一种检测人类met基因14外显子剪接突变的引物、探针及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术及临床分子诊断技术领域，设及一种检测人类MET基因14外 显子剪接突变的引物、探针及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各癌症之首，肺癌病例 中80%-85%为非小细胞肺癌（non small cell lung cance;r，NSCLC)。每年全世界有超过 130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。近年来中国肺癌的发病率和病死率均呈 显著升高的趋势，在我国肺癌患者5年的生存率仅为13%，其主要原因是大多数肺癌由于缺 乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，W及与之相匹配科学的治疗方案，从而使患者错 失了治疗的最佳时机。
[0003] 目前，手术、放疗和化疗一直是NS化C的主要治疗方法，然而多数化疗会产生较大 的毒副作用，不同患者间的化疗效果会有较大差异。近年来，随着对肿瘤发病机制及其生物 学行为研究的不断深入，肺癌的分子祀向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床治 疗领域成为研究热点。c-met是一种由c-met原癌基因编码的蛋白产物，为肝细胞生长因子 化epatocytegrowth factor，HGF)的酪氨酸激酶受体，具有酪氨酸激酶活性，其胞内的近膜 区部分由MET基因14号外显子编码，包含重要的调节元素。HGF-MET信号异常激活的主要方 式包括:HGF过表达、MET扩增、MET蛋白过表达W及MET基因突变。目前认为，c-met与多种癌 基因产物和调节蛋白相关，参与细胞信息传导、细胞骨架重排的调控，是细胞增殖、分化和 运动的重要因素。2014年7月，美国癌症基因研究组（The Cancer Genome Atlas,TCGA)在 Nature杂志上发布了 230例可切除肺腺癌的包含DNA，mRNA，miRNA水平的综合基因谱分析结 果，通过对mRNA和DNA高通量测序结果及序列比对分析，发现4 % (10/230)肺腺癌病例的MET 基因 DNA水平第14号外显子剪接区域的突变导致MET EX14在mRNA水平出现部分或完全跳跃 缺失（6^1114-31^99；[]1旨）。在运项发现提出^后的短短1年半时间，科研人员就1616^]114-Skipping发表的的研究已超过10项，有研究发现MET基因14外显子跳跃缺失多发生于非小 细胞肺癌，并W其中的肺肉瘤样癌和腺癌更多见，在肺腺癌中的发生率约3-4%，在肺肉瘤 样癌中的发生率可高达22%。
[0004] MET14外显子剪接突变，与EGFR突变，K-ras突变的不共存现象W及含有该基因患 者的鲜明临床特征，提示该祀点是肺腺癌特异性较高的分子标记物。小分子酪氨酸激酶抑 制剂克挫替尼(Crizotinib)对含有MET基因突变的肺癌患者疗效显著，引起人们的极大兴 趣和研究热情。2016年非小细胞肺癌NCCN(2016 V2)指南中，建议MET基因14外显子剪接突 变患者可选克挫替尼。至此，MEWW制剂克挫替尼的适应症有:ALK重排、MET扩增、ROS-I重 排、MET14外显子剪接突变。
[0005] 目前，MET14外显子剪接突变检测尚没有商品化试剂盒，少数研究机构使用高通量 测序的方法进行全外显子扫描，可W发现是否存在MET14外显子剪接突变，该方法灵敏度 高，可W同时检测几十甚至几百个肿瘤相关基因，但是操作复杂，后期数据处理繁琐，检测 周期长且检测的成本昂贵，对于操作和判读技术的要求很高，临床实际应用中仍存在许多 不足，鉴于W上原因现阶段高通量测序尚无法适用于MET突变阳性NS化C患者的大规模筛查 和诊断。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种检测人类MET基因14外显子剪接突变的引物、探针及试 剂盒。
[0007] 本发明提供一种特异引物对甲，由引物1和引物2组成；
[000引所述引物1为如下(al)或(曰2):
[0009] (al)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
[0010] (a2)将序列3经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有 相同功能的DNA分子；
[00川所述引物2为如下(曰3)或(曰4):
[0012](日3)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
[0013] (a4)将序列4经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有 相同功能的DNA分子。
[0014] 所述特异引物对甲的用途为如下（Cl)或(c2):
[0015] (Cl)制备试剂盒;所述试剂盒的功能为检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基 因14外显子跳跃缺失的突变；
[0016] (c2)检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基因14外显子跳跃缺失的突变。
[0017] 本发明还保护一种引物探针组合甲，由所述特异引物对甲和探针甲组成；
[0018] 所述探针甲的核巧酸序列为如下(bl)或化2):
[0019] (bl)序列表的序列5;
[0020] 化2)与序列5相比进行了一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加。
[0021 ]所述探针甲的一个末端具有巧光报告基团，另一个末端具有巧光泽灭基团。所述 探针甲的5'末端具有巧光报告基团，3'末端具有巧光泽灭基团。所述巧光报告基团具体可 为FAM，所述巧光泽灭基团具体可为B册1。
[0022] 所述引物探针组合甲的用途为如下（Cl)或(c2):
[0023] (Cl)制备试剂盒;所述试剂盒的功能为检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基 因14外显子跳跃缺失的突变；
[0024] (c2)检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基因14外显子跳跃缺失的突变。
[0025] 本发明还保护所述特异引物对甲或所述引物探针组合甲的应用，为如下（Cl)或 (c2)：
[0026] (Cl)制备试剂盒;所述试剂盒的功能为检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基 因14外显子跳跃缺失的突变；
[0027] (c2)检测人基因组DNA中是否发生了引起MET基因14外显子跳跃缺失的突变。本发 明还保护一种试剂盒甲，包括所述特异引物对甲。
[0028] 本发明还保护一种试剂盒甲，包括所述特异引物对甲；所述试剂盒的功能为检测 人基因组DM中是否发生了引起MET基因14外显子跳跃缺失的突变。
[0029] 本发明还保护一种试剂盒乙，包括所述引物探针组合甲；所述试剂盒的功能为检 测人基因组DNA中是否发生了引起MET基因14外显子跳跃缺失的突变。
[0030] 所述试剂盒乙还包括阳性质控质粒;所述阳性质控质粒为如下(dl)或(d2):
[0031] (dl)含有序列表的序列9自5'末端第21-132位核巧酸所示的DNA分子的重组质粒；
[0032] (d2)含有序列表的序列9所示的DNA分子的重组质粒。
[0033] 所述(dl)或(d2)中，所述重组质粒的出发质粒具体可为POJ57载体。
[0034] 所述试剂盒乙还包括引物探针组合乙；所述引物探针组合乙的祀标为人ACTB基 因。
[0035] 所述引物探针组合乙由特异引物对乙和探针乙组成；
[0036] 所述特异引物对乙由引物3和引物4组成；
[0037] 所述引物3为如下(el)或(e2):
[003引 （el)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
[0039] (e2)将序列6经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有 相同功能的DNA分子；
[0040] 所述引物4为如下(e3)或(e4):
[0041] (e3)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
[0042] (e4)将序列7经过一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有 相同功能的DNA分子；
[0043] 所述探针乙的核巧酸序列为如下(e5)或(e6):
[0044] (e5)序列表的序列8;
[0045] (e6)与序列8相比进行了一个或几个核巧酸的取代和/或缺失和/或添加。
[0046] 所述探针乙的一个末端具有巧光报告基团，另一个末端具有