的1微米过滤器过滤红色溶液。使用Hewlett Packard 8452A型二极管阵列分光光度计以紫外-可见(UV-vis)光谱学方法，同时使用Hitachi8100型透射电子显微镜以透射电子显微术(TEM)确定金胶体的特征。当与具有10-35核苷酸范围的靶物和探针寡核苷酸序列聚集时，直径13nm的金粒子会产生可见的颜色变化。
(b)类固醇二硫化物的合成用Milligene Expedite DNA合成仪，在单柱模式下，采用亚磷酰胺化学法[Eckstein，F.(ed.)Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)]的，合成1微摩尔量的与mecA和Tuf DNA序列互补的寡核苷酸。所有的溶液均购自Milligene(DNA合成级(DNA synthesisgrade))。平均连接效率从98至99.8％不等，为帮助纯化，没有将最后的二甲氧三苯甲基(DMT)保护基团从寡核苷酸上裂解掉。
为便于探针序列与靶物的杂交，探针序列的5’端包括作为间隔区的脱氧腺苷寡核苷酸(除了Tuf2探针具有da10peg，其他所有探针均为da15peg)。
为了产生5’端类固醇环状二硫化物寡核苷酸衍生物(见Letsinger等，2000，Bioconjugate Chem.11289-291和PCT/US01/01190(Nanosphere，inc.)其公开的内容整体一并作为参考)，用环状二噻烷连接的表雄甾酮亚磷酰胺在Applied Biosystems的自动合成仪上进行最后的连接反应，环状二噻烷连接的表雄甾酮亚磷酰胺由1，2-二噻烷-4，5-二醇、表雄甾酮和甲苯中的对甲苯磺酸(PTSA)制得。亚磷酰胺试剂可按如下方法制备表雄甾酮(0.5g)、1，2-二噻烷-4，5-二醇(0.28g)和甲苯(30mL)中的对甲苯磺酸(15mg)的溶液在脱水条件下回流7小时(Dean Stark apparatus)。然后在减压条件下去除甲苯，将残液置于乙酸乙酯。将此溶液用水洗涤，硫酸钠干燥，浓缩为糖浆状残液，在戊烷/醚中静置过夜，得到白色固体状类固醇二硫代缩酮化合物(400mg)；Rf值(TLC，硅片，醚作为抽提液)为0.5；相对照，同样条件下获得的表雄甾酮和1，2-二噻烷-4，5-二醇的Rf值分别为0.4和0.3。从戊烷/醚中重结晶得到白色粉末状、mp 110-112℃，1H NMR，δ3.6(1H，C3OH)，3.54-3.39(2H，m2OCH的二噻烷环)，3.2-3.0(4H，m 2CH2S)，2.1-0.7(29H，m类固醇H)；C23H36O3S2(M+H)的质谱(ES+)计算值为425.2179，实测值为425.2151.Anal.(C23H37O3S2)S计算值15.12；实测值15.26。为了制备类固醇二硫化物酮亚磷酰胺衍生物，将类固醇二硫代缩酮(100mg)溶于THF(3mL)，在干冰酒精浴中冷却，连续加入N，N-二异丙基乙胺(80μL)和β-氰乙基氯二异丙基亚磷酰胺(80μL)；然后，混合液加热至室温，搅动2小时，与乙酸乙酯(100mL)混合，用5％水合NaHCO3和水洗涤，用硫酸钠干燥，浓缩至干燥。残留物置于最小量的二氯甲烷中，-70℃加入己烷使之沉淀，真空干燥；产物100mg；31P NMR 146.02。在不去除最后的DMT的情况下，在AppliedBiosystems自动基因合成仪上合成表雄甾酮二硫化物连接的寡核苷酸。完成后，在氨水条件下，将表雄甾酮二硫化物连接的寡核苷酸从支撑物上脱保护，用反相柱在HPLC上纯化。
用0.03M Et3NH+OAc-缓冲液(TEAA)，pH 7，1％/min梯度的95％CH3CN/5％TEAA，在装备有Hewlett Packard ODS hypersil柱(4.6×200mm，颗粒大小为5mm)的Dionex DX500系统上进行反相HPLC。流速为1mL/min，在260nm处进行UV检测。用制备型HPLC纯化DMT保护的未修饰寡核苷酸。缓冲液收集蒸发后，用80％乙酸室温下处理30min将DMT从寡核苷酸上裂解掉。将溶液蒸发至接近干燥，加入水，用乙酸乙酯将裂解的DMT从寡核苷酸水溶液中萃取出来。在260nm吸光度处测定寡核苷酸的量，用反相HPLC评估最终的纯度。
(c)微阵列制备在DNA合成仪上按照下面的标准DNA合成方案合成含有3’-氨基和5’-氨基的DNA。通过在ArrayIt缓冲液添加物(plus)(Catalog no.MSP，CompanynameTelechem，citySunnyvale，StateCA)中印入(printing)1mM DNA溶液，将胺修饰的DNA附着于乙醛微阵列载片上。用具有500个微米打印针的Affymetrix GMS 417阵列排布机将微阵列在载片上定向。具有乙醛功能化表面的微阵列载片购自Telechem(catalog no.SMM，city Sunnyvale，stateCA)。印入后，在周围环境温度下，将载片放入潮湿的小室中12-18小时。移去载片并将其真空干燥30分钟至2小时。然后将载片在0.2％w/v SDS中冲洗两次，在水中冲洗两次以除去任何残留的非结合DNA。然后，将载片置于2.5M硼氢化钠溶于含20％v/v 100％乙醇的1X PBS的溶液中浸泡处理5分钟。然后用0.2％w/v SDS冲洗三次，用水冲洗两次，离心干燥。
(d)寡核苷酸附着于金纳米粒子按照上面A部分所述方法制备的柠檬酸盐稳定化金纳米粒子胶体溶液(约10nM)与按照B部分所述方法制备的硫修饰-a15 peg-探针寡核苷酸(4μM)混合，室温下将其于20ml的闪烁瓶中静置6小时。将pH 7.0的0.1M磷酸氢钠缓冲液和5.0M NaCl都加至溶液中，得到0.01M磷酸氢钠和0.1M NaCl的溶液，将其再静置16小时。以梯度方式加入氯化钠，36小时内使NaCl浓度达到0.8M，所得的溶液再保温18小时。将溶液均分至1ml eppendorf管，在Eppendorf Centrifuge 5414中14,000rpm离心25分钟，得到非常浅的粉红色上清液，其中包含了大部分的寡核苷酸(260nm处吸光度值所显示的)连同7-10％的胶体金(520nm处吸光度值所显示的)，在试管的底部是致密的、黑色凝胶状残留物。移去上清液，在所需水缓冲液中重悬残留物。本实施例中，所使用的缓冲液包括0.1M NaCl、10mM柠檬酸钠和0.01％叠氮钠，pH值为7。
下面的纳米粒子-寡核苷酸探测探针和特异于mecA和Tuf DNA的胺修饰DNA捕获探针以此种方式制备此处，寡核苷酸探针可以用胺修饰并固定于玻璃载片上作为捕获探针，或者用表雄甾酮连接物修饰并固定在金颗粒上作为探测探针。换句话说，寡核苷酸和它的反向互补序列可互换用作捕获探针或纳米粒子探测探针。
(a)探测探针探针Tuf 1金-S′-5′-[a15PEG-ttctatttccgtactactgac-3′]n(SEQ ID NO17)探针Tuf 2金-S′-5′-[a15peg-ttctatttccgtactactgacgtaact-3′]n(SEQ ID NO18)探针Tuf 35′-[胺-peg3-ccattcttctcaaactatcgt-3′](SEQ ID NO19)探针Tuf 45′-[胺-peg3-ccattcttcactaactatcgc-3′](SEQ ID NO20)探针Tuf 55′-[胺-peg3-cacactccattcttctcaaact-3′](SEQ ID NO21)探针Tuf 65′-[胺-peg3-cacactccattcttcactaact-3′](SEQ ID NO22)探针Tuf 75′-[胺-peg3-atatgacttcccaggtgac-3′](SEQ ID NO23)探针Tuf 85′-[胺-peg3-gtagatacttacattcca-3′](SEQ ID NO24)探针Tuf 95′-[胺-peg3-gttgatgattacattcca-3′](SEQ ID NO25)探针Tuf 105′-[胺-peg3-ccattcttcactaactaccgc-3′](SEQ ID NO26)探针Tuf 115′-[胺-peg3-catacgccattcttcactaact-3′](SEQ ID NO27)探针Tuf 155′-[胺-peg3-ccattcttctctaactatcgt-3′](SEQ ID NO28)探针Tuf 165′-[胺-peg3-ccattcttcacaaactatcgt-3′](SEQ ID NO29)探针Tuf 175′-[胺-peg3-ccattcttcagtaactatcgc-3′](SEQ ID NO30)探针Tuf 185′-[胺-peg3-ccattcttcagtaactaccgc-3′](SEQ ID NO31)探针Tuf 195′-[胺-peg3-ccattcttctcaaactaccgc-3′](SEQ ID NO32)探针Tuf 205′-[胺-peg3-ccattcttctctaactaccgt-3′](SEQ ID NO33)探针Tuf 215′-[胺-peg3-catacgccattcttcagtaact-3′](SEQ ID NO34)探针Tuf 225′-[胺-peg3-cacactccattcttcagtaact-3′](SEQ ID NO35)探针Tuf 235′-[胺-peg3-catactccattcttcactaact-3′](SEQ ID NO36)探针Tuf 245′-[胺-peg3-catacaccattcttctcaaact-3′](SEQ ID NO37)探针Tuf 255′-[胺-peg3-catactccattcttctctaact-3′](SEQ ID NO38)探针Tuf 265′-[胺-peg3-cacactccattcttcacaaact-3′](SEQ ID NO39)探针Tuf 275′-[胺-peg3-cacactccattcttctctaact-3′](SEQ ID NO40)探针mecA 15′-[胺-peg3-tcgatggtaaaggttggc-3′](SEQ ID NO41)探针mecA 25′-[胺-peg3-atggcatgagtaacgaagaatata-3′](SEQ ID NO42)探针mecA 3金-S′-5′-[胺-peg3-aaagaacototgotcaacaag-3′]n(SEQ ID NO43)探针mecA 4金-S′-5′-[胺-peg3-gcacttgtaagcacaccttcat-3′]n(SEQID NO44)
探针mecA 65′-[胺-peg3-ttccagattacaacttcacca-3′](SEQ ID NO45)探针16S 125′-[胺-peg3-gttcctccatatctctgcg-3′](SEQ ID NO46)探针16S 13金-S′-5’-[胺-peg3-atttcacogotacacatg-3′]n(SEQ ID NO47)s′表示经由表雄甾酮二硫化物基团制备的连接单元；n代表纳米粒子-寡核苷酸共轭物制备中使用的不同数目的寡核苷酸。
表2


实施例4用金纳米粒子探针检测来自细菌基因组DNA的mec A基因序列本实施例中，描述了在阵列布局中，使用以金纳米粒子检测为基础的检测mec A基因序列的方法。具有作为捕获探针的mecA 2和mecA 6寡核苷酸的微阵列板与mecA 4寡核苷酸探测探针标记的金纳米粒子一起使用。微阵列板、捕获探针和探测探针按照实施例3所述的方法制备。
如实施例3所述方法制备的附着有寡核苷酸探针的金纳米粒子(直径13nm)用于显示与三成分三明治测试形式的透明基板杂交的mec A DNA的存在。然后，附着有探针寡核苷酸的纳米粒子和分离自甲氧西林抗性(MecA+)或甲氧西林敏感性(MecA-)金黄色葡萄球菌细菌细胞的基因组DNA靶物共杂交于这些基板上。因此，纳米粒子在表面上的存在显示检测到了mec A基因序列，见图16。在所测试的靶物量(250ng(7.5E7个拷贝)-1μg(3.0E8))，用裸眼不能观察到附着的纳米粒子。为了便于对杂交于基板表面的纳米粒子进行观察，采用了信号放大方法，在该方法中用对苯二酚催化还原银离子，在载片表面上形成银金属。尽管在组织化学显微术研究中这个方法已被用于放大蛋白质和抗体共轭的金纳米粒子(Hacker，in Colloidal GoldPrinciples，Methods，and Applications，M.A.Hayat，Ed.(Academic Press，SanDiego，1989))，vol.1，chap.10；Zehbe等，Am.J.Pathol.150，1553(1997))，但是其在定量DNA杂交测试中的用途是新的(Tomlinson等，Anal.Biochem.，171217(1988))。此方法不仅使表面覆盖率非常低的纳米粒子探针能够通过平板扫描仪或用裸眼观测到，也允许定量染色区上基于银染放大的金探针散射光的靶物杂交。很明显，在所测试每一个基因组DNA的量上，从含有甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌基因组DNA的样品得到的信号强度比从含有甲氧西林敏感性金黄色葡萄球菌基因组DNA得到信号强度高得多。这表明，此检测方法学可在复杂细菌基因组DNA背景的存在下，用于mec A基因的特异性检测，见图16。这个结果是纳米粒子寡核苷酸共轭物的不寻常特点，它使核酸的超灵敏和选择性检测成为可能。也应当注意到，该方法不需要酶学靶物或者信号放大方法，它提供了从细菌基因组DNA样品中检测基因的新方法。
(a)目标DNA制备分离自葡萄球菌细菌细胞的纯化的总基因组DNA购自ATCC(AmericanType Culture Collection)。如实施例5(见下面)中所述，在阵列杂交之前，总基因组DNA通过超声降解片段化以剪切DNA分子。
(b)MecA基因检测测试(ii)测试方法含量范围为250ng-1μg的细菌基因组DNA和lnM纳米粒子探针的反应混合物在1×杂交缓冲液(5×SSC，0.05％Tween 20)中制备。将反应混合物加热至95℃5分钟。随后，将10-25μL的反应混合物加至微阵列表面，40℃及90％的相对湿度条件下杂交2小时。微阵列表面在室温下，以5×SSC、0.05％Tween 20洗涤30秒。干燥微阵列，并用商业级银增强剂溶液(silverenhancer solution)(银增强剂试剂盒(Silver Enhancer Kit)，Catalog No.SE-100，Sigma，St.Louis)进行银接触显色4分钟。然后，将银染的微阵列盘洗涤、干燥并用Arrayworx扫描仪(Model No.AWE，Applied Precision，Inc.，Issaquah，WA)成像。
实施例5用细菌基因组DNA和金纳米粒子标记的Tuf探针进行葡萄球菌物种形成分析本实施例中，通过辨别与金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌菌种相应的Tuf基因序列进行葡萄球菌物种形成分析。从分离自金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌细菌细胞的总基因组DNA扩增的Tuf 372bp PCR扩增子作为阳性对照来显示阵列的序列特异性。在单独的杂交反应中，将分离自金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌细菌细胞的总基因组DNA片段化，并将其与微阵列板杂交。微阵列板包括结合在其上的Tuf 3、Tuf 4或者Tuf 5和Tuf 6捕获探针。Tuf 2寡核苷酸标记的金纳米粒子用作探测探针。按照实施例3描述的方法制备微阵列板、捕获和探测探针。用传统PCR扩增方法制备Tuf 372bp扩增子。
(a)目标DNA制备按照如下方法制备基因组DNA分离自培养的葡萄球菌细菌细胞的基因组DNA购自ATCC(American Type Culture Collection)。将＞10μg部分的干燥DNA于体积为200μl的无DNA酶的水中再次水合。然后使用Misonix，超声细胞破碎仪(Ultrasonic cell disruptor)XL Farmingdale，NY，以12次，每次约0.5秒的2瓦功率的脉冲，将其超声降解。使用商业上可获得的来自Molecular Probes的Picogreen试剂盒测定总DNA浓度，并在Tecanspectrafluor plus荧光板读数器上读数。在Agilent 2100生物分析仪(Bioanalyzer)上进行扫描分析(smear analysis)，由此测得的DNA片段的大小为平均1.5Kb。用传统PCR扩增技术，从金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌基因组DNA中制备了阳性对照tuf基因372碱基对PCR扩增子。
(b)Tuf基因检测测试方法在单独的杂交孔中，将分离自表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌细菌细胞(8.0E07个拷贝，～250ng)的片段化总基因组DNA和1nM纳米粒子探针混合于1x杂交缓冲液(5X SSC，0.05％Tween 20)中。同一基因组DNA样品的PCR扩增Tuf基因片段作为阳性对照，与探针和缓冲液混合于玻璃载片上的单独杂交孔中。将反应混合物加热至95℃5分钟。随后，将50μl反应混合物加至微阵列表面，45℃及90％相对湿度条件下杂交1.5小时。微阵列表面室温下在0.5M NaNO3中冲洗30秒。干燥微阵列，并用商业级银增强剂溶液(Silver Enhancer Kit，Catalog No.SE-100，Sigma，St.，Louis，MO)进行银接触显色4分钟。然后冲洗银染的微阵列板，干燥，用Arrayworx扫描仪(Model No.AWE，Applied Precision，Issaquah，WA)将阵列上的银染放大纳米粒子探针的散射光成像并量化。
Tuf3和Tuf4捕获探针的结果如图17(a)和(b)所示，Tuf5和Tuf6捕获探针的结果如图17(c)和(d)所示。使用Tuf3和Tuf4捕获探针组，当基因组DNA与阵列杂交时，观测到了阵列上对应于葡萄球菌种金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的特异性信号。这有力地证明了，在总基因组DNA存在下，区分这些紧密相关的序列不需要通过PCR进行tuf基因靶物的复杂度简化和扩增。使用Tuf3和Tuf4捕获探针组，也观测到了对应于适当物种的信号，但是与错配捕获序列有一些交叉反应，由此导致较低的识别率。这表明序列设计对于物种的精确鉴定是至关重要的。
实施例6用PCR扩增子和金纳米粒子标记mec A和Tuf寡核苷酸作为探测探针进行葡萄球菌物种形成分析和甲氧西林抗性测试本实施例中，所设计的用于鉴定葡萄球菌的属、种、以及抗生素抗性状况的阵列由来自16S rRNA基因(属)、Tuf基因(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、和腐生葡萄球菌的种特异性捕获种)和mec A基因(抗生素抗性状况)的序列制成。注意到表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌捕获探针只有一个核苷酸差异，而金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌捕获探针有三个核苷酸的差异。微阵列板包括所有下述序列16S 12、mecA 6、Tuf 3、Tuf 4、Tuf 10捕获探针和结合在其上的一个阴性杂交捕获探针。金纳米粒子标记的Tuf 2、mecA 4、和16S 12探针用作探测探针。微阵列板、捕获探针和探测探针按照实施例4所述方法制备。用PCR扩增的来自各种甲氧西林抗性和甲氧西林敏感性葡萄球菌物种(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌)的基因序列测试阵列的特异性。用于测试的特异性PCR扩增基因片段如图18所示(mecA 281、16S 451、和Tuf 372)。源于图18所示的不同葡萄球菌物种的Tuf基因序列从GenBank获得。
靶物制备
使用标准PCR扩增方法制备PCR扩增的基因产物。
测试每个反应体系包括50μl 5x SSC、0.05％Tween 20、0.01％BSA、200pM的每种纳米粒子探针、和15％甲酰胺以及750pM的每种目标扩增子。试剂在40℃和90％湿度条件下杂交1小时。室温下在0.5M NaNO3中洗涤微阵列表面30秒。干燥微阵列，并用商业级银增强剂溶液(Silver Enhancer Kit，Catalog No.SE-100，Sigma，St.Louis，MO)进行银接触显色4分钟。然后冲洗银染的微阵列板，干燥，用Arrayworx扫描仪(Model No.AWE，AppliedPrecision，Issaquah，WA)成像。
结果如图19(a)和(b)所示。当采用标准PCR扩增方法时，用显示阵列序列特异性的PCR扩增子正确地鉴定了所选择的五个葡萄球菌样品(见如下表3)的物种和甲氧西林抗性状况。
表3

实施例7使用基因组DNA和金纳米粒子标记的mecA、16S和Tuf探针进行葡萄球菌物种形成分析和甲氧西林抗性测试此实施例中，使用分离自金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的细菌细胞的总基因组DNA进行葡萄球菌的属、种和抗生素抗性状况的鉴定。所测试的基因组DNA样品由ATCC表示的特征如上述表3中所述。实施例6中测试用的微阵列板和探测探针也用于本实施例。以实施例3中描述的方法制备微阵列板和捕获及探测探针。按照实施例5的方法制备基因组DNA样品。每个反应体系包括50μl 5x SSC、0.05％Tween 20、0.01％BSA、200pM的每种纳米粒子探针、和15％甲酰胺以及3.3ng/μl的超声降解基因组DNA。试剂在40℃和90％湿度条件下杂交2小时。室温下在0.5M NaNO3中洗涤微阵列表面30秒。干燥微阵列，并用商业级银增强剂溶液(Silver EnhancerKit，Catalog No.SE-100，Sigma，St.，Louis)进行银接触显色4分钟。然后冲洗银染的微阵列板，干燥，用Arrayworxt扫描仪(Model No.AWE，AppliedPrecision，Issaquah，WA)成像。
结果如图20所示。很明显，以每个样品中仅在正确的捕获探针位点处高出背景三倍标准偏差的净信号强度为基础，正确地鉴定了所测试的三个基因组DNA的葡萄球菌菌种和抗生素抗性状况。这个实验显示，当葡萄球菌基因组DNA与阵列杂交，以及被银染放大的金纳米粒子探针标记时，即便是Tuf基因内单个核苷酸的突变也能够被检测到。因此，通过这个无需任何基于酶的目标扩增(如PCR)或信号放大(辣根过氧化物酶)方法的新的检测方法学，可以对给定基因序列中只有少至单个核苷酸差异的生物学微生物进行物种形成分析。
将已知量的分离自甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌细胞的总基因组DNA滴加至测试体系(assay)中，测量来自mecA基因捕获探针的净信号强度，如图21，以此测量测试敏感度。最低可检测量为34ng，对应于约1千万个基因组拷贝。所描述的检测方法的进一步优化应当能够检测到更少量的基因组DNA。
应当理解前述公开的内容着重于本发明的某些具体实施方案，与其等价的所有修改或替换都包括在本发明的精神和范围之内，如附加的权利要求中所列出那样。
权利要求
1.检测样品中目标核酸序列的方法，所述样品包含相对于扩增的核酸分子更高生物复杂度的核酸分子，目标核酸序列与一个或一个以上核酸序列至少有一个核苷酸不同，该方法包括步骤a)提供结合有捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中捕获寡核苷酸具有与目标核酸序列的第一部分的至少一部分互补的序列；b)提供包含探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)的目标核酸序列的第二部分的至少一部分互补的序列；c)在捕获寡核苷酸能够与目标核酸序列的第一部分有效杂交，探测探针能够与目标核酸序列的第二部分有效杂交，以及允许区分目标序列与具有至少一个核苷酸不同的所述的一个或一个以上核酸序列的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与目标核酸序列的第一和第二部分杂交。
2.权利要求1的方法，其中目标核酸序列包含单核苷酸多态性。
3.权利要求1的方法，其中单一核苷酸的不同被结合于基板的捕获寡核苷酸识别。
4.权利要求1的方法，其中单一核苷酸的不同被探测寡核苷酸识别。
5.权利要求1的方法，其中目标核酸分子包含基因组DNA、基因组RNA、表达的RNA、质粒DNA、线粒体或其他细胞器官DNA、游离的细胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述两个或两个以上的混合物。
6.权利要求1的方法，其中基板包含许多捕获寡核苷酸，其中每一个都能够识别不同的单核苷酸多态性。
7.权利要求1的方法，其中样品包含一个以上的核酸靶物，其中每一个核酸靶物都包含一个或一个以上不同的单核苷酸多态性。
8.权利要求1的方法，其中提供了一个或一个以上类型的探测探针，其中每一个探测探针都有与之结合的探测寡核苷酸，能够与不同的核酸靶物杂交。
9.权利要求1的方法，其中将样品与探测探针接触，以使存在于样品中的核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交，然后将结合于探测探针的核酸靶物与基板接触以使核酸靶物与基板上的捕获寡核苷酸杂交。
10.权利要求1的方法，其中将样品与基板接触以使存在于样品中的核酸靶物与捕获寡核苷酸杂交，然后将结合于捕获寡核苷酸的核酸靶物与探测探针接触，以使核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交。
11.权利要求1的方法，其中样品同时与探测探针和基板接触。
12.权利要求1的方法，其中探测寡核苷酸包含可探测标记。
13.权利要求12的方法，其中探测标记允许通过光子学、电子学、声学、光声、重力、电化学、电光(electro-optic)、质谱、酶学、化学、生物化学、或者物理学手段探测。
14.权利要求12的方法，其中标记是荧光的。
15.权利要求12的方法，其中标记是发光的。
16.权利要求12的方法，其中标记是发磷光的。
17.权利要求12的方法，其中标记是放射性的。
18.权利要求12的方法，其中标记是纳米粒子。
19.权利要求12的方法，其中标记是树枝状高分子。
20.权利要求12的方法，其中标记是分子聚集体。
21.权利要求12的方法，其中标记是量子点。
22.权利要求12的方法，其中标记是珠子。
23.权利要求1的方法，其中探测探针是结合有探测寡核苷酸的纳米粒子探针。
24.权利要求23的方法，其中纳米粒子由贵重金属制成。
25.权利要求24的方法，其中纳米粒子由金或银制成。
26.权利要求25的方法，其中纳米粒子由金制成。
27.权利要求23的方法，其中检测包括将基板与银染区接触。
28.权利要求23的方法，其中检测包括检测由纳米粒子散射的光。
29.权利要求23的方法，其中检测包括用光扫描仪观测。
30.权利要求23的方法，其中检测包括用平板扫描仪观测。
31.权利要求29或30的方法，其中扫描仪连接于电脑上，电脑上装载有能够计算灰度值的软件，所计算的灰度值提供所检测核酸的量的定量值。
32.权利要求23的方法，其中附着于基板上的寡核苷酸位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
33.权利要求32的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
34.权利要求32的方法，其中基板与银染区接触，产生了导电性的改变。
35.权利要求23的方法，其中每一个都能够识别不同的目标核酸序列的许多寡核苷酸附着于基板上的斑点阵列中，每个寡核苷酸斑点都位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
36.权利要求35的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
37.权利要求35的方法，其中基板与银染区接触以产生导电性的改变。
38.检测样品中一个或一个以上目标核酸序列的方法，所述样品包含比扩增的核酸分子生物复杂度更高的核酸分子，一个或一个以上目标核酸序列中的每一个与已知核酸序列都至少有一个核苷酸不同，该方法包括步骤a)提供结合有许多捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中捕获寡核苷酸具有与一个或一个以上目标核酸序列的一个或一个以上部分互补的序列；b)提供一个或一个以上包含探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)的一个或一个以上目标核酸序列的一个或一个以上部分互补的序列；c)在捕获寡核苷酸能够与一个或一个以上目标核酸序列的一个或一个以上部分有效杂交，探测探针能够与一个或一个以上目标核酸序列的部分有效杂交，以及允许区分具有至少一个核苷酸差异的目标核酸序列的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测任何的捕获寡核苷酸和探测探针是否与任何的目标核酸序列杂交。
39.权利要求38的方法，其中目标核酸序列包含单核苷酸多态性。
40.权利要求38的方法，其中单一核苷酸的差异由结合于基板的捕获寡核苷酸所识别。
41.权利要求38的方法，其中单一核苷酸的差异由探测寡核苷酸所识别。
42.权利要求38的方法，其中目标核酸分子包含基因组DNA、基因组RNA、表达的RNA、质粒DNA、线粒体或其他细胞器官DNA、游离的细胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述两个或两个以上的混合物。
43.权利要求38的方法，其中基板包含许多捕获寡核苷酸，其中每一个捕获寡核苷酸都能够识别不同的单核苷酸多态性。
44.权利要求38的方法，其中样品包含一个以上的核酸靶物，其中每一个都包含不同的单核苷酸多态性。
45.权利要求38的方法，其中提供了一个或一个以上类型的探测探针，其中每一个核酸靶物都结合有探测寡核苷酸，能够与不同的核酸靶物杂交。
46.权利要求38的方法，其中将样品与探测探针接触，以使存在于样品中的核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交，然后将结合于探测探针的核酸靶物与基板接触以使核酸靶物与基板上的捕获寡核苷酸杂交。
47.权利要求38的方法，其中将样品与基板接触以使存在于样品中的核酸靶物与捕获寡核苷酸杂交，然后将结合于捕获寡核苷酸的核酸靶物与探测探针接触，以使核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交。
48.权利要求38的方法，其中样品同时与探测探针和基板接触。
49.权利要求38的方法，其中探测探针包含可探测标记。
50.权利要求49的方法，其中探测标记允许通过光子学、电子学、声学、光声、重力、电化学、电光、质谱、酶学、化学、生物化学、或者物理学手段探测。
51.权利要求49的方法，其中标记是荧光的。
52.权利要求49的方法，其中标记是发光的。
53.权利要求49的方法，其中标记是发磷光的。
54.权利要求49的方法，其中标记是放射性的。
55.权利要求49的方法，其中标记是纳米粒子。
56.权利要求49的方法，其中标记是树枝状高分子。
57.权利要求49的方法，其中标记是分子聚集体。
58.权利要求49的方法，其中标记是量子点。
59.权利要求49的方法，其中标记是珠子。
60.权利要求38的方法，其中探测探针是结合有探测寡核苷酸的纳米粒子探针。
61.权利要求60的方法，其中纳米粒子由贵重金属制成。
62.权利要求61的方法，其中纳米粒子由金或银制成。
63.权利要求62的方法，其中纳米粒子由金制成。
64.权利要求60的方法，其中检测包括将基板与银染区接触。
65.权利要求60的方法，其中检测包括观测由纳米粒子散射的光。
66.权利要求60的方法，其中检测包括用光扫描仪观测。
67.权利要求60的方法，其中检测包括用平板扫描仪观测。
68.权利要求66或67的方法，其中扫描仪连接于电脑上，电脑上装载有能够计算灰度值的软件，所计算的灰度值提供所检测核酸的量的定量值。
69.权利要求60的方法，其中附着于基板上的寡核苷酸位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
70.权利要求69的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
71.权利要求69的方法，其中基板与银染区接触以产生导电性的改变。
72.权利要求60的方法，其中每一个都能够识别不同的目标核酸序列的许多寡核苷酸附着于基板上的斑点阵列中，每个寡核苷酸斑点都位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
73.权利要求72的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
74.权利要求72的方法，其中基板与银染区接触以产生导电性的改变。
75.鉴定样品中单核苷酸多态性的方法，所述样品包含比扩增的核酸分子生物复杂度更高的核酸分子，该方法包括步骤a)提供结合有至少一个捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中所述的至少一个捕获寡核苷酸具有与包含特定多态性的核酸靶物的至少一部分互补的序列；b)提供结合有探测寡核苷酸的探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)的核酸靶物的至少一部分互补的序列；c)在捕获寡核苷酸能够与核酸靶物有效杂交，探测探针能够与核酸靶物有效杂交，以及允许区分具有单一核苷酸差异的靶物的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测捕获寡核苷酸和探测探针是否与核酸靶物杂交。
76.权利要求75的方法，其中多态性由结合于基板的捕获寡核苷酸所识别。
77.权利要求75的方法，其中多态性由探测寡核苷酸所识别。
78.权利要求75的方法，其中样品中的核酸分子包含基因组DNA、基因组RNA、表达的RNA、质粒DNA、线粒体或其他细胞器官DNA、游离的细胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述两个或两个以上的混合物。
79.权利要求75的方法，其中基板包含许多捕获寡核苷酸，其中每一个捕获寡核苷酸都能够识别不同的单核苷酸多态性。
80.权利要求75的方法，其中样品包含一个以上的核酸靶物，其中每一个核酸靶物都包含一个或一个以上不同的单核苷酸多态性。
81.权利要求75的方法，其中提供了一个或一个以上类型的探测探针，其中每一个探测探针都结合有探测寡核苷酸，能够与不同的核酸靶物杂交。
82.权利要求75的方法，其中将样品与探测探针接触，以使存在于样品中的核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交，然后将结合于探测探针的核酸靶物与基板接触以使核酸靶物与基板上的捕获寡核苷酸杂交。
83.权利要求75的方法，其中将样品与基板接触以使存在于样品中的核酸靶物与捕获寡核苷酸杂交，然后将结合于捕获寡核苷酸的核酸靶物与探测探针接触，以使核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交。
84.权利要求75的方法，其中样品同时与探测探针和基板接触。
85.权利要求75的方法，其中探测探针包含可探测标记。
86.权利要求85的方法，其中探测标记允许通过光子学、电子学、声学、光声、重力、电化学、电光、质谱、酶学、化学、生物化学、或者物理学手段探测。
87.权利要求85的方法，其中标记是荧光的。
88.权利要求85的方法，其中标记是纳米粒子。
89.权利要求85的方法，其中标记是发光的。
90.权利要求85的方法，其中标记是发磷光的。
91.权利要求85的方法，其中标记是放射性的。
92.权利要求85的方法，其中标记是树枝状高分子。
93.权利要求85的方法，其中标记是分子聚集体。
94.权利要求85的方法，其中标记是量子点。
95.权利要求85的方法，其中标记是珠子。
96.权利要求75的方法，其中探测探针是结合有探测寡核苷酸的纳米粒子探针。
97.权利要求96的方法，其中纳米粒子由贵重金属制成。
98.权利要求97的方法，其中纳米粒子由金或银制成。
99.权利要求98的方法，其中纳米粒子由金制成。
100.权利要求96的方法，其中检测包括将基板与银染区接触。
101.权利要求96的方法，其中检测包括检测由纳米粒子散射的光。
102.权利要求96的方法，其中检测包括用光扫描仪观测。
103.权利要求96的方法，其中检测包括用平板扫描仪观测。
104.权利要求102或103的方法，其中扫描仪连接于电脑，电脑上装载有能够计算灰度值的软件，所计算的灰度值提供所检测核酸的量的定量值。
105.权利要求96的方法，其中附着于基板上的寡核苷酸位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
106.权利要求105的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
107.权利要求105的方法，其中基板与银染区接触以产生导电性的改变。
108.权利要求96的方法，其中每一个都能够识别不同的单核苷酸多态性的许多寡核苷酸附着于基板上的斑点阵列中，每个寡核苷酸斑点都位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
109.权利要求108的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
110.权利要求109的方法，其中基板与银染区接触以产生导电性的改变。
111.鉴定样品中一个或一个以上单核苷酸多态性的方法，所述样品包含比扩增的核酸分子生物复杂度更高的核酸分子，该方法包括步骤a)提供结合有许多捕获寡核苷酸的可寻址基板，其中捕获寡核苷酸具有与核酸靶物的多个部分互补的序列，每个所述的部分都包含特定的多态性；b)提供包含探测寡核苷酸的一个或一个以上探测探针，其中探测寡核苷酸具有与步骤(a)的核酸靶物其中之一的至少一部分互补的序列，该核酸靶物不被基板上的捕获寡核苷酸所识别；c)在捕获寡核苷酸能够与核酸靶物的多个部分有效杂交，探测探针能够与核酸靶物有效杂交，以及允许区分具有单一核苷酸差异的靶物的条件下，使样品与基板和探测探针接触；和d)检测任何的捕获寡核苷酸和探测探针是否与任何的核酸靶物杂交。
112.权利要求111的方法，其中多态性由结合于基板的捕获寡核苷酸所识别。
113.权利要求111的方法，其中多态性由探测寡核苷酸所识别。
114.权利要求111的方法，其中样品中的核酸分子包含基因组DNA、基因组RNA、表达的RNA、质粒DNA、线粒体或其他细胞器官DNA、游离的细胞DNA、病毒DNA或病毒RNA、或者上述两个或两个以上的混合物。
115.权利要求111的方法，其中基板包含许多捕获寡核苷酸，其中每一个都能够识别一个或一个以上不同的单核苷酸多态性。
116.权利要求111的方法，其中样品包含一个以上的核酸靶物，其中每一个都包含不同的单核苷酸多态性。
117.权利要求111的方法，其中提供了一个或一个以上类型的探测探针，其中每一个都结合有探测寡核苷酸，能够与不同的核酸靶物杂交。
118.权利要求111的方法，其中将样品与探测探针接触，以使存在于样品中的核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交，然后将结合于探测探针的核酸靶物与基板接触以使核酸靶物与基板上的捕获寡核苷酸杂交。
119.权利要求111的方法，其中将样品与基板接触以使存在于样品中的核酸靶物与捕获寡核苷酸杂交，然后将结合于捕获寡核苷酸的核酸靶物与探测探针接触，以使核酸靶物与探测探针上的探测寡核苷酸杂交。
120.权利要求111的方法，其中样品同时与探测探针和基板接触。
121.权利要求111的方法，其中探测寡核苷酸包含可探测标记。
122.权利要求121的方法，其中探测标记允许通过光子学、电子学、声学、光声、重力、电化学、电光、质谱、酶学、化学、生物化学、或者物理学手段探测。
123.权利要求121的方法，其中标记是荧光的。
124.权利要求121的方法，其中标记是发光的。
125.权利要求121的方法，其中标记是发磷光的。
126.权利要求121的方法，其中标记是放射性的。
127.权利要求121的方法，其中标记是纳米粒子。
128.权利要求121的方法，其中标记是树枝状高分子。
129.权利要求121的方法，其中标记是分子聚集体。
130.权利要求121的方法，其中标记是量子点。
131.权利要求121的方法，其中标记是珠子。
132.权利要求111的方法，其中探测探针是结合有探测寡核苷酸的纳米粒子探针。
133.权利要求132的方法，其中纳米粒子由贵重金属制成。
134.权利要求133的方法，其中纳米粒子由金或银制成。
135.权利要求134的方法，其中纳米粒子由金制成。
136.权利要求132的方法，其中检测包括将基板与银染区接触。
137.权利要求132的方法，其中检测包括检测由纳米粒子散射的光。
138.权利要求132的方法，其中检测包括用光扫描仪观测。
139.权利要求132的方法，其中检测包括用平板扫描仪观测。
140.权利要求138或139的方法，其中扫描仪连接于电脑，电脑上装载有能够计算灰度值的软件，所计算的灰度值提供所检测核酸的量的定量值。
141.权利要求132的方法，其中附着于基板上的寡核苷酸位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
142.权利要求141的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
143.权利要求141的方法，其中基板与银染区接触以产生导电性的改变。
144.权利要求141的方法，其中每一个都能够识别不同的单核苷酸多态性的许多寡核苷酸附着于基板上的斑点阵列中，每个寡核苷酸斑点都位于两个电极之间，纳米粒子由电导体材料制成，并且步骤(d)包括检测导电性的改变。
145.权利要求144的方法，其中电极由金制成，纳米粒子也由金制成。
146.权利要求146的方法，其中基板与银染区接触以产生导电性的改变。
147.权利要求1、38、75或111的方法，其中更高的生物复杂度大于约50,000。
148.权利要求1、38、75或111的方法，其中更高的生物复杂度为约50,000-50,000,000,000。
149.权利要求1、38、75或111的方法，其中更高的生物复杂度为约1,000,000,000。
150.权利要求1或38的方法，其中目标核酸序列是生物学微生物基因的一部分。
151.权利要求1或38的方法，其中目标核酸序列是葡萄球菌基因的一部分。
152.权利要求151的方法，其中葡萄球菌是金黄色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、表皮葡萄球菌、里昂葡萄球菌、人型葡萄球菌、或腐生葡萄球菌。
153.权利要求151的方法，其中目标核酸序列是Tuf基因的一部分。
154.权利要求151的方法，其中目标核酸序列是femA基因的一部分。
155.权利要求151的方法，其中目标核酸序列是16S rRNA基因的一部分。
156.权利要求151的方法，其中目标核酸序列是hsp60基因的一部分。
157.权利要求151的方法，其中目标核酸序列是sodA基因的一部分。
158.权利要求1或38的方法，其中目标核酸序列是mecA基因的一部分。
159.权利要求1或38的方法，其中目标核酸序列包含SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ IDNO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ IDNO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ IDNO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ IDNO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ IDNO78中所列出的序列。
160.权利要求1或38的方法，其中，至少其中一个探测寡核苷酸包含SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ IDNO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ IDNO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ IDNO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ IDNO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ ID NO78中所列出的序列。
161.权利要求1的方法，其中捕获寡核苷酸包含SEQ ID NO17，SEQID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ IDNO32，SEQ ID NO33，SEQID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQID NO37，SEQID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ ID NO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQID NO49，SEQ ID NO50，SEQ IDNO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQ ID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ ID NO59，SEQ ID NO60，SEQ ID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ IDNO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQ ID NO78中所列出的序列。
162.权利要求38的方法，其中，至少其中一个捕获寡核苷酸包含SEQID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO24，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ IDNO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO40，SEQ ID NO41，SEQ ID NO42，SEQ ID NO43，SEQ ID NO44，SEQ IDNO45，SEQ ID NO46，SEQ ID NO47，SEQ ID NO48，SEQ ID NO49，SEQ ID NO50，SEQ ID NO51，SEQ ID NO52，SEQ ID NO53，SEQID NO54，SEQ ID NO55，SEQ ID NO56，SEQ ID NO57，SEQ ID NO58，SEQ IDNO59，SEQ ID NO60，SEQID NO61，SEQ ID NO62，SEQ ID NO63，SEQID NO64，SEQ ID NO65，SEQ ID NO66，SEQ ID NO67，SEQ ID NO68，SEQ ID NO69，SEQ ID NO70，SEQ ID NO71，SEQ ID NO72，SEQ ID NO73，SEQ ID NO74，SEQ ID NO75，SEQ ID NO76，SEQ ID NO77，或SEQID NO78中所列出的序列。
163.权利要求38的方法，其中，至少其中一个目标核酸序列是葡萄球菌基因的一部分，并且至少其中一个目标核酸序列是mecA基因的一部分。
164.权利要求38的方法，其中该方法用于区分同一属中两个或两个以上种。
165.权利要求164的方法，其中所述种有两个或两个以上不连续核苷酸的不同。
166.权利要求164的方法，其中所述种有两个或两个以上连续核苷酸的不同。
167.权利要求164的方法，其中所述种有至少一个核苷酸的不同。
全文摘要
本发明提供检测样品中目标核酸分子的方法，所述样品包含具有比扩增的核酸分子更高生物复杂度的核酸分子。具体地，本发明提供检测样品中单核苷酸多态性(SNP)的方法和探针，所述样品包含具有比扩增的核酸分子更高生物复杂度的核酸分子。
文档编号G01N33/00GK1878874SQ200380109533
公开日2006年12月13日 申请日期2003年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者鲍奕佳, 萨达卡·S·马拉, 尤维·米勒, 詹姆斯·J·斯托霍夫, 苏珊·R·赫策尔 申请人:内诺斯佩尔公司