用于检测多种呼吸道病毒的pcr引物组、探针组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及用于检测多种呼吸道病毒的PCR引物组、探针组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 呼吸道感染是临床最常见的疾病之一，可由多种病原体引起，其中包括细菌、病 毒、支原体、衣原体等。其中急性呼吸道感染(Acute Respiratory Tract Infection,ARTI) 是世界范围内导致儿童患病和死亡的重要原因。世界卫生组织(WH0)2005年在《柳叶刀》杂 志发表文章报道:在2000-2003年，每年1060万5岁W下死亡儿童中，因传染性疾病死亡占 54%，其中因肺炎死亡的患儿占 19% dARTI的严格定义是所有的呼吸道感染，然而，实际上， 在严重呼吸道疾病中急性下呼吸道占据大多数，占世界范围内学龄前儿童死亡总数的 20%，其中90%为肺炎。大量的证据表明，营养不良、低出生体重、被动吸烟、人工喂养、经济 困难、居住环境拥挤、免疫功能缺陷、HIV感染是严重ARTI的危险因素，因此，大多数因急性 呼吸道感染死亡的病例发生在发展中国家。ARTI主要的致病微生物包括细菌和病毒，还包 括一些非典型病原体，如真菌、支原体、衣原体等，根据临床症状和影像报告临床工作者很 难将它们区分，因此病原分析对于临床诊断和治疗至关重要。
[0003] 传统检测呼吸道病原体的方法主要有培养方法、生化方法和免疫方法等，培养法 操作复杂，检测周期长、费用高，不适合作为临床样品的常规检测。生化检测方法操作简单、 快速，费用低，是目前口诊检验的常规检测方法;但该方法灵敏度和特异性不高，影响因素 多，不能区分病原体的具体种类。免疫检测方法快速简便;但一个检测只能针对其中一种病 原体。
[0004] 随着医疗水平的发展，用上述传统的方法已经不能满足对呼吸道病原体的检测， 临床上需要一种能够灵敏、特异，并且快速、简便的呼吸道多病原体鉴定检测方法，W便能 够更好的做到个体化的治疗、并满足对卫生防疫和疫情控制、进行传染病流行病学研究的 需求。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于提出一种准确、快速、灵敏的用于检测多种呼吸道病毒的 PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂盒。
[0006] 其中，所述PCR引物组包括W下至少两对引物对：
[0007] 由序列表中SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示的两条序列组成的针对甲型流感病 毒的引物对；
[000引由序列表中SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的两条序列组成的针对乙型流感病 毒的引物对；
[0009]由序列表中SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的两条序列组成的针对呼吸道合胞 病毒的引物对；
[0010]由序列表中沈Q ID NO.7和沈Q ID NO.8所示的两条序列组成的针对I型副流感病 毒的引物对；
[0011]由序列表中SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示的两条序列组成的针对II型副流感 病毒的引物对；
[00切由序列表中SEQ ID NO. 11和沈Q ID NO. 12所示的两条序列组成的针对III型副流 感病毒的引物对；
[0013] 由序列表中SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14所示的两条序列组成的针对冠状病毒 的引物对；
[0014] 由序列表中SEQ ID NO. 15和SEQ ID NO. 16所示的两条序列组成的针对C型鼻病毒 的引物对；
[001引由序列表中SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示的两条序列组成的针对人偏肺病 毒的引物对。
[0016] 所述探针组包括W下至少两条分子信标探针：
[0017] 由序列表中SEQ ID NO. 19所示的序列或其反向互补序列组成的针对甲型流感病 毒的分子信标探针；
[0018] 由序列表中SEQ ID NO. 20所示的序列或其反向互补序列组成的针对乙型流感病 毒的分子信标探针；
[0019] 由序列表中SEQ ID NO. 21所示的序列或其反向互补序列组成的针对呼吸道合胞 病毒的分子信标探针；
[0020] 由序列表中SEQ ID NO. 22所示的序列或其反向互补序列组成的针对I型副流感病 毒的分子信标探针；
[0021] 由序列表中SEQ ID NO. 23所示的序列或其反向互补序列组成的针对II型副流感 病毒的分子信标探针；
[0022] 由序列表中SEQ ID NO.24所示的序列或其反向互补序列组成的针对HI型副流感 病毒的分子信标探针；
[0023] 由序列表中SEQ ID NO. 25所示的序列或其反向互补序列组成的针对冠状病毒的 分子信标探针；
[0024] 由序列表中SEQ ID NO. 26所示的序列或其反向互补序列组成的针对C型鼻病毒的 分子信标探针；
[0025] 由序列表中SEQ ID NO. 27所示的序列或其反向互补序列组成的针对人偏肺病毒 的分子信标探针；
[0026] 每一条分子信标探针的两端分别带有巧光基团和泽灭基团。
[0027] 优选地，每一条所述分子信标探针的整体为茎环结构，两端为互补的茎结构，中间 为与对应呼吸道病毒扩增产物特异杂交的环状结构。
[00%]优选地，每一条所述分子信标探针的烙解溫度范围在55°C~80°C，至少两条所述 分子信标探针中若具有相同的巧光基团，则具有相同巧光基团标记的分子信标探针的Tm设 计成一定的梯度，差异在2°C W上。
[00巧]优选地，所述巧光基团选自FAM、HEX和TAMRA，所述泽灭基团为Dabcy 1。
[0030] 其中，所述PCR反应液，包含所述的PCR引物组和对应的所述的探针组
[0031 ]所述的试剂盒包括至少一人份所述的PCR反应液。
[0032] 本发明的有益效果包括：
[0033] 采用本发明的技术方案，可W检测并鉴别多种呼吸道病毒，而且该方法操作简便、 检测准确、灵敏、快速，4小时内可出结果。本发明利用多重RT-PCR巧光分子信标烙解曲线技 术，PCR扩增后直接对产物进行烙解曲线分析，无需开盖分析，可有效避免产物污染;多色巧 光和烙解曲线相结合，保证了检测的足够通量，可进行多种呼吸道病毒的分型检测，应用分 子信标探针技术，检测的特异性高，成本较低，适合在临床大量推广使用。
【附图说明】
[0034] 图1为本发明【具体实施方式】中的甲型流感病毒(Flu-A)、乙型流感病毒(Flu-B)、呼 吸道合胞病毒(RSV)的FAM巧光烙解曲线图；
[0035] 图2为本发明【具体实施方式】中的I型副流感病毒(PIV-I)、II型副流感病毒(PIV-IIKIII型副流感病毒(PIV-III)的肥X巧光烙解曲线图；
[0036] 图3为本发明【具体实施方式】中的冠状病毒(CoV)、C型鼻病毒(皿V-C)、人偏肺病毒 (HMPV)的TAMRA巧光烙解曲线图。
【具体实施方式】
[0037] 本发明设及对多种呼吸道病毒分型检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液及试剂 盒。下面结合【具体实施方式】及附图对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅 仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
[003引根据本发明的实施例，对多种呼吸道病毒检测的PCR引物组、探针组、PCR反应液及 试剂盒将用于W下9种呼吸道病毒中的至少巧巾的分型检测，分别为：甲型流感病毒、乙型流 感病毒、呼吸道合胞病毒、I型副流感病毒、n型副流感病毒、III型副流感病毒、冠状病毒、C 型鼻病毒和人偏肺病毒。
[0039] 在一些实施例中，可W通过RT-PCR扩增待检者的鼻咽拭子呼吸道RNA病毒的保守 基因片段，其中PCR引物序列优选为W下表1中的至少一对：
[0040] 表 1
[0041]
[C
[0043」其中，"r表示上游引物，"R"表示下游引物。
[0044] 在一些实施例中，采用如下9条针对呼吸道病毒的分子信标探针中的至少两条，分 子信标探针的两端分别标记巧光基团和泽灭基团，探针序列如下表2,探针Pl~P9的序列编 号分别为沈Q ID NO. 19~沈Q ID NO.27:
[0045] 表 2
[0046]
L0047J 其中FAM、肥X、TAMRA为巧光基团，D油巧I为浑灭基团。每一余分于信标株针的烙解 溫度范围在55°C~80°C，具有相同的巧光基团的分子信标探针的Tm设计成一定的梯度，即 差异在2°C W上。
[0048] 当然，在其他实施例中，每一条分子信标探针的巧光基团可W相同也可W不同，各 序列对应的巧光基团和泽灭基团不限于上述特定类型，且巧光基团和泽灭基团的位