专利名称：多重扩增与检测的制作方法
多重扩增与检测本发明涉及多重检测的领域。本发明尤其涉及在单次反应中，基于探针的不同熔解温度或熔解图谱，检测一份样品中一种或多种目标(靶)核酸的方法。本发明还提供了用于此类方法的探针和试剂盒。利用多种引物对，以在单次PCR反应中同时扩增多种目标序列的多重PCR，是一种比使用单种引物对的标准PCR更加高效率的PCR方法。对不同目标核酸的同时扩增降低了 PCR分析的成本和时间消耗，令实验变差和交叉污染的风险最小化，并且提高了最终结果的可靠性。多重PCR已被用于DNA检测的多个领域，包括微生物的鉴定、基因表达分析、突变和多态性分析、基因分型和DNA阵列分析以及RNA检测。已发展出了用于在PCR反应过程中对扩增产物进行定量的实时PCR。实时PCR所基于的原理是，从染料发射出的荧光直接或间接地与新合成的扩增子的形成相关联，或者引物与DNA模板之间的退火可以被检测到并且在每个PCR循环中与扩增子的量成比例。 实时PCR以闭管方式进行，并且可以定量。目前已有数种进行实时PCR的方法，例如利用 TaqMan 探针(美国专利 5，210，015 和 5，487，972，以及 Lee 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)21 :3761-6,1993)，分子信标(美国专利5，925，517和6，103，476，以及Tyagi和 Kramer, Nat. Biotechnol.(国家生物科技)14 =303-8,1996)，自检测扩增子(蝎型探针) (美国专利 6，326，145，以及 Whitcombe 等人，Nat. Biotechnol.(国家生物科技)17 :804-7, 1999)，Amplisensor (Chen 等人，Appl. Environ. Microbiol.(应用与环境微生物学)64 4210-6，1998)，AmplifIuor (美国专利 6，117，635，以及 Nazarenko 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25 :2516-21,1997)，替换杂交探针(Li 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)30 :E5,2002) ；DzyNA-PCR(Todd 等人，Clin. Chem.(临床化学)46 :625_30，2000)，荧光限制酶检测(Cairns等人，Biochem. Biophys. Res. Commun.(生物化学与生物物理研究通讯)318 :684-90，2004)，以及邻近杂交探针(美国专利6，174,670以及Wittwer等人， Biotechniques (生物技术)22 130-1，1；34_8，1997)。这些探针大多包含一对涉及荧光共振能量转移(FRET)的染料(一种报告染料和一种受体染料)，其中所述受体染料可令所述报告染料的荧光发射淬灭。总之，荧光标记的探针提高了扩增子定量的特异性。用于PCR的另一种形式的探针，是一种具有两条互补的寡核苷酸的双链线性探针。该在先技术中所描述的探针具有相同的长度，其中至少一种寡核苷酸以一种单链构象作为针对一段目标序列的探针。上述寡核苷酸之一的5'端被一种荧光基团标记，而另一种寡核苷酸的3'端被一种淬灭剂，如一种受体荧光基团标记，或者反之亦可。当这两种寡核苷酸相互退火时，上述两种标记互相接近，从而使荧光淬灭。而竞争性地与探针结合的目标(靶)核酸，则能随着其浓度的升高导致探针的荧光发生低于正比例的升高。(Morrison L.等人，Anal. Biochem.(分析生物化学)，Vol.183，pages 231-244(1989)；美国专利 5，928，862)。通过将互补的两条寡核苷酸之一缩短几个碱基，从而得到一种部分双链的线性化探针，这种经改进的双链线性探针亦为本领域所知。该在先技术中的这种双链线性探针中， 较长的寡核苷酸末端被一种荧光基团标记，而较短的寡核苷酸末端被一种淬灭剂标记。所述探针以双链形式存在时，由于荧光基团和淬灭剂位置紧邻，荧光发射较弱。而当一种目标 (靶)核酸存在时，带有淬灭剂的较短的寡核苷酸则被该目标(靶)核酸所取代。结果，较长的寡核苷酸(以探针-目标核酸杂交体形式存在)的荧光发射充分变强(Li等人，Nucleic Acids Research (核酸研究)，Vol. 30, No. 2, e5 (2002))。US2005/0227257描述了一种略加改进的双链线性核酸探针。该专利申请中所描述的探针的改进为，与前述探针相比，通过将两种互补的寡核苷酸之一缩短更多的碱基，而得到一种部分双链的线性化探针。荧光杂交探针还被用于其他的领域。例如，利用荧光杂交探针进行多重基因分型的方法已有描述(例如US6，140，054)，该方法利用与基因组、核酸序列的一段经PCR扩增的目标区域杂交的荧光杂交探针的熔解温度，来鉴定突变和多态性。高通量遗传检测的出现使得对多个基因同时进行定性和定量分析成为必要，并且令多重PCR和实时PCR向着结合成为多重实时PCR发展。由于双链DNA嵌入染料的非特异性，这些染料并不适合用于多重检测，而荧光标记的探针则令多重实时PCR成为可能。但是，多重实时PCR受限于荧光染料组合的可用性。目前，实时PCR中最多只能同时对四或五种荧光染料进行检测和定量。US2005/0053950描述了一种用于多重实时定量聚合酶链式反应(PCR)的方法。该方法根据扩增子以双链体或分离形式存在时，每种扩增子不同的熔解温度(Tm)和双链DNA 染料，如STOR Green I的荧光发射变化，在单次实时PCR反应中对多种PCR产物或扩增子进行定量。对于一种特异性的扩增子，在一低于其Tm的温度测得的荧光发射，与在一高于其Tm的温度测得的荧光发射之间的荧光发射差异，对应于以双链体存在的该扩增子的荧光发射值。相应地，在单次PCR反应中，每种扩增子的荧光发射差异可用于对其进行定量。但是，此类方法的多重性和敏感度相对较低。例如，长度为约100至150个核苷酸之间的扩增子，在熔解温度方面差别微小。因此，这些技术要求使用大小差别巨大的扩增子，以能对其加以区分。但是，对于具有更高的多重性和敏感度水平的多重实时PCR，还需要发展出其他在单次PCR反应中对多种目标序列进行扩增和定量的方法。本发明的方法不同于在先技术。首先，本方法所基于的，是每种探针不同的熔解特性(Tm或熔解图谱)，和当探针内部的双链部分以双链体或分离形式存在时，该探针上的标记物的荧光发射变化。本发明的探针包含一个双链部分，该双链部分可由一种第一寡核苷酸和一种第二寡核苷酸形成；对于每种探针，所述双链部分具有独特的Tm，由此在包含相同或相似的标记物的一组探针中，可对不同的探针加以区分。其次，所述第一寡核苷酸可包含或不包含一种或多种标记，并且此第一寡核苷酸在扩增反应过程中被消耗。在两种不同温度检测的荧光发射之间的差异，对应于当某些探针被消耗后，该探针的荧光发射值。第三， 对未消耗的探针进行的熔解图谱测量，提供了一份样品中目标(靶)核酸的存在或者其量的一种指标。为了便于理解本发明，对一些术语定义如下。本文所用术语“核酸”是核苷酸共价连接的序列，其中一个核苷酸的戊糖的3’位置通过磷酸二酯基团被连接至下一个戊糖的5’位置，并且其中核苷酸残基(碱基)被以特异序列连接，即，核苷酸的线性顺序。本文所用术语“多聚核苷酸”是包含长度大于200核苷酸的序列的核酸。本文所用术语“寡核苷酸”是短的多聚核苷酸或多聚核苷酸的一部分。 寡核苷酸典型地包含约200到约100碱基的序列。“核酸”、“DNA”以及类似术语还包括核酸类似物，即，具有磷酸二酯主链以外的类似物。举例来说，本领域已知并且在主链上具有肽键而非磷酸二酯键的所谓“肽核酸”，被认为在本发明的范围内。本文所用术语“目标(靶)序列”、“目标(靶)核酸”、“目标(靶)核酸序列”和 “所感兴趣的核酸”可互换使用，它们是指将对其进行扩增或者检测或者既扩增又检测的一段目标(靶)区域。目标(靶)序列作为扩增和检测的对象可以是任何核酸。目标(靶) 序列可以是RNA、cDNA、基因组DNA，或者来自如一种致病的微生物或病毒的DNA或RNA。目标(靶)序列还可以是经化学试剂、各种酶类以及物理暴露处理过的DNA。一份样品中令人感兴趣的目标(靶)核酸序列可以以单链DNA或RNA如cDNA、mRNA、其他RNA，或以分离的互补链的形式存在。可以通过物理的、化学的或酶学的方法实现目标(靶)核酸互补链的分离。为了便于描述和理解，当提及所感兴趣的核酸或目标(靶)核酸时，既指在一份待测样品中所发现的这些部分，也指这些核酸的部分的扩增拷贝，除非有相反的特别说明。本文所用术语“引物”是指一种自然产生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸当被置于诱发与一条核酸链互补的一种引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成的起始点，其中所述条件即有核苷酸和一种聚合反应试剂如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度和缓冲条件。本文中的引物是经过选择从而与待扩增的各特异性序列的不同链充分互补的。也就是说引物与它们各自的对应链必须充分互补以能与之杂交。一段非互补的核苷酸片段可以与引物的5’端相联，而该引物序列的其余部分与目标碱基序列的诊断区互补。除了当非互补的核苷酸如上文所述存在于预先确定的引物末端时以外，引物通常是互补的。本文所用术语“与……互补”是指一个核苷酸能与另一个特定的核苷酸碱基配对。 即腺苷与尿苷或胸苷互补，鸟苷与胞苷互补。根据本说明书的目的应当认为，尽管在某些情况下胸苷与鸟苷可以碱基配对，亦不应将它们视为互补的。根据本发明的目的，术语“充分互补”是指探针的一条链上大于或等于70 %，优选大于80 %，更优选大于90 %，最优选大于95%或99%的核酸碱基，在一种匹配方式下能在探针的另一条链(或者所感兴趣的核酸)上找到其Watson-Crick结合伴侣，使得相应的核苷酸能够彼此杂交。确定相同或相似的方法在公众可获得的计算机程序中被编码。优选的决定两条序列间相同及相似的计算机程序方法包括，但不限于在GCG Pileup程序包中可找到的GCG Pileup程序，所述程序使 M Needleman 禾口 ffunsch以 gap creation penalty = 12 禾口 gap extension penalty =4为所述算法的标准缺省值(Devereux等人，核酸研究(Nucleic Acids Res. ) 12 387-395 (1984))，BLASTP，BLASTN，以及 FASTA (Pearson 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国科学院院刊)85 :2444-2448(1988)).所述BLASTX程序是从NCBI和其他来源可公开获得的(BLAST手册，Altschul等人，Natl. Cent. Biotechnol. Inf (美国国立生物技术信息中心)，Natl. Library Med.(美国国立医学图书馆)(NCBI NLM)，NIH(美国国家卫生研究院)，Bethesda, MD ；Altschul 等人，J. MoI. Biol.(分子生物学杂志)215 :403-410 (1990)； Altschul 等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25 :3389-3402 (1997)).术语“双链体”和“双链”可互换使用，它们是指一条寡-多聚核苷酸与互补的寡-多聚核苷酸杂交。术语“相同的”是指两段核酸序列具有同样的序列或互补的序列。
术语“同源的”意为一个单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交的程度可以依赖于许多因素，包括两个序列间的相同的量以及杂交条件(例如温度和盐浓度)。 优选地，相同的区域是大于约S3P，更优选地，相同的区域是大于10bp。本文所用术语“连续监测”以及类似术语，是指在PCR的一个循环中进行多次监测，优选在温度转变期间，更优选在每一温度转变过程中收集至少一个数据点。本文所用术语“逐循环”监测，是指在每一循环对PCR反应进行一次或多次监测。术语“实际消耗量”(ACA)是指在一个反应中，荧光检测所反映的被消耗的探针的量。本文所用术语“扩增”是指在核酸序列的混合物中令一种特定核酸序列的浓度升高的任何扩增过程。本文所用术语“样品”以其最广义使用。一份被怀疑含有核酸的生物样品可以包含但不限于基因组DNA，cDNA(在溶液中或与固相载体结合)以及类似物。本文所用术语“标记”是指任何一种能被用于提供一种可检测的(优选为可以计量的)信号，并能与核酸或蛋白质相联的原子或分子。标记提供的信号可以通过荧光、放射性、比色法、重量分析、磁性、酶活性以及类似途径检测。本文所用术语“相邻”或“基本上相邻”，是指两种寡核苷酸在模板核酸与之互补的链上的位置关系。模板与寡核苷酸杂交的两个区域可以是连续的，即在这两个模板区域之间没有间隔。或者，模板与寡核苷酸杂交的两个区域可以被1至约40个核苷酸间隔开，更优选约1至10个核苷酸。术语“加热循环”、“热循环”是指温度自一个完全变性温度，至一个退火(或者杂交)温度，再至一个延伸温度，并回到完全变性温度变化的重复循环。上述术语还指自一个变性温度至一个延伸温度的重复循环，其中退火和延伸温度合并为同一温度。完全变性温度令所有的双链片段解链成为单链。退火温度令引物与一种核酸模板的分离单链上的互补序列杂交或退火。延伸温度允许扩增子的新生DNA链的合成。本文所用术语“反应”，是指杂交反应、延伸反应或扩增反应，或者其他生物学、化
学反应。本文所用术语“扩增混合物”或“PCR混合物”，是指从核酸模板中检测目标(靶) 核酸所需的组分的混合物。所述混合物可以包含核苷酸(dNTPs)、探针、一种耐热聚合酶、引物以及多条核酸模板。所述混合物还可以进一步包含一种Tris缓冲液、一种单价盐和Mg2+。 每种组分的浓度为本领域所熟知，并可由本领域的普通技术人员作进一步的优化。术语“扩增产物”或“扩增子”，是指在一种扩增方法如PCR中，禾Ij用一对引物，由一种聚合酶扩增出的DNA片段。术语“熔解图谱”是指对一种寡(或多)核苷酸及其互补体进行的、作为该寡(或多)核苷酸分子自双链状态向单链核酸(或者反之亦可)转变的指征的测量结果的集合。 一种核酸自双链状态向单链状态的转变在本领域通常描述为该核酸分子的“熔解”。上述转变也可以描述为该核酸的“变性”或“解链”。相应地，本发明中的熔解图谱也可以称为“解链图谱”、“变性图谱”、“熔解曲线”、“解链曲线”、“杂交/解链图谱”等。一种核酸分子的“熔解温度”或者“Tm”通常是指一种多核苷酸与其互补序列解离时的温度。总的来说，Tm可以被定义为当双链核酸分子中一半的Watson-Crick碱基对断开或解离(即“熔解”了)，而另外一半的Watson-Crick碱基对依然保持完整的双链构象时的温度。在优选的实施方案中双链核酸分子为寡核苷酸，在其他实施方案中双链核酸以一种两状态方式解离，上述这些实施方案中，一种核酸的Tm还可被定义为当一份样品中一半的核酸分子处于单链构象，而该样品中另外一半的核酸分子处于双链构象时的温度。因此，Tm 表明了核酸分子自双链向单链转变(或者反之，核酸分子自单链向双链转变)的中点。本领域中普遍认为，核酸分子自双链向单链的转变并非在单一的温度发生，而是在一个温度范围内发生。尽管如此，Tm提供了关于一份样品中的核酸分子以单链还是双链构象存在的一种方便的近似量度。如此，一份核酸样品的熔解温度可以通过分析该样品的熔解图谱而容易地获得。术语“消耗”或“消耗量”是指在一种标记的探针通常会保持完整的温度下，游离的该标记的探针的量的减少。上述标记的探针可不包含双链部分；上述标记的探针的消耗可以导致检测信号的变化。上述标记的探针的消耗可以包括探针与目标(靶)核酸的杂交或与目标(靶)核酸杂交时该探针的降解。当探针包含双链部分时，游离的标记的探针量的减少，可以由该探针的至少一种链，即该探针的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸或二者皆有， 的消失引起。上述探针的至少一种链的消失意味着该探针的第一寡核苷酸或该探针的第二寡核苷酸或者该探针的上述两种寡核苷酸与目标核酸发生杂交。上述探针的第一寡核苷酸或该探针的第二寡核苷酸或者该探针的上述两种寡核苷酸与目标(靶)核酸发生杂交后， 可继之以该探针的寡核苷酸作为引物发生延伸，或者继之以该探针的寡核苷酸发生降解。本发明描述的方法允许对大量不同的目标(靶)核酸序列进行基本上同时的扩增和检测。第一方面，本发明提供了一种对一份样品进行一种或多种目标(靶)核酸的检测的方法，所述方法包括(a)令一份包含一种或多种目标(靶)核酸的样品与一种反应混合物接触，所述混合物包含一个包括两种或多种探针的探针组，其中至少一种具有双链部分的探针可以包含一种包含一个第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，其中所述第一区域与一种目标(靶)核酸的部分充分互补，和至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成该探针的一个双链部分，其中每种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了一种目标(靶)核酸是否存在，并且其中至少两种探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，并且其中每种上述探针有不同的熔解特性(熔解温度Tm)并能在熔解图谱分析中区分；(b)在样品/反应混合物中进行反应，其中所述反应为延伸条件下的一种引物延伸反应，其中，当一种目标(靶)核酸存在时，所述探针作为引物得到延伸并因此被消耗， 其中相应探针作为可延伸的引物的第一寡核苷酸与目标(靶)序列杂交，并因此在所述引物延伸反应中被消耗，其中所述探针被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分(双链体)；以及(c)作为温度的一个函数，通过检测来自未被消耗的探针上的标记的信号，测量所述反应混合物中所述未被消耗的探针的熔解图谱至少一次，其中所述熔解图谱提供了至少一种目标(靶)核酸是否在所述样品中存在的指征。在该实施方案中，探针的第一寡核苷酸作为引物起作用。在一个引物延伸反应中， 将探针的混合物加入至包含用于在延伸条件下进行延伸的所有成分的反应混合物中。如果一种特定的目标(靶)核酸存在于上述反应中，则相应探针的所述寡核苷酸与目标(靶) 序列杂交，然后得到延伸并掺入至引物延伸产物中，并因此被消耗。所述被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分。在熔解图谱分析中，被消耗的探针表现为一个峰的降低或消失。另一方面，本发明提供了一种对一份样品进行一种或多种目标(靶)核酸的检测的方法，所述方法包括(a)令一份包含一种或多种目标(靶)核酸的样品与一种杂交反应混合物接触，所述杂交反应混合物包含一个包括两种或多种探针的探针组，其中至少一种探针包含一种包含一个与一种目标(靶)核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，和至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，其中所述至少一种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸组成的一个双链部分是否存在，并且其中至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，并且其中每种上述探针的第一和第二寡核苷酸所组成的双链部分有不同的熔解特性并能在熔解图谱分析中区分；(b)于杂交条件下在样品/反应混合物中进行杂交反应，其中，当一种目标(靶) 核酸存在时，与该目标(靶)核酸的部分充分互补的探针的第一寡核苷酸，与该目标序列发生杂交并因此在上述反应过程中被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分(双链体)；以及(c)作为温度的一个函数，通过检测来自未被消耗的探针上的标记的信号，测量所述反应混合物中所述未被消耗的探针的熔解图谱至少一次，其中所述熔解图谱提供了至少一种目标(靶)核酸是否在所述样品中存在的指征。在一个实施方案中，所述探针或探针的第一寡核苷酸可作为杂交探针起作用。在一个杂交反应中，将探针的混合物加入至包含用于杂交条件下的所有成分的反应混合物中。如果一种特定的目标(靶)核酸存在于上述反应中，则相应探针的所述寡核苷酸与该目标序列杂交，并因此被消耗。所述被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分。在熔解图谱分析中，被消耗的探针表现为一个峰的降低或消失。另一方面，本发明提供了一种对一份样品进行一种或多种目标(靶)核酸的检测的方法，所述方法包括(a)令一份包含一种或多种目标(靶)核酸的样品与一种扩增反应混合物接触，所述混合物包含(i) 一对或多对正向/反向寡核苷酸引物，其中当所述样品中存在一种或多种目标(靶)核酸时，所述引物对能扩增所述目标(靶)核酸，(ii) 一个包括两种或多种探针的探针组，其中至少一种探针包含一种包含一个与一种目标(靶)核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，和至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，其中所述至少一种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸组成的一个双链部分是否存在，并且其中至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，并且其中每种上述探针的第一和第二寡核苷酸所组成的双链部分有不同的熔解特性并能在熔解图谱分析中区分；(b)在在样品/扩增反应混合物中进行扩增反应其中，当一种目标(靶)核酸存在时，与该目标(靶)核酸的部分充分互补的所述第一寡核苷酸，与该目标(靶)序列发生杂交并因此在上述扩增反应过程中被消耗；(c)作为温度的一个函数，通过检测来自未被消耗的探针上的标记的信号，测量所述未被消耗的探针的熔解图谱至少一次，其中所述熔解图谱提供了至少一种目标核酸是否在所述样品/扩增反应混合物中得到扩增的一个指征。其中所述至少两种探针中的一种第一探针具有一个基于其双链部分的熔解温度 TmI，其中所述至少两种探针中的一种第二探针具有一个基于其双链部分的熔解温度 Tm2,其中TmI > Tm2，其中相同的标记分别与所述第一和第二探针相联，其中，任何在TmI和/或Tm2的熔解峰的降低提供了所述第一和/或第二探针的消耗的指征。优选地，上述该方法包括步骤(d)(i)比较步骤(C)中获得的至少两种熔解图谱和 / 或(ii)将步骤(c)中获得的一种熔解图谱与
一种事先获得的相同探针的熔解图谱，或者相同探针的一种在平行对照反应中同时获得的熔解图谱，或者相同探针的一种理论上的熔解图谱进彳亍比较其中所述熔解图谱的变化提供了至少一种目标核酸是否在所述样品/扩增反应混合物中得到扩增的一个指征。所述扩增反应可以为任意一种扩增方法，例如PCR，SDA, NASBA, LAMP，3SR，ICAN， TMA,解旋酶依赖的等温DNA扩增以及类似方法。PCR为一种优选的扩增方法。所述扩增反应混合物应包含标准的扩增试剂。扩增试剂可以方便地分为四类组分(i) 一种水性缓冲液，通常包括但不限于一种镁盐，(ii)扩增底物，例如DNA或RNA， (iii) 一种或多种寡核苷酸引物(通常针对每种目标序列有两种引物，当采用PCR时，所述序列限定了双链目标序列的两条互补链的5'端)，以及(iv) —种扩增酶如一种多核苷酸聚合酶(例如，用于PCR的Taq聚合酶或用于TMA的RNA聚合酶)，或者一种连接酶。此外， 通常还需要适当的核苷三磷酸。更多的试剂或添加剂的加入可由本领域的技术人员酌情而定，并且这些试剂的选择属于本领域的普通技术人员的技能范围。当然，当上述扩增试剂用于同时进行逆转录和扩增时，上述扩增试剂中还包括逆转录试剂。根据所采用的扩增反应方法，对扩增试剂进行选择，属于本领域的普通技术人员的技能范围。在本文所描述的方法中，所提供的样品为被怀疑包含目标核酸或所感兴趣的核苷酸变异的样品。样品中包含的目标核酸可以是双链的基因组DNA或者在必要时是cDNA，然后利用任何为本领域的技术人员所知的适当的变性方法，包括物理的、化学的或酶学的方法，使上述基因组DNA或cDNA变性。一种用于链分离的优选的物理方法包括加热核酸至其完全(> 99% )变性。典型的热变性条件包括从约80°C至约105°C范围的温度，和从数秒至数分钟范围的时间。作为变性之外的另一选择，目标核酸可以以一种单链形态，例如单链的RNA或DNA病毒，存在于样品中。然后将变性的核酸链与寡核苷酸引物和探针在杂交条件下共同孵育，所述杂交条件即令所述引物或探针能与核酸单链结合的条件。在本发明的一些实施方案中，退火的引物和/或探针被一种聚合剂延伸。在适当量的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP 和dTTP)或其如前所述的类似物的存在下，寡核苷酸引物依赖于模板的延伸反应，在包含适当的盐、金属阳离子和PH缓冲体系的反应介质中，被一种聚合剂所催化。合适的聚合剂为已知可催化依赖于引物和模板的DNA合成的酶类。利用所述DNA聚合酶类催化DNA合成的反应条件为本领域所熟知。探针在扩增过程中被消耗。一种扩增引物可以是一种目标特异性的引物，其包含一个与目标核酸的一个目标区域互补的3’启始部分。扩增引物也可以是通用引物，所述通用引物具有与靶特异引物的 5’通用部分相同或基本上相同的序列。反应可以包括针对多个靶序列的扩增的多个引物。 所述多个引物的所述5’通用部分可以具有实质相同的序列组成，所述实质相同的序列组成是与所述通用扩增引物的所述3’启始部分等同或基本上等同。优选地，所述引物是DNA引物，特别是适合于PCR扩增的那些。用于SNP基因分型或者检测变异核苷酸时，扩增引物可以是一种等位基因特异性的引物，其中所述引物的一个末端核苷酸为经过选择，从而与所怀疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸之一互补的，由此当所述引物与包含一个特定核苷酸的诊断区域退火时，所述引物的延伸产物得到合成，而当所述引物与不包含目标核酸序列的该特定核苷酸的诊断区域退火时，所述延伸产物不被合成。扩增反应混合物中包括由正向和反向引物组成的引物对，如此若样品中存在一种目标核酸，所述引物对将能扩增该目标核酸，扩增优选以一种指数方式进行。在一些实施方案中，反应混合物中会含有1至50、1至25、1至20或1至10种引物对。在另一些实施方案中，反应混合物中会含有5至50、5至25、5至20或5至10种引物对。如上所述，一种特定的引物对中的正向或反向引物可以是一种在多于一种引物对中共用的通用引物。扩增反应混合物包含由两种或多种探针组成的一个探针组。所述探针包含一种包含一个第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，其中所述第一区域与一种目标核酸的部分充分互补，和—种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成该探针的一个双链部分。所述第一寡核苷酸须能在适当的杂交条件下与至少一种所述目标核酸的部分相结合。优选地，每种第一寡核苷酸对仅一种目标核酸的部分具有特异性。所述第一寡核苷酸应具有一个第一区域，该第一区域的核苷酸序列与一种目标核酸的部分的核苷酸序列互补或充分互补。此第一互补区域的长度优选为6至100个核苷酸，更优选为15至30个核苷酸。所述第一寡核苷酸的总长度优选为15至150个核苷酸，更优选为17至100个核苷酸，最优选为20至80个核苷酸。在一些反应包括引物延伸或扩增的实施方案中，与所述第一寡核苷酸互补的目标核酸的部分须属于将被正向和反向引物扩增的序列或与该序列重叠。或者，所述第一寡核苷酸可以是所述扩增引物之一，例如是正向或者反向引物。在一些实施方案中，所述第一和 /或第二寡核苷酸不是一种正向或者反向引物。所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的一个第二区域充分互补的区域。此第二区域的长度优选为4至100个核苷酸，更优选为15至30个核苷酸。所述第一寡核苷酸的第二区域可与所述第一寡核苷酸的第一区域重叠或不重叠。所述第二寡核苷酸的总长度优选为6至150个核苷酸，更优选为10至100个核苷酸，最优选为12至80个核苷酸。所述第一和第二寡核苷酸可以在5'或3'端包含1至5个或1至10个或更多的分别与目标核酸或所述第一寡核苷酸不互补的核苷酸。寡核苷酸探针可以包含核苷酸、核苷酸衍生物、核苷酸类似物和/或非核苷酸的化学部分。可能促进探针结合的对所述探针的改进包括但不限于向所述探针中掺入带正电荷的或中性的磷酸二酯键，以减弱探针和目标核酸的多聚阴离子主链之间的斥力(参见 Letsinger等人，1988，J. Amer. Chem. Soc.(美国化学学会杂志)110 :4470)；向所述探针中掺入烷基化或卤化的基团如5-溴尿苷，以促进碱基堆积；向所述探针中掺入核糖核苷酸， 以促使探针目标核酸双链体形成具有增强的碱基堆积的“A”型结构；用2，6_ 二氨基嘌呤(氨基腺苷)替换所述探针中部分或全部的腺苷；以及掺入核苷酸衍生物如LNA (锁核酸)， PNA (肽核酸)或类似物。通常所述探针的3’末端为“封闭的”，以阻止探针掺入到引物延伸产物中。不过在本发明的一些优选的实施方案中，一些探针同时还作为引物起作用，因此所述探针的3'末端为未封闭的。“封闭”可以通过使用非互补的碱基或通过将一个化学部分，如生物素或磷酸基团，添加到最后一个核苷酸的羟基上来实现。依赖于所选择的部分，所述化学部分还可以作为一种用于后续检测或者捕获与之相联的核酸的标记，而起到双重作用。封闭还可以通过去除3’ -羟基或使用缺少3’ -羟基的核苷酸如双脱氧核苷酸而实现。不难理解，术语“探针”是指该种探针的复数，即反应混合物中并不仅仅包含该探针的一个分子。在本发明的一些实施方案中，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域不重叠或者不充分重叠。在本发明的另一些实施方案中，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域充分重叠，或者所述第二区域包含于所述第一区域中。在这些实施方案中，所述第一寡核苷酸与目标序列杂交形成的双链体的Tm，优选高于所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交形成的双链体的Tm，如此若一种目标核酸存在，所述第一寡核苷酸与该目标核酸形成更牢固的杂交体，从而与所述第一 /第二寡核苷酸双链体相比在更高的温度熔解。优选地，所述第一寡核苷酸与目标核酸形成的双链体的Tm比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸形成的双链体的Tm高至少2度或至少5度。在另一些实施方案中，所述第一寡核苷酸可以包含一个与用于扩增的一种引物的序列相同或充分相同的第三区域。本发明的至少一种探针能够形成一个双链部分。由于这种双链部分，该探针具有一个熔解温度Tm和一种特征性的熔解图谱。特别地，本发明的多种探针的一种混合物也具有一种特征性的熔解图谱。熔解温度(Tm)受若干因素的影响，包括但不限于盐浓度、DNA浓度、变性剂的存在、 核酸序列、GC含量以及长度。典型地，每种双链核酸探针具有一个独特的Tm。在低于一个给定Tm的温度下，至少50%的核酸双链体保持以双链体形式存在。相反，在高于一个给定 Tffl的的温度下，预计超过50%的核酸双链体会解链为两条寡核苷酸单链。任意一种给定的DNA片段的Tm可以通过为本领域所熟知的方法加以确定。例如， 本领域中测定一段DNA片段Tm的一种方法是，利用一台紫外分光光度计中的一个恒温小室，并测定伴随温度缓慢升高时268nm的吸光度。以吸光度对温度作图，得到一条有两个平稳段的S形曲线。(例如，参见
图1)。吸光度在这两个平稳段之间的中间点对应于该片段的Tm。或者，以吸光度的一阶负导数对温度作图，得到一条正态分布曲线。该正态曲线的峰对应于该片段的Tm。还可以通过最近邻法测定一种探针的Tm或者多种探针的一种混合物的多个Tm，并且在单次反应中的探针上存在一种双链DNA染料或标记时，还可以对一种探针的Tm或者多种探针的一种混合物的多个Tm进行细致的或者说精确的测量。例如，以每秒0. OrC至3°C 的速率，将一种包含一种探针和适当的缓冲液的反应混合物从一个杂交温度加热至完全变性温度。同时，以一种被上述染料(标记)吸收的波长的光照射上述混合物，并检测和记录上述染料(探针)的荧光发射，作为荧光发射读数。以上述荧光发射读数相对于温度的一阶负导数对温度作图，得到若干正态曲线，所述曲线的每个峰对应于该探针的实际Tm。所述曲线也被称为“熔解图谱”或“杂交/解链图谱”。一种探针的Tm或熔解图谱还可以通过一种基于本领域所熟知的理论的计算机程序进行估计。对于一次多重检测，在一个反应中包括了由针对多种目标序列的多种探针构成的探针组。在一个实施方案中，一组探针中的不同探针可以包含相同的标记或者其发射光谱不可区分的标记。这样的一个探针组中的每种探针应具有不同的Tm，从而令各自的熔解图谱能够相互区分。不仅个别的探针具有一种熔解图谱，上述探针组中的多种探针的混合物也具有该探针组特征性的熔解图谱。所述反应混合物可以包含一种没有特征性熔解温度的单链探针。根据本发明，通过设计由与不同的目标序列杂交的探针和基于其内部的双链部分而具有不同熔解温度的探针组成的探针组，可以在单个管中对多种目标核酸序列进行分析。如果一种目标序列存在，则其相应的探针被消耗。然后根据反应前后所述探针组的熔解图谱之间的比较，可以确定该目标的序列。有利地，一个探针组中的不同探针可以与同样的标记相联，从而允许在单个发射波长进行监测。在一个实施方案中，所述探针组中的每种探针与同样的标记，例如一个荧光能量转移对或接触淬灭对，更特别地，一种为荧光基团的第一标记和一种为淬灭剂的第二标记相联。另一方面，多个探针组可以与不同的标记对相联，从而各个探针组可基于不同发射光谱而相互区分。根据本发明，分析多种目标核酸的方法既可以利用与具有可区分的发射光谱的不同标记相联的多种探针的混合物，也可以利用与具有相同的或重叠的发射光谱的标记相联，但可基于其内部的双链部分在熔解温度上的不同而加以区分的多种探针的混合物。当利用具有双链部分的探针时，所述探针可以包含两条链一条第一寡核苷酸和一条第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含一个与一种目标核酸充分互补的第一区域 (参见图4)。在一个实施方案中，探针包含一条第一寡核苷酸和至少一条第二寡核苷酸(参见图4A至J)。所述第一寡核苷酸包含一个与一种目标核酸充分互补的第一区域和一个第二区域，其中所述第二区域与一条或多条第二寡核苷酸充分互补，从而所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸能结合形成一个双链部分。所述第一区域和第二区域可以以任意顺序排列，例如5'至3'或3'至5'(参见图4A)，或者一个区域包含在另一个区域内(参见图 4B)。优选地，若所述第一寡核苷酸作为一种引物，所述第一区域和第二区域以3'至5'的顺序排列(参见图4A)。在一方面，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域不重叠或者不充分重叠(参见图4A)。换句话说，所述第一区域与一段目标序列互补，而所述第二区域与该目标序列不互补。当所述第二区域与所述目标序列不互补时，不同的探针可以具有相同或充分相同的第二区域序列，并且该探针组的不同探针之间可以具有相同的第二寡核苷酸。当所述探针组有相同的第二寡核苷酸时，该探针组中的不同探针的第一寡核苷酸的第二区域可以在长度和/或核苷酸序列方面有差异，从而各种探针有不同的Tm和熔解图谱。另一方面，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域充分重叠，或者所述第二区域包含于所述第一区域内(参见图4B)，其中所述第一寡核苷酸与目标序列杂交形成的双链体的Tm高于所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交形成的双链体的Tm，如此若一种目标核酸存在，该目标核酸与所述探针的第一寡核苷酸形成更牢固的杂交体，从而该目标核酸/第一寡核苷酸双链体与第二寡核苷酸/第一寡核苷酸双链体相比在更高的温度熔解。在该方面，所述第一区域可以比所述第二区域更长，或者所述第二区域可以在与所述第二寡核苷酸杂交时包含错配的核苷酸。所述第一寡核苷酸与目标核酸的结合阻止了所述探针的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸结合。优选地，所述第一寡核苷酸与所述目标序列的杂交体的Tm比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的杂交体的Tm高至少2度。更优选地，所述第一寡核苷酸与所述目标序列的杂交体的Tm比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的杂交体的Tm高至少5度。又一方面，第一寡核苷酸包含一个与一段引物序列相同或充分相同的第三区域 (参见图4C和E)。所述第三区域可与目标序列互补或不互补。一组探针中的多种探针可以包含相同的第三区域序列。与所述第三区域序列相同的所述引物可以作为一种通用扩增引物。当目标核酸特异性的探针(作为引物)经过若干个循环的扩增变得不足时，上述通用引物可以作为接替的引物在后续循环中继续进行扩增。在本发明的一些实施方案中，所述第一和第二寡核苷酸通过一种连接部分相连。 这种连接部分可以包含核苷酸、核苷酸衍生物、核苷酸类似物或者一种非核苷酸的化学键， 换言之，所述第一和第二寡核苷酸可以是相连的寡核苷酸中的一段(图4K)。在该实施方案中，所述探针可以理解为仅包含一段第一寡核苷酸(参见图4K)，此第一寡核苷酸包含能形成茎-环结构的自我互补区域，其中所述自我互补区域彼此充分互补，形成了该探针的双链部分。其中的茎部分可以位于寡核苷酸的任意部分并且长度为4至20个核苷酸。所述寡核苷酸的3'部分优选与目标序列互补。它可以具有一个平末端，或者3'突出或5'突出末端。平末端或3'突出末端为优选的形式。上述含双链部分的探针的第一寡核苷酸能在扩增过程中被消耗。或者，上述含双链部分的探针的第一和第二寡核苷酸都能在扩增过程中被消耗。优选地，将所述第一寡核苷酸设计为会在一次反应中被消耗，而所述第二寡核苷酸可保持不变。所述探针可以被延伸，从而可作为一种引物起作用。或者，所述第一寡核苷酸的3’ 端被封闭并且第二寡核苷酸的3’被封闭，从而不可被延伸。每种探针包含一个能产生一种可变信号的可检测的标记，其中所述信号反映了该探针的双链部分是否存在。此外，至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记。所述探针上的标记可以是一种荧光基团，或者所述探针可以包含一对相互作用的标记，例如荧光基团和/或非荧光的染料。此类相互作用的标记的一个例子是一对荧光基团-淬灭剂对。所述探针上的标记可以位于任何位置，只要其能与其他标记或者其他实体如G核苷酸相互作用。在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含一个第一标记并且所述第二寡核苷酸包含第二标记。优选地，所述第一标记是一种荧光基团而所述第二标记是一种淬灭剂，或者反之亦可。
在另一些实施方案中，所述探针包含两种标记，此两种标记为一个FRET对。优选地，一种标记在第一寡核苷酸上而第二种标记在第二寡核苷酸上。此外，所述第一和第二寡核苷酸都可以包含多个标记实体。例如，所述第一和第二寡核苷酸都可以既包含一个荧光基团又包含一个淬灭剂。典型地，所述荧光基因和所述淬灭剂与所述寡核苷酸相联，并且联接方式满足当所述第一寡核苷酸与一段未标记的模板序列(例如一条目标核酸)结合时，该荧光基团与该淬灭剂分离。或者，所述荧光基因与所述淬灭剂与所述寡核苷酸相联，并且联接方式满足当所述第一寡核苷酸与一段未标记的模板序列(例如一条目标核酸)结合时，该荧光基团与该淬灭剂被拉至紧邻位置，从而该荧光基团被淬灭。本文所用术语“荧光基团”是指在一定范围的激发波长下吸收光能，并以一个不同范围的波长发射光能的基团。荧光标记的例子包括但不限于Alexa Fluor染料(Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633，Alexa Fluor 660 和 Alexa Fluor 680)，AMCA，AMCA-S，BODIPY 染料 (BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 530/550， BODIPY 558/568， BODIPY 564/570，BODIPY 576/589，BODIPY 581/591，BODIPY 630/650，BODIPY 650/665), 羧基罗丹明 6G，羧基-X-罗丹明(ROX)，Cascade 蓝(Cascade Blue)，Cascade 黄 (Cascade Yellow)，花青染料(Cy3，Cy5，Cy3. 5，Cy5. 5)，磺酰，Dapoxyl，二烷基氨基香豆素 (Dialkylaminocoumarin),4‘ ,5' -二氯-2' ,7' - 二甲氧基-荧光素，DM-NERF，伊红， 赤藓红，荧光素，FAM，羟基香豆素，IRDye (IRD 40，IRD 700，IRD 800)，J0E，丽丝胺罗丹明 B，Marina Blue，甲氧基香豆素，萘荧光素(Naphthofluorescein)，俄勒冈绿488，俄勒冈绿 500，俄勒冈绿514，太平洋蓝(Pacific Blue), PyMPO，芘，罗丹明6G，罗丹明绿，罗丹明红， 对甲氨基酚绿(Rhodol Green) 2' ,4' ,5' ,7'-四溴砜-荧光素 O' ,4' ,5' ,7' -Tet ra-bromosulfone-fluorescein)，四甲基罗丹明(TMR)，羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，德克萨斯红和德克萨斯红-χ。本文所用术语“淬灭剂”包括任何当与一种激发态的荧光标记紧邻时，能够吸收该荧光标记的能量，并能令此能量散逸的基团。淬灭剂可以是一种荧光的淬灭剂或一种非荧光的淬灭剂，后者也被称为暗淬灭剂。以上所列的荧光基团当被拉拢至另一荧光基团相邻位置时能起到淬灭剂的作用，其中所发生的淬灭可以是FRET淬灭或者接触淬灭。优选使用不发射任何可见光的暗淬灭剂。暗淬灭剂的例子包括但不限于DABCYL(4-G' -二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸)琥珀酰亚胺酯，二芳基罗丹明羧酸(diarylrhodamine carboxylic acid)，琥珀酰亚胺酯(QSY-7)，4'，5' _ 二硝基荧光素羧酸，琥珀酰亚胺酯OlSY-33)， quencherl，“黑洞淬灭剂”(BHQ-1，BHQ_2和BHQ-3)，核苷酸类似物，鸟苷酸残基，纳米粒子， 以及金颗粒。上述相互作用的标记对可以形成FRET关系或者接触淬灭关系。优选地，为了有效的接触淬灭，荧光标记和淬灭剂之间的距离是O到10个核苷酸；更优选地，荧光标记和淬灭剂之间的距离是O到5个核苷酸；更优选地，荧光标记和淬灭剂之间的距离是O到2个核苷酸.淬灭剂优选为非荧光体。淬灭剂可以是一种纳米粒子。所述纳米粒子可以是一种金纳米粒子。上述淬灭剂还可能是鸟苷酸残基或多聚鸟苷酸残基。每种探针上的标记或多个标记的组合能够产生一种每种探针特征性的可检测的信号，此信号可表示第一和第二寡聚核苷酸的双链区存在还是不存在。标记的功能是显示探针的第一寡聚核苷酸是与第二寡聚核苷酸结合还是与靶核苷酸结合，更能显示是否第二寡聚核苷酸结合。至少一种标记与所述探针或其第一寡核苷酸，或者与该探针的第二寡核苷酸相联。当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸结合时，该标记令荧光发射增强或者减弱。优选地，所述探针包含一种第一标记和一种第二标记，其中至少一种标记能够产生一种可检测的信号，并且其中所述信号的强度受这两种标记的接近程度的影响。在本发明的一些实施方案中，所述第一标记与所述双链部分的一条链相联，并且所述第二标记与所述探针的该双链部分的另一条链相联，如此当该探针的内部双链体形成时，所述第一标记和第二标记位置紧邻。在另一些实施方案中，所述第一标记与所述第一寡核苷酸相联，并且所述第二标记与所述第二寡核苷酸相联，如此当所述探针的内部双链部分形成时，所述第一标记和第二标记位置紧邻。在本发明的一些实施方案中，所述第一寡核苷酸不包含标记。在另一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含一种单一标记，当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，该标记能改变其荧光发射。在一些实施方案中，所述第一标记与所述第一寡核苷酸相联，并且所述第二标记与所述第二寡核苷酸相联，如此当所述探针的内部双链体形成时，所述第一标记和第二标记位置紧邻。优选地，所述第一标记与所述第一寡核苷酸的第二区域相联，并且所述第二标记与所述第二寡核苷酸上与所述第一寡核苷酸的第二区域互补的区域相联，如此当所述探针的内部双链体形成时，所述第一和第二标记被拉拢至位置紧邻。这样的实施方案的例子显示于图4A、4B和4C中。在本发明的一些方面中，所述探针的第一寡核苷酸不包含标记，而该探针的第二寡核苷酸包含至少一种、优选两种标记。在该方面的一个实施方案中，所述第二寡核苷酸包含一个第一标记和一个第二标记。所述第一标记在所述第二寡核苷酸的一个末端或接近末端处与之相联，并且所述第二标记在该第二寡核苷酸的另一个末端或接近该末端处与之相联，由此当该第二寡核苷酸不与第一寡核苷酸杂交时，该第二寡核苷酸处于将该第一标记和第二标记拉拢至紧邻位置的一种无规线团结构或一种茎-环结构。当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时， 上述两种标记保持彼此远离。这样的实施方案的例子显示于图4D、4E和4F中。在先技术中已知，当一种双标记的寡核苷酸处于单链状态并且在一定的许可温度下时，其可以形成一种无规线团结构。这样的线性寡核苷酸探针在溶液中的行为类似一种无规线团它的两个末端会偶然地互相接近，导致能量转移的一种可测量的改变。但是，当这种探针与其模板结合时，该探针-模板杂交体迫使该探针的两个末端分开，破坏了这两个末端部分之间的相互作用，从而导致荧光发射的一种改变。双标记的寡核苷酸也可以形成一种称为分子信标的茎-环结构。分子信标探针是能形成一种发夹结构的单链寡核苷酸探针，在所述发夹结构中，一种荧光基团和一种淬灭剂通常被置于该寡核苷酸相对的两端。在所述探针末端处的短的互补序列允许一种分子内茎的形成，从而令所述荧光基团与所述淬灭剂能处于紧邻位置。上述分子信标的环部分与所感兴趣的一种目标核酸互补。这种探针与其目标核酸之间的结合形成了一种杂交体，令所述茎分开。这将导致一种构象变化，构象变化使所述荧光基团和所述淬灭剂彼此分开并导致更强的荧光信号(Tyagi S.和Kramer F. R.，Nature Biotechnology (自然生物技术)，Vol. 14，pages 303-308(1996) ；Tyagi 等人，Nature Biotechnology (自然生物技术)，Vol. 16，pages 49-53(1998) ；Piatek 等人，Nature Biotechnology (自然生物技术)，Vol. 16, pages 359-363 (1998) ；Marras S.等人，Genetic Analysis :Biomolecular Engineering (遗传分析-生物分子工程)，Vol. 14，pages 151-156(1999) ；Tpp I.等人， BioiTechniques (生物技术)，Vol 28，pages 732-738 (2000)) 在本发明中，具有双链部分的线性探针的一种第二寡核苷酸，是一种探针的一个双链部分的一部分，其中所述第二寡核苷酸可以是一种类似分子信标的寡核苷酸。这种探针与其他探针的不同之处在于，所述第二寡核苷酸可不与目标序列杂交，而与所述第一寡核苷酸的第二区域杂交，其中所述第二区域可与目标序列无关。所述第二寡核苷酸可以是能与目标序列杂交的，但它被设计为在实际的扩增反应中不能与目标序列杂交。所述第二寡核苷酸可以包含与一种目标序列不能牢固地结合的序列。在扩增反应的延伸和退火步骤，温度可能会太高，使得所述第二寡核苷酸不能与目标序列杂交。而在通常于延伸步骤之后进行的信号收集步骤，温度可能会较低，但由于待扩增的目标序列可能因扩增引物业已进行的延伸而变成双链，所述目标序列可能会不能供所述第二寡核苷酸杂交。因此，在信号收集步骤，所述第二寡核苷酸可能仅能与所述探针未被消耗的第一寡核苷酸杂交。另一方面，所述第一寡核苷酸不含标记而所述第二寡核苷酸包含一种标记。当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交从而形成所述探针的双链部分时，所述标记的可检测的信号发射，相对于该标记在单链形式的所述第二寡核苷酸中的发射发生改变。这可以是由于所述标记被拉至与所述第一寡核苷酸中的一个或多个核苷酸紧邻的位置，或者由于所述标记被拉离了所述第二寡核苷酸中的一个或多个核苷酸。在先技术中已知，当一种荧光染料与特定的核苷酸，例如一个G核苷酸位置紧邻时，其荧光发射可发生改变。在另一个实施方案中，所述探针的第一寡核苷酸不含标记，并且所述探针包含两种能与所述第一寡核苷酸的第二区域上的不同部分相邻地或充分相邻地杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸之一与一种第一标记相联，而另一种第二寡核苷酸与一种第二标记相联，如此当上述两种第二寡核苷酸与上述第一寡核苷酸杂交时，这两种标记被拉至紧邻位置并且一种标记影响来自另一种标记的信号。所述紧邻位置可以导致如FRET或接触淬灭的关系。与上述第一寡核苷酸杂交的上述两种第二寡核苷酸是所述探针的部分。上述两种标记的第二寡核苷酸被设计为不与扩增的目标序列杂交，而与未被消耗的第一寡核苷酸杂交。图41和4J中给出了这样的实施方案的例子。在其他一些实施方案中，一种探针的第一和第二寡核苷酸通过包含核苷酸或一种非核苷酸的化学部分的一种连接部分相连，从而允许所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成一种茎-环结构，其中所述第一和第二寡核苷酸分别被标记，如此当所述探针形成一种内部茎-环结构时，上述标记被拉至紧邻位置并且一种标记影响来自另一种标记的信号。所述连接部分可以是如分子式为(CH2)n的一个简单部分，或者是功能与之相当的一种连接(η优选地为1至100或1至50)。优选地，所述连接部分为与所述第一和第二寡核苷酸相连的一种寡核苷酸。优选地，上述环与所述目标序列互补。所述扩增反应混合物中的至少两种探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的一种不同的可检测的标记。在多重反应中，两种或多种探针被用于检测两种或多种目标核酸的存在。但是，这并不一定意味着，每种不同的探针需要有不同的可区分的标记。每种探针可以具有依赖于其内部双链部分的特征的一种特有的熔解图谱。因此，若两种或多种探针具有可区分的熔解特性，则可将相同的标记用于这些探针。也就是说，用相同的标记或其发射光谱不可区分的标记标记的不同探针，必须具有不同的熔解特性，优选具有不同的熔解温度(Tm)。上述不同的熔解特性将允许各种探针在步骤(c)中被鉴定和/或定量。本文所用术语“熔解特性”包括探针的熔解图谱(优选通过测定来自该探针上的标记的信号作为温度的函数进行测量)和/或探针的熔解温度(Tm)。当称探针的熔解特性是“不同的”时，应当明白这种不同之处系会在相同或对照条件下测得。在本发明的一些实施方案中，两种或多种探针被相同的可检测的标记标记。例如， 第一寡聚核苷酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30或者更多种的不同的探针可以都被相同的标记标记，或第二寡聚核苷酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30或者更多种的不同的探针可以都被相同的标记标记。在步骤(b)中，在所述样品/扩增(或样品/杂交)反应混合物中进行扩增反应， 其中，当一种目标核酸存在时，与该目标核酸的部分充分互补的探针(第一寡聚核苷酸)在所述扩增反应过程中被消耗。所述扩增反应可以在本领域已知的条件下进行，如此与所述目标核酸的部分充分互补的探针被消耗。优选地，所述扩增包括至少一个变性步骤、至少一个退火步骤和至少一个引物延
伸步骤。更优选地，所述扩增是一种包括两个或更多的变性、退火和引物延伸步骤的热循环扩增。优选的扩增反应包括PCR，SDA, NASBA, LAMP，3SR，ICAN, TMA，解旋酶依赖的等温 DNA扩增以及类似方法。PCR为一种优选的扩增方法。若所述扩增为PCR，则所述条件包括将反应进行热循环。当一种目标核酸在所述样品中存在时，至少一些与该目标核酸的部分互补的探针 (第一寡聚核苷酸)将在适当的反应条件下与各自的互补部分杂交。所述第一寡核苷酸将因此被消耗。所述探针的消耗通过其与目标序列的杂交而实现，杂交可继以在扩增步骤中所述探针向扩增产物中的掺入或/和所述探针的降解。也就是说，所述探针第一寡核苷酸在被消耗后不再能重新构成其之前形成了一种部分的那样的探针。在一个扩增反应中，当探针具有两条链时，本发明的探针可以通过将所述第一和第二寡核苷酸以任意比例，例如，所述第二寡核苷酸对所述第一寡核苷酸的比例优选为大于1，或者可以为大于0. 1且小于1，添加到所述反应中而构成。如此，所述第一和第二寡核苷酸可以独立地加入加入到扩增反应混合物中。依赖于检测方法的类型和实际使用的标记的类型，当所述探针或所述探针的第一寡核苷酸被消耗时，来自所述探针的信号(例如荧光发射)可以增强或减弱。参阅图4中所示的实施方案。在图4A至4C中，由于与荧光基团相联的第一寡核苷酸被消耗，并因此允许该荧光基团发射其信号，所述探针的消耗导致荧光的增强。相反地，在图4D至4F中，所述第一寡核苷酸的消耗释放了双重末端标记的第二寡核苷酸，并因此允许荧光基团与淬灭剂彼此并置，从而导致来自所述荧光基团的信号的降低。在一个实施方案中，所述探针第一寡核苷酸可被延伸，并且作为正向或反向引物起作用。所述探针的第一寡核苷酸可以作为扩增引物之一，能够被掺入到扩增产物之中， 并因此被消耗(参见图6)。在一次PCR中，所述探针的第一寡核苷酸与针对反向链的另一扩增引物作为引物对共同进行扩增。在信号收集步骤，或者测量所述探针的熔解图谱的步骤，该探针的已掺入到扩增产物中的第一寡核苷酸不再能参与形成该探针内部双链部分的双链体。所述探针未被消耗的、能够参与形成该探针双链体的第一寡核苷酸的量，可以被测定，并且此信号可以转换为被消耗了的第一寡核苷酸的量，从而测定出哪种或者有多少目标序列存在于一份样品中。当所述第一寡核苷酸作为一种引物起作用时，所述第二寡核苷酸优选不作为一种引物起作用。在本发明的另一个实施方案中，所述单链探针或具有两条链的探针的第一寡核苷酸在扩增过程中被降解。例如，所述第一寡核苷酸可以包括对一种消化剂敏感的核苷酸或非核苷酸的化学部分。一个进一步的例子中，当与目标序列杂交时，所述探针或所述第一寡核苷酸能被上述消化剂降解。例如，所述探针或所述第一寡核苷酸可以包含RNA核苷酸。当所述第一寡核苷酸与目标序列杂交时，它能被具有核酸核酸酶H活性的酶降解。可以设计为当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交以形成所述探针的双链部分时，所述第一寡核苷酸不能被降解。所述第一寡核苷酸也可以被一种外切核酸酶降解。例如，所述第一寡核苷酸的3'核苷酸可以被一种聚合酶的3'外切核酸酶活性降解。所述第一寡核苷酸还可以被一种内切核酸酶降解，例如在与一种目标核酸杂交时被一种限制酶降解。优选地，所述单链探针或具有两条链的探针的第一寡核苷酸被一种DNA聚合酶， 例如Taq DNA聚合酶的5'外切核酸酶活性降解。在该实施方案中，所述探针的第一寡核苷酸可以是3'端被封闭的，并且因此而不能被延伸。在PCR扩增中，所述第一寡核苷酸与目标序列上两边分别为正向和反向引物的区域杂交，并且能被一种核酸酶活性，例如Taq聚合酶的5'外切核酸酶活性降解(参见图8)。或者，所述探针的第一寡核苷酸3'端是未被封闭的，并且因此而能被延伸。所述第一寡核苷酸与目标序列杂交，并且能被一种聚合酶延伸。所述第一寡核苷酸上游的一种扩增引物也得到延伸。在PCR扩增中，当上述扩增引物延伸至与所述第一寡核苷酸的延伸链相遇时，所述第一寡核苷酸的整条延伸链能被一种核酸酶活性，例如Taq聚合酶的5'外切核酸酶活性降解(参见图7)。在本发明的另一个实施方案中，所述探针的消耗可以仅仅是该探针与目标序列的杂交，杂交的探针由此不再能形成所述探针的双链结构(参见图幻。优选地，扩增被设计为产生一种单链的产物，如此所述探针的第一寡核苷酸能在退火步骤期间和/或延伸步骤之后与目标序列杂交。用以产生单链产物的方法可以是不对称PCR，或者在PCDR中描述的一种方法(PCT/GB2007/00379;3)。上述单链的扩增链可以与所述第一寡核苷酸形成一种牢固的杂交体；所述第一寡核苷酸因此可以视作已被消耗，因为其难以再供形成所述探针的内部杂交体。在本发明的另一个实施方案中，所述探针的第一寡核苷酸可以作为一种巢式内侧扩增引物起作用。所述第一寡核苷酸与一种外侧扩增引物与目标核酸的同一链退火。与目标核酸杂交后，所述外侧扩增引物和所述第一寡核苷酸可以都得到延伸。如果DNA聚合酶包含一种置换活性，则所述第一寡核苷酸的延伸链可在所述外侧引物的延伸过程中被置换。如果DNA聚合酶包含一种5'外切核酸酶活性，则所述第一寡核苷酸的延伸链可在所述外侧引物的延伸过程中被降解。在一些实施方案中，扩增条件可以被设计为令所述探针在所述扩增的一些阶段即使当目标核酸存在时也不被消耗，而在另一些阶段被消耗。例如，若所述扩增为PCR，在扩增的一些热循环中，所述探针可因退火和延伸温度设置得太高，令所述探针不能结合而不被消耗。扩增的热循环条件可以被设计为令所述探针可以在扩增的一些阶段或者最后一个循环被消耗。例如，在热循环之后，将PCR管置于一个比所述热循环的退火和延伸温度都更低的温度孵育。这个较低的温度允许所述探针与目标核酸杂交，导致杂交的探针被延伸或降解。步骤(b)可以进一步包括步骤(bl)在多个测量温度(MTs)，逐循环地测量荧光发射(FEs)。所述测量温度(MTs)是指逐循环地对所述探针上的标记进行荧光发射读数以测定一种探针的荧光发射量的温度。优选地，在一个反应中的每一循环，在反应混合物经一种被所述探针上的一种标记吸收的波长的光照射或激发之后，获得、检测和/或记录该标记的荧光发射。术语“逐循环”是指在每一循环中测量。在一个循环中，在一个测量温度进行荧光发射读数以计算剩余探针的荧光发射量。荧光发射可以连续地或间歇地被检测、记录或获得。在一个连续记录过程中，在例如一个PCR反应的每一循环，所述探针的荧光发射例如每50ms、每100ms、每200ms或每Is被监测和记录一次。由此可以形成时间、温度和荧光发射的一个立体图。在任意一个给定的循环，在对应于一个所期望的MT的一个时间点进行荧光发射读数，以测定该循环中所述探针的荧光发射量。在一个间歇记录过程中，在每一循环中，仅当反应温度达到一个所期望的MT时进行荧光发射读数。对于通过掺入至扩增产物或被一种消化剂降解而被消耗的探针，所述逐循环的荧光发射(FE)优选在每一循环的延伸步骤完成之后进行测定。对于通过与目标序列杂交而被消耗的探针，所述逐循环的荧光发射(FE)可以在每一循环的延伸步骤完成之前进行测定。本文所述的荧光发射(FE)是指经基线校正的荧光(dR)。通常，对于每一孔(反应)和每一光路，利用一种线性最小均方算法(或者其他类似算法)在一定范围的循环对原始荧光数据进行拟合以得到一条基线。对每一循环，计算上述基线函数的值并将其从原始荧光中扣除，从而得到经基线校正的荧光(dR)。荧光强度数据(扩增图)可以描述为一个二元函数一个线性分量或者说背景，和一个包含有关信息的指数分量。荧光中的线性部分可以被算出并扣除，以分离出上述指数分量。对于每一扩增图(即每一反应和每一标记)，进行的处理由三个步骤组成1.鉴定出所有荧光组分均为严格线性(荧光无指数增长)的循环的范围。2.利用以上确定的循环过程中的荧光强度值，将数据拟合为一条直线(一个预测上述线性分量在整个反应中的贡献的函数)。3.在每一循环过程中，扣除上述预测的背景荧光强度。如此得到的曲线对应于因 DNA扩增导致的荧光变化。当扩增反应混合物包含“η”种用于对“η”种目标核酸进行多重检测的探针时，第一种探针的熔解温度为Tml，第二种探针的熔解温度为Tm2，第三种探针的熔解温度为Tm3， 第k种探针的熔解温度为Tmk，并且第η种探针的熔解温度为1>，其中TmI > Tm2 > Tm3 >... Tmk > 1>，其中η和k为正整数，1彡k彡n，并且η彡2。在一个特定的温度或一系列的温度，一种探针的双链形式占探针总量的百分比， 可以通过实验进行测定，或者进行预测，其中所述预测可以通过计算机程序进行。由于一种探针熔解时的荧光发射的一阶负导数对温度作图会得到一条正态分布曲线，统计学领域的普通技术人员可以容易地定义一个ΜΤ，一种给定探针总量的一个百分比的该探针在该MT 处于双链形式或单链(即分离的)形式。据此，一个测量温度为，例如不多于20%的一种探针处于单链形式的一个温度。可以制作出一个列出每种探针在每一温度其双链(ds)和单链(s)形式的百分比的表。在一个测量温度Ma可以获得一个第一荧光发射FEa，其中在此Ma多于50%的第一探针处于双链形式；在一个测量温度肌13可以获得第二荧光发射FEb，其中在Mffll3多于50 %的第二探针处于双链形式；在一个测量温度Ml可以获得第k荧光发射FEk，其中在此MTk多于50%的第k种探针处于双链形式；在一个测量温度MT (n-1)可以获得第n_l荧光发射FE(n-l)，其中在此MT(n-l)多于50%的第n_l种探针处于双链形式；在一个测量温度Mn可以获得第η荧光发射FEn，其中在此Mn多于50%的第η种探针处于双链形式；可供选择地，在一个测量温度MTO可以获得一个荧光发射FE0，其中在此MTO不多于10%的第一探针处于双链形式。尽管以上提到的50%是处于双链形式的探针的一个优选的量，应当认为任何百分比都可使用，例如40 %、55%、70 %或80%。优选地，在一个测量温度MTk逐循环地获得荧光发射FEk的步骤，其中在此ffll不多于30%的第(k-Ι)种探针处于其内部双链形式。更优选地，在一个测量温度Ml逐循环地获得荧光发射FEk的步骤，其中在此ffll不多于20% 的第(k-Ι)种探针处于其内部双链形式。步骤(b)可进一步包括步骤( )对每种探针，逐循环地测定来自被消耗的探针的荧光发射的实际消耗量，其中第k种探针的荧光发射的实际消耗量记为ACAk。在一个特定的测量温度(MTa)，此温度一种探针有一定百分比(dSka)%处于ds (双链)形式，第一探针在此测量温度MTa对荧光发射FE的贡献为(dsla) % * (ACA1)，第二探针的贡献为(ds2a) % * (ACA2),第k种探针的贡献为(dska) (ACAk)。例如，在60°C，70 %的探针1处于ds形式；在50°C，80%处于ds形式。所述探针1在60°C对FE的贡献为701^MACA1)；所述探针 1在50°C对FE的贡献为80% * (ACA1)。若存在多种探针，则FE为被消耗的所有探针所贡献的总量。实际消耗量(ACA)可以用下列公式计算在温度a，总荧光发射为
FEa = (ACAl) * (dsla) % + (ACA2) * (ds2a) % + (ACA3) * (ds3a) % ·.. + (ACAn) *(dsna)%在温度b，总荧光发射为FEb = (ACAl) *(dslb) % + (ACA2) * (ds2b) % + (ACA3) * (ds3b) % … + (ACAn) *(dsna)%在温度c，总荧光发射为FEc = (ACAl) *(dslc) % + (ACA2) * (ds2c) % + (ACA3) * (ds3c) % … + (ACAn) *(dsna)%依此类推。单独的ACA可以从以上公式算出。“*”表示“乘以”。优选地，每种探针的实际消耗量通过一种运行上述计算的计算机程序获得。或者， 上述计算可以人工进行。例如，在一个扩增反应中，有针对三种目标序列的三种探针。在65°C时，5 %的第一探针处于双链形式，0%的第二探针和0%的第三探针处于双链形式。在60°C时，60%的第一探针处于双链形式，5%的第二探针处于双链形式，0%的第三探针处于双链形式。在55°C 时，90 %的第一探针处于双链形式，55 %的第二探针处于双链形式，5 %的第三探针处于双链形式。在45°C时，多于95%的所有各种探针处于双链形式。在60°C收集第一荧光发射 FE60，在55°C收集第二荧光发射FE55，在45°C收集第三荧光发射FE45。可供选择地，在收集所述第一荧光发射之前，在65°C或更高的温度收集一个荧光发射，是为FE65。由单种探针的实际消耗量ACA贡献的FE用ds% * (ACA)进行计算。参见下表
权利要求
1.一种用于针对一个或更多个靶核酸检验样品的方法，所述方法包括(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包括(i) 一对或更多对正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一个或更多个靶核酸存在于所述样品中，所述引物对能够扩增所述一个或更多个靶核酸， ( )两个或更多个探针，其中每个探针包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号是该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在的特征，并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的；(b)在扩增条件下，在所述样品/反应混合物上进行扩增反应，其中，当靶核酸存在时， 与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的所述第一寡核苷酸与所述靶核酸杂交，因此被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能够参与形成所述探针的双链部分(双链体)； 以及(c)通过检测来自在未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，其中所述熔解图谱提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品中的指征， 其中所述探针的所述至少两个中的第一探针具有依据所述第一探针的双链部分的熔解温度TmI，其中所述探针的所述至少两个中的第二探针具有依据所述第二探针的双链部分的熔解温度Tm2，其中 TmI > Tm2，其中所述相同的标记物被独立地附接到所述第一和第二探针， 其中在TmI和/或Tm2的任一熔解峰的降低提供所述一个或多个第一和/或第二探针的消耗的指征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述熔解图谱是在反应/扩增发生前测量(扩增前熔解图谱)，和/或是在反应/扩增完成后测量(扩增后熔解图谱)，和/或是在每个循环或者选择的循环的反应/扩增期间测量(扩增中熔解图谱)，其中所述方法额外地包括步骤(d)， (i)比较至少两个在(c)中获得的熔解图谱，和/或 ( )将在步骤(c)中获得的熔解图谱与相同探针的之前获得的溶解曲线比较，或者与同时在对照反应中平行获得的相同探针的熔解图谱比较，或者与相同探针的理论熔解图谱比较，其中所述熔解图谱的改变提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品/反应混合物中的指征，其中所述扩增前熔解图谱是在反应/扩增开始之前在相同的反应容器中被测量的，或者是在单独的反应容器中被测量的，在所述单独的反应容器中由于反应混合物缺乏所述反应/扩增所必须的一种或更多种成分而无扩增发生，其中在步骤(d)中，将所述扩增后或扩增中熔解图谱与所述探针的双链体的所述扩增前熔解图谱比较，以确定特定探针是否被消耗，作为相应靶存在于所述样品中的指征。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种可检测的标记物是荧光标记物，其中步骤(b)还包括逐循环在各个测量温度(MT)获得荧光发射(FE)的步骤(bl)，其中所述荧光发射(FE)是基线校正的荧光(dR)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中当所述扩增反应混合物包括针对“η”个靶核酸的多重检测的“η”个探针时，其中第一探针具有熔解温度TmI，第二探针具有熔解温度Tm2，第三探针具有熔解温度Tm3，第η探针具有熔解温度Tmn，其中TmI > Τω2 > Τω3···> 1>，每个探针在特定温度或不同温度的双链形式的百分比是以实验方法确定的，或者是通过计算机程序理论上计算出的，其中第一荧光发射Ffe是在测量温度Ma获得的，在所述测量温度ffl^a， 第一探针的多于50%是双链体形式，第二荧光发射FEb是在测量温度Mb获得的，在所述测量温度Mb，第二探针的多于50%是双链体形式，第n-1荧光发射FE(n-l)是在测量温度 MT(n-l)获得的，在所述测量温度MT(n-1)，第(n_l)探针的多于50%是双链体形式，第η荧光发射FEn是在测量温度Mn获得的，在所述测量温度Μη，第η探针的多于80%是双链体形式，以及可选地，荧光发射FEO是在测量温度MTO获得的，在所述测量温度ΜΤ0，第一探针的不多于10%是双链体形式，其中η是正整数并且η≥2。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述步骤(b)还包括逐循环确定针对每个探针的荧光发射的实际消耗量(ACA)的步骤0^2)，其中第k探针的荧光发射的实际消耗量以ACAk 描述，其中所述第k探针在特定测量温度(MTa)具有百分比为(dska)%的ds (双链)形式， 在该测量温度Ma由所述第一探针贡献的所述荧光发射Ffe将是(dsla) (ACA1)，由所述第二探针贡献的将是(ds2a) % * (ACA2)，由所述第k探针贡献的将是(dska) % * (ACAk)，由所述第η探针贡献的将是(dsna) % * (ACAn)，其中实际消耗量(ACA)的计算使用以下公式在测量温度Ma，总荧光发射将是FEa = (ACAl)*(dsla) % + (ACA2)*(ds2a) % + (ACA3)*(ds3a) % — + (ACAn)*(dsna) %在测量温度Mb，总荧光发射将是FEb = (ACAl)*(dslb) % + (ACA2)*(ds2b) % + (ACA3)*(ds3b) % — + (ACAn)*(dsna) %在测量温度MTc，总荧光发射将是FEc = (ACAl)*(dslc) % + (ACA2)*(ds2c) % + (ACA3)*(ds3c) %…+ (ACAn)*(dsna) %其余类推，其中针对每个探针的所述ACA可以从以上公式计算，其中“*”表示“乘以”， “k”是正整数，1≤k≤n，并且“η”是探针的数目。
6.根据权利要求5所述的方法，其中每个探针的荧光发射的所述实际消耗量是通过计算机程序获得的，所述计算机程序在每个循环在每个测量温度进行计算。
7.一种用于针对一个或更多个靶核酸检验样品的方法，所述方法包括(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与反应混合物接触，所述反应混合物包括 两个或更多个探针，其中每个探针包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号是该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在的特征，并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征(熔解温度，Tffl)是不同的，并且所述熔解特征在熔解图谱分析中是可区分的；(b)在所述样品/反应混合物上进行所述反应，其中所述反应是在延伸条件下的引物延伸反应，其中，当靶核酸存在时，相对应的是可延伸引物的探针的所述第一寡核苷酸与靶核酸杂交，因此在所述引物延伸反应期间被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能够参与形成所述探针的双链部分(双链体)；以及(c)通过检测来自未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，其中所述熔解图谱提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品中的指征。
8.一种用于针对一个或更多个靶核酸检验样品的方法，所述方法包括(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与杂交反应混合物接触，所述杂交反应混合物包括两个或更多个探针，其中每个探针包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号是该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在的特征，并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的，并且所述熔解特征在熔解图谱分析中是可区分的；(b)在杂交条件下，在所述样品/反应混合物上进行所述杂交反应，其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的第一寡核苷酸与靶核酸杂交，因此在所述反应期间被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能够参与形成所述探针的双链部分(双链体)；以及(C)通过检测来自未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，其中所述熔解图谱提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品中的指征。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增是等温扩增或热循环扩增反应，所述反应包括两次或更多次的变性、退火和引物延伸步骤。
10.一种用于监控至少两个靶核酸的PCR扩增的方法，所述方法包括(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包括(i) 一对或更多对正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一个或更多个靶核酸存在于所述样品中，所述引物对能够扩增所述一个或更多个靶核酸， ( )两个或更多个探针，其中每个探针包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中每个探针包括荧光标记物或者荧光标记物/淬灭剂对，所述荧光标记物或者荧光标记物/淬灭剂对能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在，并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的；(b)进行包括所述样品/扩增反应混合物的热循环的扩增反应其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的所述第一寡核苷酸在所述扩增反应中被消耗；并且其中所述步骤(b)还包括逐循环在各个测量温度(MT)获得荧光发射(FE)的步骤 (bl)，其中所述荧光发射(FE)是基线校正的荧光(dR)，其中当所述扩增反应混合物包括针对“η”个靶核酸的多重检测的“η”个探针时，其中第一探针具有熔解温度TmI，第二探针具有熔解温度Tm2，第三探针具有熔解温度Tm3，第η探针具有熔解温度Tmn，其中TmI > Τω2 > Τ;>··> Tmn，其中每个探针在特定温度或不同温度的双链形式的百分比是以实验方法确定的，或者是通过计算机程序理论上计算出的，其中第一荧光发射FEa是在测量温度Ma获得的，在所述测量温度ffl^a，第一探针的多于50%是双链体形式，第二荧光发射FEb是在测量温度1013获得的，在所述测量温度Mb，第二探针的多于50%是双链体形式，第n-1荧光发射FE(n-l)是在测量温度MT(n_l)获得的，在所述测量温度MT(n-l)，第(n-1)探针的多于50%是双链体形式，第η荧光发射FEn是在测量温度 MTn获得的，在所述测量温度ΜΤη，第η探针的多于80%是双链体形式，以及可选地，荧光发射FEO是在测量温度MTO获得的，在所述测量温度ΜΤ0，第一探针的不多于10%是双链体形式，其中η是正整数并且η彡2，其中所述步骤(b)还包括逐循环确定针对每个探针的荧光发射的实际消耗量(ACA) 的步骤( )，其中第k探针的荧光发射的所述实际消耗量以ACAk描述，其中所述第k探针在特定测量温度(MTa)具有百分比为(dSka)%的ds (双链)形式，在该测量温度Ma由所述第k探针贡献的所述荧光发射FEa将是(dska) % * (ACAk)，由所述第η探针贡献的将是 (dsna) % *(ACAn)，其中实际消耗量(ACA)的计算使用以下公式在测量温度Ma，总荧光发射将是FEa = (ACAl)*(dsla) % + (ACA2)*(ds2a) % + (ACA3)*(ds3a) %…+ (ACAn)*(dsna) %在测量温度Mb，总荧光发射将是FEb = (ACAl)*(dslb) % + (ACA2)*(ds2b) % + (ACA3)*(ds3b) %…+ (ACAn)*(dsna) %在测量温度MTc，总荧光发射将是FEc = (ACAl)*(dslc) % + (ACA2)*(ds2c) % + (ACA3)*(ds3c) %…+ (ACAn)*(dsna) %其余类推，其中针对每个探针的所述ACA可以从以上公式计算，其中“*”表示“乘以”， “k”是正整数，1彡k彡n，并且“η”是探针的数目，其中每个探针的荧光发射的所述实际消耗量是通过计算机程序获得，所述计算机程序在每个循环在每个测量温度进行计算，并且其中每个探针的荧光发射的所述实际消耗量与所述靶核酸的扩增程度相关，所述靶核酸与该探针结合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中探针的所述消耗是通过所述探针的所述第一寡核苷酸与所述靶序列的杂交来实现的，接下来是所述探针的所述第一寡核苷酸整合入扩增产物，其中当所述探针的所述第一寡核苷酸可以被整合入所述扩增产物时，所述第一寡核苷酸是可延伸的引物或者是所述正向/反向寡核苷酸引物对之一。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中探针的所述消耗是通过所述探针的所述第一寡核苷酸与所述靶序列的杂交来实现的，接下来是所述探针的第一和/或第二寡核苷酸的降解，其中当所述探针的所述第一寡核苷酸在所述反应期间被降解，所述反应混合物包括双链依赖的核酸酶活性。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述探针包括第一标记物和第二标记物，其中所述第一标记物是荧光基团，并且所述第二标记物是淬灭剂，反之亦然。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一标记物被附接至所述第一寡核苷酸， 并且所述第二标记物被附接至所述第二寡核苷酸，使得当所述探针的内部双链体形成时， 所述第一标记物和第二标记物是非常接近的。
15.根据权利要求13所述的方法，其中标记物在所述探针的一个寡核苷酸上，所述一个寡核苷酸或者是所述第一寡核苷酸，或者是所述第二寡核苷酸。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物， 并且所述探针的所述第二寡核苷酸包括至少一个、优选两个标记物，其中所述第二寡核苷酸包括第一标记物和第二标记物，所述第一标记物被附接在或靠近第二寡核苷酸的一端， 并且所述第二标记物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，从而当所述第二寡核苷酸不与所述第一寡核苷酸杂交时，所述第二寡核苷酸是无规卷曲或者茎环结构，所述结构使得所述第一标记物和第二标记物非常接近。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且所述第二寡核苷酸包括标记物，其中，当所述第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸以形成所述探针的所述双链部分时，所述标记物能够改变相对于单链形式的所述第二寡核苷酸的发射的信号发射。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物， 并且其中所述探针包括两个第二寡核苷酸，所述两个第二寡核苷酸能够邻近地或基本上邻近地杂交至所述第一寡核苷酸的所述第二区域的不同部位，其中所述第二寡核苷酸中的一个是与第一标记物附接的，并且另一个第二寡核苷酸是与第二标记物附接的，使得当所述两个第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸时，使得所述两个标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号。
19.根据权利要求13所述的方法，其中探针的所述第一和第二寡核苷酸通过包括核苷酸的连接部分或者非核苷酸的化学连接部分连接，允许所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成茎环结构，其中所述第一和第二寡核苷酸是分别用第一和第二标记物来标记，使得当所述探针形成内部茎环结构时，使得所述标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域基本上不重叠。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述第一区域与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上重叠，或者所述第二区域嵌入所述第一区域， 其中所述第一寡核苷酸与所述靶序列杂交的所述双链体的Tm比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交的所述双链体的Tm更高，使得如果靶存在，所述第一寡核苷酸与所述靶形成比所述第一 /第二寡核苷酸双链体更强的杂交体，并且因此在更高的温度熔解。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包括第三区域，所述第三区域与用于所述扩增反应的引物的序列等同或基本上等同。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中探针的所述第一和第二寡核苷酸两者均能够在扩增期间被消耗。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸在3’末端被封闭，并且其中所述第二寡核苷酸在3’末端被封闭。
25.一种用于针对靶核酸上一个或更多个变异的核苷酸的检验样品的方法，所述方法包括(a)将包括靶核酸的样品与反应混合物接触，所述反应混合物包括(i) 一对或更多对正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一个或更多个靶核酸存在于所述样品中，所述引物对能够扩增所述一个或更多个靶核酸，( )至少一对探针，其中所述一对探针中的第一探针包括与野生型靶核酸序列互补的序列，所述一对探针中的第二探针包括与含有变异核苷酸的靶核酸序列互补的序列，其中所述一对探针中的每个探针包括第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中所述一对探针中的每个探针包括相同的第二寡核苷酸，其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在，并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的；(b)在所述样品/反应混合物上进行扩增反应，其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的所述第一寡核苷酸在扩增期间被消耗，以及(C)通过检测来自在未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，其中所述熔解图谱提供在所述样品/扩增反应混合物中是否至少一个靶核酸已被扩增的指征。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述一对探针中所述相同的寡核苷酸包括通用碱基或与所述靶核酸序列中的所述变异的核苷酸对应的肌苷，其中所述通用碱基是3-硝基吡咯2’ -脱氧核苷、5-硝基吲哚、嘧啶类似物或嘌呤类似物。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中不同探针的多个第一寡核苷酸杂交至靶序列的同一链的不同位点。
28.一种用于与根据前述权利要求中任一项所述的方法一起使用的计算机软件产品， 当在合适的数据处理装置上运行时，用于比较探针的熔解图谱和/或定量多个靶的实时 PCR扩增，当被计算机处理器执行时，所述计算机软件产品使用以下公式进行实际消耗量 (ACA)的计算在测量温度Ma，总荧光发射将是FEa = (ACAl)*(dsla) % + (ACA2)*(ds2a) % + (ACA3)*(ds3a) % — + (ACAn)*(dsna) % 在测量温度Mb，总荧光发射将是FEb = (ACAl)*(dslb) % + (ACA2)*(ds2b) % + (ACA3)*(ds3b) % — + (ACAn)*(dsna) % 在测量温度MTc，总荧光发射将是FEc = (ACAl)*(dslc) % + (ACA2)*(ds2c) % + (ACA3)*(ds3c) %…+ (ACAn)*(dsna) % 其余类推，其中针对每个探针的所述ACA可以从以上公式计算，其中“*”表示“乘以”， “k”是正整数，1≤k≤n，并且“η”是探针的数目。
29.一种包括计算机内存的计算机系统，所述计算机内存具有存储在其中的计算机软件程序，其中所述计算机软件程序，当被处理器执行或在计算机中被执行时，实现根据权利要求1至27中任一所述的方法。
30.根据权利要求四所述的计算机系统，其中所述计算机软件程序实现包括以下步骤的方法，所述步骤是在扩增期间或在扩增终点计算每个探针的荧光发射的实际消耗量和/ 或确定熔解图谱的特征。
31.一种用于针对一个或更多个靶核酸的检测的试剂盒，所述试剂盒包括探针，所述探针包括15-150核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个4-150核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在， 并且其中(a)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述第二寡核苷酸包括第一标记物和第二标记物，其中所述第一标记物被附接在或靠近第二寡核苷酸的一端，并且所述第二标记物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，从而当所述第二寡核苷酸不与所述第一寡核苷酸杂交时，所述第二寡核苷酸是无规卷曲的或者是茎环结构，所述结构使得所述第一标记物和第二标记物非常接近，并且其中当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，所述两个标记物被保持远离彼此；或者(b)所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且所述第二寡核苷酸包括标记物，其中，当所述第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸以形成所述探针的所述双链部分时，相对于当为单链形式的所述第二寡核苷酸时所述标记物的所述发射，所述标记物能够改变所述标记物的可检测信号发射；或者(c)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述探针包括两个第二寡核苷酸，所述两个第二寡核苷酸能够邻近地或基本上邻近地杂交至所述第一寡核苷酸的所述第二区域的不同部分，其中所述第二寡核苷酸中的一个与第一标记物附接，并且另一个第二寡核苷酸与第二标记物链接，使得当所述两个第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸时，使得所述两个标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号。
32. 一种用于针对一个或更多个靶核酸的检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有两个或更多个探针的探针混合物，其中每个探针包括15-150核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及至少一个4-150核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在， 并且其中(a)所述第一标记物被附接至所述第一寡核苷酸的所述第二区域，并且所述第二标记物被附接到所述第二寡核苷酸的区域，所述第二寡核苷酸的所述区域与所述第一寡核苷酸的所述第二区域互补，使得当所述探针的内部双链体形成时，使得所述第一和第二标记物非常接近；或者(b)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述第二寡核苷酸包括第一标记物和第二标记物，其中所述第一标记物被附接在或者靠近第二寡核苷酸的一端，并且所述第二标记物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，从而当所述第二寡核苷酸不与所述第一寡核苷酸杂交时，所述第二寡核苷酸是无规卷曲的或者是茎环结构，所述结构使得所述第一标记物和第二标记物非常接近，并且其中当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，所述两个标记物被保持远离彼此；或者(C)所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且所述第二寡核苷酸包括标记物，其中当所述第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸以形成所述探针的所述双链部分时，相对于当为单链形式的所述第二寡核苷酸时所述标记物的所述发射，所述标记物能够改变所述标记物的可检测信号发射；或者(d)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述探针包括两个第二寡核苷酸，所述两个第二寡核苷酸能够邻近地或基本上邻近地杂交至所述第一寡核苷酸的所述第二区域的不同部位，其中所述第二寡核苷酸中的一个与第一标记物附接，并且另一个第二寡核苷酸与第二标记物附接的，使得当所述两个第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸时，使得所述两个标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号；或者(e)探针的所述第一和第二寡核苷酸通过包括核苷酸的连接部分或者非核苷酸的化学连接部分接合，允许所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成茎环结构，其中所述第一和第二寡核苷酸分别用第一和第二标记物标记，使得当所述探针形成内部茎环结构时，使得所述标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号；并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的试剂盒，其中至少一个标记物是荧光标记物。
34.根据权利要求31的(a)或(c)部分或权利要求32的(a)、(b)、(d)或(e)部分所述的试剂盒，其中所述探针包括第一标记物和第二标记物。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述第一标记物是荧光基团并且所述第二标记物是淬灭剂，或者反之亦然。
36.如权利要求31的(a)-(c)部分的任一所定义的探针，权利要求32的探针混合物在如权利要求1-27中任一项所定义的方法中的应用。
37.基本上如此处所描述和/或参照实施例的根据权利要求1-27中任一项所述的方法。
全文摘要
本发明涉及多重扩增的领域。本发明尤其涉及在单次反应中，基于引物和/或探针的不同熔解温度或熔解图谱，检测一份样品中一种或更多种目标(靶)核酸的方法。本发明还提供了用于此类方法的探针和试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102171366SQ200980138727
公开日2011年8月31日 申请日期2009年7月30日 优先权日2008年7月31日
发明者富国良 申请人:奥西泰克有限公司