利用链转移型引物扩增核酸及融合探针的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及核酸扩增，特别是利用链转移（strand Transfer)原理扩增核酸，是可 有效应用于生物医学领域扩增目标核酸的方法及相应的检测方法，具体包括链转移型引物 (Strand Transfer Primer,STP)、链转移引物探针（Strand Transfer Primer&Probe, STPP)的设计方法，目标核酸分子扩增及相应的检测。
【背景技术】
[0002] DNA的合成应用于生物医学各领域。该合成的典型方法有如聚合酶链反应(PCR)。 PCR使用上下游两个寡核巧酸引物和DNA聚合酶来产生双链产物。其中，引物与模板上下游 的目标序列互补杂交，而DNA聚合酶通过添加脱氧核巧Ξ憐酸(dNTPs)来延伸退火引物。用 于RNA模板时，加上逆转录步骤即反转录PCR(RT-PCR)。核酸扩增的终产物可用于体外生物 学操作。为实现特定的应用面，若进行实时检测的需要，已出现巧光定量PCR的解决方法。若 进行核酸分子的突变、连接等，已出现重组PCR的设计方案。若进行整合分子或外侧序列的 鉴定等，已出现Alu-PCR或反向PCR等形式。
[0003] 为避免热循环，已根据聚合酶的特性及引物设计等开发出若干种等溫目标扩增方 法。比如链置换扩增、转录介导扩增、自主序列复制、滚环扩增、环介导等溫核酸扩增等。运 些扩增技术都有一定的局限性。如链置换扩增在扩增长目标序列时效率低，转录介导扩增 和自主序列复制的起始材料仅限于RNA分子，环介导等溫核酸产物呈长短不一的串联体结 构等。
[0004] 经典的PCR扩增等受到祀分子模板祀序列结构、多态性与长度的影响。在扩增复杂 序列结构、多态性较为复杂模板或较长序列模板时，扩增效率不明确的因素很多。尤其是不 易找到适合扩增的上下游匹配引物。本发明鉴于上述事实而提出链转移式引物设计W及用 链转移引物扩增目标核酸W制成核酸检测探针，其目的在于提供补充和改善现有技术的一 种新型的核酸扩增与检测技术。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决上述现有技术中核酸扩增面临的缺陷与问题，目的在于提供一种链 转移型引物的设计及利用链转移型引物扩增目标核酸及制作核酸探针。
[0006] 本发明利用链转移型引物扩增目标核酸的方法的技术方案，其特殊之处在于：
[0007] (a)设计链转移型引物；
[0008] (b)利用DNA聚合酶的核酸酶活性切割所述链转移型引物，经切割后引物形成链转 移，进行目标核酸的扩增；
[0009] 所述目标核酸，从5'末端向3'末端开始依次规定F2区域、F1区域和R1区域，从3'末 端向5'末端开始依次规定F2c区域、Flc区域和Rlc区域，所述区域指寡核巧酸片段，所述F2 与F2c区域，F1与Flc区域，或R1与Rlc区域，指两片段间呈反向互补；
[0010] 所述链转移型引物由R1加上F1片段而成;所述链转移指经上游F3引物介导的片段 延伸至F2区域时，DM聚合酶的外切酶活性切割链转移型引物，使链转移型引物内部的R1片 段转移，结合下游Rlc区域充当反向引物。
[0011] 所述目标核酸来自生物样品中的宿主或病原体核酸。
[0012] 本发明利用链转移型引物融合核酸探针（STPP)其特殊之处在于所述链转移型引 物的3'侧F1设计成巧光探针，使用STPP的方法可用于实时核酸检测。
[0013] 本发明所述链转移型引物或探针可W正向或反向设计，链转移型引物及或探针内 部加入外源序列、人工序列或是碱基修饰，W及多重链转移型引物及或探针。
[0014] 本发明扩增核酸的方法在于：（a)将作为模板的核酸、脱氧核糖核巧酸Ξ憐酸、具 有外切酶反应活性的DNA聚合酶、至少一种链转移引物，制备反应混合液；（b)将所述反应混 合液进行溫度循环，W使DNA聚合酶作用下的互补链延伸W生成反应产物。
[0015] 应用链转移引物比常规的PCR引物提供更多的合成起始位点，使灵敏度增强;能鉴 别序列变异，使特异性增强;可应用于序列信息不明或者较难扩增序列结构的目标核酸。
[0016] 本发明的技术要点在于组合常见DNA聚合酶的外切酶活性，及链转移式引物与探 针的设计，替代传统核酸过程中上游正向、下游反向引物的介导过程。
[0017] 本发明所述链转移型引物，包括任何一种在引物的3'末端或3'-末端侧配置有模 板互补区域、5'末端或5'-末端侧配置有相对于3'端模板下游的互补区域、能在本发明的方 法中用于核酸链延伸、能被外切核酸酶切割、及或链置换效应进行置换的寡核巧酸引物。其 中，3'-末端侧指的是从引物中央到3'末端的部分，5'-末端侧指引物的中央到5'-末端的部 分。即，链转移引物是一种拼接寡核巧酸引物。链转移引物的3'-区为F1，与模板Flc区域互 补;5 ' -区为R1，与下游模板R1片段互补链互补（图1)。
[0018] R1与F1构成链转移引物的基本结构。DNA聚合酶中的外切核酸酶或链置换酶活性 识别，切割或置换该引物处延伸的DNA链（引物延伸链），其作用位点的核糖核巧酸位于R1与 F2的连接处。如当链转移引物中的F1片段与模板退火延伸时，DNA聚合酶作用于与模板核酸 退火的F1片段5'端，经切割产生游离R1片段。R1经链转移后成为下游引物（图2)，继续进行 聚合反应。
[0019] 本发明所用到的链转移引物有R1F1的通用结构，在此结构上的进一步拓展，诸如 链转移引物呈5'^3'正向或3'^5'反向，链转移引物内部加入外源序列（启动子序列、接头 子序列、适配子序列）、人工序列(标签序列)或是碱基修饰、核酸类似物等，均在本发明范围 内。所述的链转移引物可应用于PCR反应或等溫扩增反应等，均在本发明范围内。
[0020] 木发明对使用的链转移引物核巧酸的长度没有特别的限制，只要在3'末端或3'末 端侧及5'末端或5'末端侧均有模板互补序列，可应用于链转移反应。R1或F1的长度推荐约 12个核巧酸~约40个核巧酸。
[0021] 上述链转移引物是本发明的基本结构，此结构已是扩增反应所用引物的充要条 件。为提高扩增效率，可W加入多重链转移引物，如引入2个链转移引物（图3)直至η个链转 移引物(图4)。在此基础结构上增加的引物结构均在本发明范围内。
[0022] 本发明使用的外切核酸酶只要能应用于本发明的方法中，并不限制为具体的某一 种。任何能识别所述的链转移引物进行切割而形成链转移的外切核酸酶均可用于本发明， 比如λ隧菌体核酸外切酶(λ exo)W及Τ7隧菌体基因6核酸外切酶等。常见的DNA聚合酶具有 5 ' ^3 '外切核酸酶活性外切核酸酶活性。
[0023] 本发明所用到的DM聚合酶是指利用DM链作为模板合成新DM链的酶。具有5-3' 外切核酸酶活性的DNA聚合酶可W用于本发明，也可使用同时具备5-3'外切核酸酶活性与 链置换活性的DNA聚合酶。
[0024] 所述链置换活性应用的结果，是在基于模板核酸序列的DNA复制的过程中，置换 DNA链W释放已与模板链退火的互补链。
[0025] 任何具有上述活性的DNA聚合酶可应用于本发明。其例子包括来源于大肠杆菌DNA 聚合酶-I的大片段、水生栖热菌乃1株的化q DNA聚合酶;Thermus thermophilus皿8中的 Tth DNA聚合酶等。
[0026] 本发明扩增目标核酸的方法包括使用具有外切酶活性的DNA聚合酶去进行引物链 转移反应。在该转移反应中，经外切酶切割形成反向引物，转移至模板双链核酸相应互补片 段，经DNA聚合酶催化，合成与该模板互补的引物延伸链（图2)。链转移反应也即指:链转移 引物经具所述DM聚合酶处理，生成与该模板延伸链互补的寡核巧酸片段。在延伸链合成的 过程中，上述寡核巧酸片段不断转移至模板下游，充当引物介导扩增的循环。
[0027] 本发明扩增核酸方法可用于核酸的检测、标记和重组等。
[0028] 本发明核酸扩增方法可使用巧光探针技术进行核酸的实时定量检测。目前已有多 种巧光探针可采用。例如水解(Taqman)探针。运类探针由供体和受体分别标记的DNA寡聚核 巧酸组成。探针被设计为结合到扩增产物的一条链上的特定区域。探针完整时，报告基团发 射的巧光信号被泽灭基团吸收。当扩增时，探针裂解(水解作用)后，报告巧光基团和泽灭巧 光基团分离，可监测巧光信号。图4具体示意链转移引物介导的扩增结合水解探针检测技 术。
[0029 ]本发明也可组合分子信标、巧光能量共振探针、蜗子探针等进行核酸检测。也可采 用非特异染料作为巧光标记。不作为对本发明的限制。
[0030] 本发明同时提供一种链转移型引物与探针融合的检测策略。当F1定义为巧光探针 时，构成新的实时巧光检测体系（图5)。此结构命名为STPP。
[0031] 本发明所述STPP的巧光标记，即共价连接的巧光染料。具体地，巧光标记可W选自 W 下染料：FAM、VIC、肥 D、巧光素、FITC、IRD-700/800、CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、皿X、TET， TAMRA，J0E、R0X，B0DIPY TMR、德克萨斯红、Alexa Fl